Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

doi: 10.3791/3912 Published: March 25, 2012

Summary

CHIRP är en ny och snabb teknik för att kartlägga genomiska bindningsställen långa icke-kodande RNA (lncRNAs). Metoden drar fördel av specificiteten för anti-sense tiling oligonukleotider för att möjliggöra en uppräkning av lncRNA bundna genomiska webbplatser.

Abstract

Långa icke-kodande RNA är viktiga regulatorer för kromatin staterna i viktiga biologiska processer såsom dosering kompensation, prägling och utvecklande genuttryck 1,2,3,4,5,6,7. Den senaste upptäckten av tusentals lncRNAs i samband med specifika komplex kromatin ändringar, till exempel Polycomb repressiva komplex 2 (PRC2) som förmedlar histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) föreslår breda roller för många lncRNAs i hanteringen kromatin tillstånd i en gen-specifik fashion 8,9. Medan vissa lncRNAs tros arbeta i cis på angränsande gener, andra lncRNAs arbeta i trans för att reglera avlägset belägna gener. Till exempel, Drosophila lncRNAs roX1 och roX2 binder många regioner på X-kromosomen av manliga celler och är avgörande för dosering skadestånd 10,11. Emellertid är de exakta lägena för deras bindningsställen inte känt med hög upplösning. På samma sätt kan människor lncRNA HOTAIR påverkar PRC2 beläggningen på Hundreds av gener genomet hela 3,12,13, men hur specificitet uppnås är oklart. LncRNAs kan också fungera som modulära ställningar att rekrytera montering av flera protein komplex. Den klassiska trans-verkande RNA ställningen är den TERC RNA som tjänar som templat och byggställning för telomeras komplex 14; HOTAIR kan också tjäna som en byggnadsställning för PRC2 och en H3K4 demetylas komplex 13.

Tidigare studier kartläggning RNA beläggning på kromatin har avslöjat stora insikter 15,16, men bara på en enda gen locus åt gången. De beläggning platser i de flesta lncRNAs är inte kända, och de roller lncRNAs i kromatin förordningen har främst härledas från de indirekta effekterna av lncRNA störning. Precis som kromatin immunoprecipitation följt av microarray eller djup sekvensering (chip-chip eller Chip-punkter, respektive) avsevärt har förbättrat vår förståelse av protein-DNA interaktioner på en genomisk nivå, här illustrerar vi en recently publiceras strategi för att kartlägga lång RNA-beläggning Genomvid med hög upplösning 17. Denna metod, Chromatin Isolering av RNA rening (CHIRP) (Figur 1), bygger på affinitetsinfångning av mål lncRNA: kromatin komplex med plattsättning antisense-oligonukleotider, som sedan genererar en karta över genomiska bindningsställen med en upplösning på flera hundra baser med hög känslighet och låg bakgrund. CHIRP är tillämplig på många lncRNAs eftersom utformningen av affinitets-prober är okomplicerad given RNA-sekvensen och kräver ingen kunskap om RNA: s struktur eller funktionella domäner.

Protocol

1. Probutformning

Design anti-sense DNA plattsättning prober för selektiv hämtning av RNA målet med signalen.

  1. Design anti-sense oligo sonder som använder nätet sonden formgivare på singlemoleculefish.com 18.
  2. Använd dessa parametrar: antalet sönder = 1 sond / 100 bp av RNA längd, 2) Mål GC% = 45, 3) Oligonucleotide längd = 20, 4) avstånd längd = 60-80. Bryt RNA i segment om det för lång för konstruktören. Utelämna delar av upprepningar eller omfattande homologi.
  3. Ordningens anti-sens-DNA-sonder med BiotinTEG vid 3-prime änden.
  4. Markörprober enligt deras positioner längs RNA. Separera dem i två pooler så att "även" pool innehåller alla sonder numreringen 2, 4, 6, etc. och "udda" poolen innehåller sonder numrering 1, 3, 5, etc. Späd pool av sönder till 100 iM koncentration och Förvara vid -20 ° C.
  5. Alla experiment som skall utföras med användning avbåde pooler, som fungerar som interna kontroller för varandra. Real RNA-beroende signal skulle finnas från båda pooler, medan prob-specifika ljud skulle vara unik för varje pool. Detta gäller för både CHIRP-qPCR och kvittra-punkter.

2. Harvest celler

Samla celler som kommer att användas för CHIRP experiment.

  1. Odla celler i plattor för vävnadsodling eller kolvar till sammanflytning. Skölj med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) en gång och Trypsinisera. Släck trypsin med> 2x volym media, pipett upp och ner att få bort celler och slamma i enkelcellsuspension. Överför alla medier och suspenderades celler i 50 ml Falcon rör. 20 miljoner celler är typiskt tillräckligt för en CHIRP prov.
  2. Snurra celler vid 800RCF under 4 min. Aspirera medier och återsuspendera 40 miljoner celler i 40 ml PBS, kombinera rör vid behov. Snurra celler vid 800RCF under 4 min. Dekantera PBS försiktigt aspirera på en vinkel kvarvarande vätska.
  3. 3. Cross-link celler och samla cellpelleten

    Tvärbinder samlas celler med glutaraldehyd för att bevara RNA-kromatin interaktioner och förbereda cellpellet.

    1. Utför alla steg vid rumstemperatur.
    2. Framställ 1% glutaraldehyd i rumstemperatur PBS. Framställ 10 ml per 10 miljoner celler (0,4 ml 25% glutaraldehyd lager + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyd måste användas färsk.
    3. Knacka botten Falcon-rör för att avlägsna pellets. Återsuspendera cellpelleten i 1% glutaraldehyd, börjar med en liten volym för att undvika bitar, sedan uppifrån upp till full volym. Vänd för att blanda. Tvärbinda under 10 minuter vid rumstemperatur på en ände-till-ände-skakare eller rotator.
    4. Quencha tvärbindningsreaktionen med 1/10-del volym av 1,25 M glycin vid rumstemperatur under 5 minuter.
    5. Snurra med 2000RCF under 5 min. Aspirera supernatanten och tvätta pelleten med 20 ml kyld PBS gång, spinning vid 2000RCF under 5 min.
    6. Aspirera och resuspendera Wföraskas, tvärbunden pellet med 1 ml kyld PBS per 20 miljoner celler. Överföra varje ml av en Eppendorf-rör och centrifugera vid 2000RCF under 3 min vid 4 C. Avlägsna så mycket PBS som möjligt med pipettspetsen noggrant.
    7. Flash-frysa cellpelletarna i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C tills vidare.

    4. Cellys

    Lyse tvärbundna celler för att förbereda cellysatet.

    1. Tina frysta cellpelleterna vid rumstemperatur. Knacka svårt att lösgöra och blanda cellpelleten. Centrifugera ner pelleten vid 2000RCF under 3 min vid 4 ° C. Använda en skarp 10 mikroliter pipettspets för att avlägsna eventuellt återstående PBS.
    2. På en elektronisk våg (noggrannhet 1 mg) taran massan av en tomt Eppendorf-rör (våra rör väger 1.060 gram väldigt konsekvent). Väg varje pellet och registrera sin vikt. En fullständig 15 cm skål med tvärbunden HeLa-celler väger vanligtvis 100 mg.
    3. Tillägg lyseringsbuffert (10X massa pellets, t.ex. 1 ml för 100 mg) med Fresh proteashämmare, PMSF och Superase-in (se bifogad buffert lista). Blanda väl.
    4. Lägg 10X volymen kompletteras lyseringsbuffert till varje rör och suspendera pelleten. För små pellets <25 mg, resuspendera i 250 kompletteras fil lysbuffert. Suspensionen bör vara släta. Om inte, dela suspensionen i 500 alikvoter och använda en motoriserad pellet mixer för att bryta upp klumpar. Fortsätt omedelbart ultraljudsbehandling.

    5. Sonikering

    Shear DNA genom sonikering tvärbundna cellysat.

    1. Sonikera cellysat i Bioruptor i 15 ml Falcon-rör. Använda <1,5 ml lysat i varje rör, och för snabbare sonikering, sonikera inte mer än två rören vid en tidpunkt.
    2. Sonikera i en 4 ° C vattenbad vid högsta inställningen med 30 sekunder på, 45 sekunder av pulsintervall. Ta lysatet var 30 min. Fortsätta sonikering tills cellysatet inte längre grumlig. Det kan ta så lite som 30 minuter och så många som 4 timmar. Antaletav rör, kommer det att prowolymen, badtemperaturen, och perioden av sonikeringstid påverka hur länge den tar. Rör kommer sannolikt sonikera i olika takt, så slår samman dem tillsammans var 30 min och omfördela till originalskick rör för att säkerställa homogenitet. Obs: glutaraldehyd-tvärbunden cellerna ta betydligt längre tid att sonikera än formaldehyd motsvarigheter.
    3. När lysat blir klar, överföra 5 il lysat till ett nytt Eppendorf-rör. Lägg 90 pl DNA Proteas K (PK) buffert (se buffert lista) och 5 pl PK. Vortex att blanda och spinn ner en kort stund. Inkubera under 45 min vid 50 ° C.
    4. Extrahera DNA med Qiagen PCR rening kit. Eluerar DNA i 30 | il Qiagen elueringsbuffert (EB) och kontrollera DNA-storlek på 1% agarosgel. Om huvuddelen av DNA utstryket är 100-500 bp, är sonikering klar. Om inte, fortsätter att sonikera.
    5. Centrifugera sonikerade proverna vid 16100RCF under 10 min vid 4 ° C. Kombinera supernatanterna och alikvot i 1 ml prover och flash-frysa i flytande nitrogen. Lagra vid -80 ° C.

    6. PIP

    Hybridisera biotinylerade DNA-sonder till RNA och isolera bunden kromatin.

    1. Tina rör av kromatin vid rumstemperatur.
    2. Förbered hybridiseringsbuffert (se buffertlistan, förbereda 2 ml per ml av kromatin). Virvel för att blanda.
    3. För en typisk CHIRP prov med användning av 1 ml lysat, avlägsna 10 | il för RNA INPUT och 10 | il för DNA-input och placera i Eppendorf-rör. Håll på is tills vidare användning.
    4. Överför 1 ml kromatin till 15 ml Falcon rör. Tillsätt 2 ml Buffert Hybridisering till varje rör. För total volym <1,5 ml, använd Eppendorf rör.
    5. Tina prober vid rumstemperatur. NanoDrop sönder för att kontrollera beloppet om du inte har använt den i en lång tid (100 iM sönder bör spec ~ 500-600 ng / l med enda inställning DNA). Tillsätt lämplig volym av prober specifika rören (100 pmol prob per 1 ml kromatin, 1 | il av 100 pmol / | il prob per 1 ml kromatin).Blanda väl. Inkubera vid 37 ° C under 4 timmar med skakning.
    6. Med 20 min kvarstod för hybridisering, framställa de C-1 magnetiska pärlor (lagrad vid 4 ° C). Använda 100 | il per 100 pmol av prober. Tvätta med 1 okompletterat ml lyseringsbuffert tre gånger, med hjälp av DynaMag-2 magnetremsa för att separera pärlor från bufferten.
    7. Återsuspendera pärlor i ursprungliga volymen av lyseringsbuffert och Tillägg med färsk PMSF, PI och Superase-in. Efter 4 h hybridisering reaktionen är fullbordad, tillsätt 100 pl pärlor till varje provrör. Blanda väl. Inkubera vid 37 ° C under 30 min med skakning.
    8. Framställ Tvättbuffert (5 ml per prov). Virvel för att blanda. Pre-varm till 37 ° C. Tillsätt PMSF före användning.
    9. Tvätta pärlorna med 1 ml tvättbuffert fem gånger. På den första tvätten, använd DynaMag-15 magnetisk remsa för att separera pärlor, dekantera och återsuspendera i 1 ml tvättbuffert. Överföra volymen till 1,5 ml Eppendorf-rör. Inkubera vid 37 ° C med skakning under 5 minuter.
    10. Vid efterföljande tvättar, spinn ner varje rör på minicentrifuge, Som prov på DynaMag-2 magnetremsa i 1 min. Dekantera prov, torka några droppar med en Kimwipe, återsuspendera i 1 ml tvättbuffert. Inkubera vid 37 ° C med skakning under 5 minuter. Upprepa för fem totalt tvättar.
    11. Äntligen tvätta, resuspendera pärlorna väl. Ta bort 100 pl och ställ åt sidan för RNA isolering. Reserv 900 pl för DNA-fraktionen. Placera alla rör på DynaMag-2 magnetremsa och ta bort tvättbuffert. Spin alla rör ner kortfattat, placera dem på magnet remsan. Avlägsna den sista biten i tvättbuffert fullständigt med en skarp 10 mikroliter pipettspets.

    7. RNA-isolering

    Utdrag RNA fraktion från chirp prover för att kvantifiera med QRT-PCR.

    1. Ta 100 pl pärla prover och 10 pl RNA insampel. Tillsätt 85 pl RNA PK 7,0 buffert pH till RNA INPUT. Återsuspendera pärlor i 95 pl RNA PK 7,0 buffert pH. Tillsätt 5 pl Proteinease K och inkubera vid 50 ° C under 45 min med ände mot ände skakning.
    2. Kortfattat spinn ner alla rör ochKoka prover för 10 min på värmeblock vid 95 ° C.
    3. Chill prover på is, tillsätt 500 pl TRIzol, skaka kraftigt i 10 sekunder. Inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter. Förvaras vid -80 ° C eller gå vidare till steg 4.
    4. Tillsätt 100 pl kloroform till TRIzol behandlade proverna. Skaka kraftigt i 10 sek. Snurra med 16100RCF på en bordscentrifug under 15 minuter vid 4 ° C.
    5. Ta bort ~ 400 pl vatten supernatanten undvika ekologiska och gränssnitt.
    6. Tillsätt 600 pl (1,5 volym) 100% etanol och blanda väl. Snurra provet genom MIRNeasy minikolonner. Tvätta 1 x med RWT (MIRNeasy Mini Kit), 2x med RPE per tillverkarens protokoll. Eluera med 30 | il nukleas-fritt H2O (NFH 2 O).
    7. Behandla det RNA eluatet med DNA-fri per tillverkarens protokoll. Efter det att reaktionen är fullbordad, upphettas provet under 15 minuter vid 65 ° C för att fullständigt inaktivera eventuellt kvarvarande DNas.
    8. Använd 1 il RNA isolat per bra för QRT-PCR-analys för att bekräfta lncRNAhämtning. GAPDH används ofta som en negativ kontroll.

    8. DNA-isolering

    Extrahera DNA fraktion från chirp prover för att identifiera genom sekvensering eller kvantifiera med qPCR.

    1. Förbered Buffer DNA Elution (se buffert listan), 150 pl per prov, inklusive DNA INPUT.
    2. Tillsätt 1 0μL RNas A (10 mg / ml) och 10 | il RNas H (10 U / pl) per ml av DNA elueringsbuffert och virvelblandades för att blanda.
    3. Ätersuspendera varje prov av pärlor i 150 | il av DNA-elueringsbuffert med RNaser. (Återsuspendera DNA INPUT i 140 | il) Inkubera vid 37 ° C under 30 min med skakning.
    4. Separata pärlor och supernatanten på DynaMag-2 magnetremsa. Avlägsna supernatanten och lägga till märkta rör.
    5. Framställa en andra alikvot av DNA-elueringsbuffert med 10 pl RNas A (10 mg / ml) och RNasH (10 U / ^ il) exakt såsom görs i 8,2). Tillsätt 150 pl till varje prov (inkluderande DNA-input), inkubera och avlägsna supernatanten. Samla alla supernatant (should är ~ 300 | il).
    6. Lägg 15 pl PK till varje prov. Inkubera vid 50 ° C under 45 min med skakning.
    7. Pre-spinn ner gula faslåsning gel rör (5PRIME). Överföring DNA-prov till fas-lås gel rör, och lägga 300 pl PhOH: Kloroform: Isoamyl per prov. Skaka kraftigt i 10 min, och centrifugera ner på en bordscentrifug vid 16100RCF under 5 min vid 4 ° C. Ta vattenhaltig från toppen (~ 300 | il). Tillsätt 3 pl GlycoBlue, 30 | il NaOAc och 900 | il 100% EtOH. Blanda väl och förvaras vid -20 ° C över natten.
    8. Snurra prover vid 16100RCF under 30 min vid 4 ° C.
    9. Dekantera supernatanten försiktigt. Tillsätt 1 ml 70% EtOH och virvel för att blanda. Snurra med 16100RCF under 5 min. Avlägsna supernatanten med pipett. Lufttorka under 1 min. Återsuspendera i 30 | il EB.
    10. DNA-prover är klara för analys av qPCR eller beredning av hög genomströmning sekvensering bibliotek per Illumina protokollet.

    10. Representativa resultat

    Figur 1 Figur 2 visar anrikning av humant telomeras-RNA (TERC) från HeLa-celler under GAPDH, en riklig cellulärt RNA som fungerar som en negativ kontroll. Majoriteten av TERC RNA (~ 88%) som finns i cellen revs genom att utföra kvittra, medan endast 0,46% av GAPDH RNA hämtades, visar en anrikning faktor ~ 200 gånger. Ospecifika prober såsom prober riktade LacZ-RNA, som inte uttrycks i däggdjursceller (fig. 2), kan användas som ytterligare negativa kontroller.

    DNA-regioner som förväntas binda till mål-lncRNA typiskt anrikade över negativa regioner när den mäts med qPCR. Visar qPCR validering av fyra HOTAIR-bundna ställen i primära humana förhudsfibroblaster att vi bestämdes genom att utföra CHIRP-punkter i samma cellinje Figur 3, medan TERC och GAPDH-DNA ställen sigrve som negativa kontroll regioner. Både "även" och "udda" probe sätter gav jämförbara anrikning av förväntade HOTAIR-bundna ställen över negativa regioner, ett kännetecken för äkta lncRNA-bindningsställen.

    Hög kapacitet sekvensering av CHIRP berikat DNA ger en global karta över lncRNA-bindningsställen. Drosophila lncRNA roX2 är känt för att interagera med X-kromosomen på ett sätt som krävs för dosering kompensation. Figur 4 visar roX2 bindningsprofil över en sektion av X-kromosomen. Både "även" och "udda" prover har sekvenserats och deras unika ljud har eliminerats för att producera ett spår av överlappande signaler. Varje "topp" anger här en stark plats roX2 bindande. Den kompletta spår och lista över roX2 målgener har beskrivits i Chu et al. 2011 17.

    Figur 1.
    Figur 1. Flödesschema av CHIRP förfarandet. Kromatin är tvärbunden till lncRNA: proteinaddukter in vivo hybridiseras till målet lncRNA Biotinylerade plattsättning prober, och kromatin komplex renas med användning av magnetiska streptavidinpärlor, följt av stringenta tvättar.. Vi eluera lncRNA bundet DNA eller proteiner med en cocktail av RNas A och H. En förmodad lncRNA bindande sekvens schematiseras i orange. Tidigare publicerad i Chu et al. 2011 17.

    Figur 2.
    Figur 2. Chirp berikar för människor TERC RNA. TERC-asDNA sonder hämta ~ 88% av cellulära TERC RNA och omöjlig att upptäcka GAPDH. LacZ-asDNA prober används som negativa kontroller och hämta varken RNA. Medelvärde + SD visas. Tidigare publicerad i Chu et al. 2011 17.

    Figur 3.
    Figur 3. HOTAIR CHIRP-qPCR i primär människa förEskin fibroblaster. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 och ABCA2 är regioner som interagerar med HOTAIR. TERC och GAPDH tjänade som negativa kontroller. Medelvärde + SD visas. Tidigare publicerad i Chu et al. 2011 17.

    Figur 4.
    Figur 4. CHIRP-artiklar uppgifter om roX2 RNA i SL2 Drosophila celler. "Även" och "udda" sekvensbestämdes separat, sina data samman för att spegla bara vanliga toppar i båda. Den sammanslagna spåret visas. Tidigare publicerad i Chu et al. 2011 17.

Discussion

Här har vi beskrivit CHIRP-punkter, en metod för kartläggning in vivo lncRNA bindningsställen genomet över. De viktigaste parametrarna för att lyckas är de delade poolerna av kakel oligonukleotidprober och glutaraldehyd tvärbindning. Utformningen av affinitets-prober är okomplicerad given RNA-sekvensen och inte kräver någon tidigare kännedom om RNA: s struktur eller funktionella domäner. Vår framgång med roX2, TERC och HOTAIR - tre ganska olika RNA i två arter - tyder på att CHIRP-artiklar är sannolikt generaliserbara för många lncRNAs. Som med alla experiment, är vård och ordentliga kontroller som krävs för att tolka resultaten. Olika lncRNA kan kräva titrering av förutsättningar och förnuftig förändring av villkor, såsom val av olika affinitet prober eller tvärbindningsmedel kan belysa olika aspekter av RNA-kromatin interaktioner. Liksom Chip-punkter, inte alla bindande evenemang nödvändigtvis funktionella, och ytterligare studier krävs för att kontrollera de biologiska konsekvenserna av RNA occupancy på kromatin. Ändå ser vi många intressanta tillämpningar av denna teknik för forskare från andra kromatin-associerade lncRNAs, som nu nummer i tusental 8,9. Precis som Chip-punkter har öppnat dörren för genomet hela utforskning av DNA-protein interaktioner kan CHIRP-Seq studier av "RNA interactome" avslöjar många nya vägar för biologi.

Disclosures

C. Chu och HY Chang anges som uppfinnare om en patentansökan baserad på denna metod.

Acknowledgments

Vi tackar T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, och jag Shestopalov för diskussioner. Stöddes av byrån för vetenskap, teknologi och forskning i Singapore (CC), NIH R01-CA118750 och R01-HG004361 (HYC) och California Institute för regenerativ medicin (HYC). HYC är en tidig karriär Scientist av Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20 °C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Glutaraldehyde (EM grade) Sigma-Aldrich G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer VWR international V8185-904
Protease inhibitor Roche Group 11873580001
PMSF Sigma-Aldrich 78830
Superase-in Ambion AM2696
Bioruptor Diagenode UCD-200
Falcon tubes (for sonication) Corning 430790
Proteinase K Ambion AM2546
PCR purification kit Qiagen 28106
C-1 magnetic beads Invitrogen 65002
PMSF Sigma-Aldrich P7626-25G
DynaMag-15 magnet Invitrogen 123-01D
DynaMag-2 magnet Invitrogen 123-21D
MIRNeasy mini kit Qiagen 217004
Rnase H Epicentre Biotechnologies R0601K
Rnase A Sigma-Aldrich R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy 5 PRIME 2302810
Trizol Invitrogen 15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl Invitrogen 15593-031
Chloroform Ricca RSOC0020-1C
GlycoBlue Ambion AM9515
Glycine JT Baker 4057-06
PBS, pH 7.4 Invitrogen 10010-049
Elution Buffer (EB) Qiagen 19086
20x SSC Invitrogen 15557-036
10% SDS Invitrogen 15553-027
DNA-free Ambion AM1906
Buffer kit Ambion AM9010
Formamide Invitrogen 15515-026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Rinn, J. L. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129, 1311-1323 (2007).
  4. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  5. Kelley, R. L. Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin. Cell. 98, 513-522 (1999).
  6. Pandey, R. R. Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation. Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).
  7. Wang, K. C. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression. Nature. 472, 120-124 (2011).
  8. Khalil, A. M. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).
  9. Zhao, J. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).
  10. Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system. Cell. 88, 445-457 (1997).
  11. Franke, A., Baker, B. S. The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila. Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).
  12. Gupta, R. A. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis. Nature. 464, 1071-1076 (2010).
  13. Tsai, M. C. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science. 329, 689-693 (2010).
  14. Zappulla, D. C., Cech, T. R. RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).
  15. Nagano, T. The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin. Science. 322, 1717-1720 (2008).
  16. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature. 32, 623-626 (2002).
  17. Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions. Mol. Cell. (2011).
  18. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). J. Vis. Exp. (61), e3912, doi:10.3791/3912 (2012).More

Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). J. Vis. Exp. (61), e3912, doi:10.3791/3912 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter