نموذج الفئران من تدريب عضلات بواسطة التنبيه الكهربائي العصبي العضلي

Summary

يوصف نموذج الفئران من التحفيز الكهربائي العصبي العضلي (NMES)، وهي طريقة آمنة وغير مكلفة السريرية، إلى العضلات الأمامية للمقصورة. هذا النموذج في الاستفادة من تعديل جهاز متاحة بسهولة السريرية لغرض انتزاع تقلصات العضلات المستهدفة والمحددة في الفئران.

Abstract

التحفيز الكهربائي العصبي العضلي (NMES) هو أسلوب شائع السريرية التي يتم استخدامها على نطاق واسع لاستعادة ^{1، 2} أو الحفاظ على تعزيز قدرة العضلات وظيفية ^3-5. التنبيه سطح الهيكل العظمي والعضلات ينطوي على تدفق الحالية بين الكاثود والأنود 1، الأمر الذي أدى بالتالي إثارة للوحدة الحركية وألياف العضلات المحيطة بها.

NMES هي طريقة جذابة لتقييم الاستجابات التكيفية العضلات والهيكل العظمي لعدة أسباب. أولا، فإنه يقدم نموذجا للتكرار التجارب التي تم توثيقها جيدا التكيفات الفسيولوجية، مثل تضخما myofiber وتقوية العضلات ^6، الأوعية الدموية ^7-9، إفراز عامل النمو ^9-11، وتنشيط عضلة الخلية السلائف ^12. قد تكون هذه الاستجابات الفسيولوجية معاير بعناية باستخدام معايير مختلفة من التحفيز (للمراجعة كوكرين، انظر ^13). وبالإضافة إلى ذلك، NMES المجندينالوحدات الحركية غير انتقائي، وبطريقة ثابتة مكانيا وزمانيا متزامن ^14، وتقدم ميزة لممارسة تأثير العلاج على جميع الألياف، وبغض النظر عن نوع من الألياف. بالرغم من وجود موانع الاستعمال المحدد لNMES السكان في سريري، بما في ذلك الاضطرابات وريدي محيطي أو خبيثة، على سبيل المثال، NMES آمنة وقابلة للتنفيذ، حتى بالنسبة لأولئك الذين يعانون من سوء و / أو طريح الفراش، وبالنسبة للسكان في أي ممارسة صارم قد يكون أمرا صعبا.

هنا، علينا أن نبرهن على بروتوكول للتكيف مع الأقطاب الكهربائية المتاحة تجاريا وتنفيذ بروتوكول NMES باستخدام نموذج الفئران. هذا نموذج حيواني لديه ميزة الاستفادة من جهاز متوفر سريريا وتقديم ردود الفعل الفورية بشأن المواقع من قطب كهربائي للحصول على تأثير مقلص عضلة المرجوة. لهذا الغرض من هذه المخطوطة، فإننا سوف تصف البروتوكول لتنشيط عضلة من عضلات المقصورة الأمامية من hindlimb الماوس.

Protocol

1. قطب كهربائي التحضير

• قطع (أ) 1 سم x 1 سم من الباب المتجه لوحات الدارات الكهربائية.
• استقرار دبابيس wirewrap 2 باستخدام قبضة الرذيلة، مع دبابيس متباعدة حوالي 3.5 ملم بعيدا. وينبغي أن ينتهي ذات الشعبتين من المسامير يمكن مواجهة.
• ينحني wirewrap دبابيس بزاوية 90 درجة، في منتصف المسافة تقريبا طول امتدادها، وذلك باستخدام كماشة needlenose.
• كشف الأسلاك النحاسية من الروابط، وحوالي 7 سم من الرصاص الصدد، عن طريق تجريد العزل الأسلاك.
• جندى واحد من الأسلاك النحاسية وحتى نهاية ذات الشعبتين واحدة من العلامات wirewrap. كرر الخطوة لحام للدبوس wirewrap الأخرى.
• سحب تنكمش الأنابيب في اتصال ملحوم بين الأسلاك النحاسية ودبابيس ذهبية من أجل عزل وتحقيق الاستقرار. تسخين الأنابيب باستخدام طرف لحام.
• إدراج unsoldered نصائح من المسامير في الفتحات المجاورة wirewrap من لوحة الدارات اللوح.
• تأكد من أن العلامات wirewrap موازية لبعضها البعض وسانتإك من خلال اللوح تلك التي تقع على نصائح على مسافة واحدة عند وضعها من خلال المجلس.
• تضمين نهايات ملحوم من المسامير في الايبوكسي واضح. السماح للالايبوكسي لعلاج لمدة 10 دقائق تقريبا، أو حتى تجف تماما.
• كرر تطبيق الايبوكسي حتى هي جزء لا يتجزأ تماما من المسامير وناقلات لوحات الدارات الكهربائية من أجل توفير السلامة الهيكلية وتخفيف الضغط عن أسلاك من الرصاص.
• الرمال أسفل الايبوكسي باستخدام ملف معدنية لكشف نصائح من المسامير الذهب.
• استخدام المتعدد لضمان يؤدي هما لا قلل كهربائيا وأن أسلاك من الرصاص لها الاستمرارية السليم
• نعلق الكهربائي يؤدي من الجهاز NMES إلى الإناث موصل سلك 2-الطريق (بومونا التصحيح الحبل).

2. حيوان التحضير

• الحيوانات هي تخدير عن طريق الاستنشاق باستخدام isofluorane 2٪ (مختبرات أبوت، شمال شيكاغو، IL) في 100٪ غاز ₂ O. وينبغي أن تظل تخدير الحيوان في جميع أنحاء رانه NMES الدورة.
• قبل البدء في تنفيذ بروتوكول NMES قرصة اصبع القدم للتأكد من أن هذا الحيوان هو تخدير كامل.
• وينبغي فحصها بانتظام للحيوان ردا على التحفيز من أجل ضمان مستوى مخدر يكفي. ينبغي تعديل تخدير حسب الحاجة. ينبغي لجميع حركة غير ذلك من المحطة حفز، والتغيرات في عمق الجهاز التنفسي، ولون الأغشية المخاطية يتم تقييمها بانتظام لرصد عمق التخدير.
• وضع الحيوان في الاستلقاء الجانبي.
• تطبيق مواد التشحيم العيون للعيون من أجل منع جفاف القرنية أثناء العملية.
• حلق منطقة hindlimb أن يعامل، والقضاء مع الكحول.
• مسح القطب مع مبيض 3٪، ثم تشطف بالماء.
• تطبيق طبقة من الهلام إجراء اكثر من موقع حيث سيتم تطبيق الكهربائي. تطبيق عند الضرورة في جميع أنحاء بروتوكول NMES لضمان تدفق التيار الكهربائي بين والجلد.
• حرارة مصباح سوينبغي استخدام آر بطانية المياه المنتشرة على الحفاظ على طبيعي يتراوح الجسم الأساسية.
• ملاحظة: تم استعراض جميع الإجراءات والتي وافق عليها رعاية جامعة بيتسبرغ الحيوان المؤسسية والاستخدام وأداء اللجنة في PHS أكد وAAALAC كثافة العمليات. برنامج معتمد والمرافق.

3. تنبيه

• وضع قطب كهربائي:
  • لتنشيط عضلات المقصورة الأمامية، بما في ذلك الأمامية الظنبوبي والطويلة لأصابع العضلات الباسطة، وضع قطب كهربائي سطح مباشرة على العصب الحيوان إبزيمي العميقة، التي هي فرع البعيدة الخروج من العصب الشظوي المشترك، ويقع الأمامي فقط إلى أن الشظوية الرأس.
  • لتنشيط عضلات المقصورة الأمامية، ويتأكد من وضع القطب الكهربائي عندما التحفيز يثير عطف ظهري كامل الكاحل والإرشاد الكامل للأرقام. من ناحية أخرى، عطف ظهري، في حال عدم وجود أرقام تشير إلى أن التمديد فقط الظنبوبي ما كان عليه سابقاويتم تحفيز العضلات rior. ربما مثل هذه الاستجابة المستهدفة مقلص يكون من المرغوب فيه، اعتمادا على تصميم الدراسة.
  • وينقسم إلى تقلص العضلات 2 مراحل من التحفيز: حر الحركة المرحلة متحدة المركز، والذي يحدث خلال الأولية ~ 0.5 ثانية. خلال هذه المرحلة الأولى، ومخلب ينتقل من موقف إلى الراحة القصوى وعطف ظهري تمديد أرقام. المرحلة الثانية من التحفيز هو انكماش متساوي القياس المطرد في نهاية المدى عطف ظهري والإرشاد أرقام.
• تحفيز المعلمات:
  • هذا النموذج يستخدم NMES 300 PV الكهربائي متعدد الوظائف Empi الجهاز، الذي يوفر 2 قنوات NMES التقليدية (انظر الجدول). لأغراض هذا النموذج، يستخدم فقط 1 قناة.
  • وتشمل المعايير المستخدمة متماثل الموجي، ومدة النبضة إلى 150 ميكرو ثانية ومعدل تكرار 50HZ. تم تعيين وقت تنبيه إلى 5 ثوان، وذلك بنسبة 0.5 التعلية الثانية ومنحدر 0.5 ثانية إلى أسفل. وهذا سوف يسمح للعضلة إلى أكثر تدريجيا accliلم إلى التحفيز. في البروتوكول الحالي، من وقت في ما بين الانقباضات كان من المقرر ان 10 ثانية، ولكن يمكن تعديل هذا يتوقف على النتيجة المرجوة. وانخفضت من الأوقات يؤدي إلى بدء أسرع من العضلات والارهاق. واستندت هذه المعايير التحفيز على البروتوكولات السريرية المصممة لتعزيز قوة العضلات باستخدام التنبيه الكهربائي العضلي العصبي، من دون إحداث أضرار كبيرة في العضلات والهيكل العظمي ^{1، 15، 16.}
  • الفئران إكمال مجموعتين من 10 تقلصات، مع فترة راحة لمدة 5 دقائق في ما بين مجموعات.
  • بالنسبة للحيوانات الكبار، ويبدأ عادة NMES كثافة في 9 مللي أمبير. من تجربتنا، وهذا هو تقريبي لكثافة القصوى البداية التي لا تحفز على ضعف مشية ملحوظا فورا بعد التحفيز. بالنسبة للدورات NMES لاحقة، وتزداد كثافة من 1 مللي أمبير في كل مرة من الحيوانات قادرة على إكمال 20 dorsiflexions كامل.
• بعد الانتهاء من بروتوكول التحفيز وريكوجدا من التخدير، والحيوانات تظهر عادة مشية طبيعية والموقف. وينبغي عدم المساس مشية طوال مدة البرنامج NMES.

4. ممثل النتائج

تم تنفيذ بروتوكول NMES الموضحة في هذه المقالة في سلالات الفئران عدة، بما في ذلك: نوع وايلد (B6/10)، وB6.SCID MDX / الفئران SCID. نتائج ممثل NMES أجرى أكثر من 4 أسابيع (20 دورات) في 3-5 الشهر القديمة وتعرض MDX / SCID.

والموت الرحيم إنسانية الحيوانات عن طريق التفكك عنق الرحم في حين تحت التخدير. وكان حصاد عضلة الظنبوبي الأمامي وتجميدها على الفور في C. 2 ميثيل البيوتان مسبقا تبرد في النتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة وقد تم الحصول على المسلسل المقاطع العرضية (10 ميكرون)، والتي شنت على الشرائح. وأجريت التحليلات الإحصائية باستخدام معيار حزم البرامج الإحصائية (SPSS، v19.0 البرمجيات). أولا، تم استخدام اختبار ليفين لتقييم ما إذا كانت هناك واق المساواة بين الفروق. وقد أجريت بعد ذلك عينات المستقلة اختبار t للتحقيق في الخلافات بين NMES ومجموعات التحكم.

وأجريت هيماتوكسيلين ويوزين (H & E) البقع للتحقيق في ما اذا كان البروتوكول NMES من شأنه أن يؤدي إلى الإصابة ازداد في عضلة التصنع. وقد تم اختيار قسم واحد، وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر الضوء (نيكون الكسوف E800، نيكون، واليابان). احصي يدويا العدد الكلي للألياف، وعدد من الألياف مع نوى موقعا مركزيا باستخدام المعاهد الوطنية للصحة (NIH) - وضعت برامج تحليل الصور، صورة J. لم يكن هناك زيادة كبيرة في مؤشر التجدد (عدد الألياف الأنوية مركزيا / العدد الكلي للألياف) في الحيوانات التي قدمت إلى NMES، بالمقارنة مع الضوابط (P = 0.802، الشكل 1). هذا يشير إلى أن تطبيق NMES لا يزيد من تتالي انحطاط، تجديد لوحظ في الحيوانات التصنع، وبالتالي فهو لا يحتمليجب حمل اصابة في العضلات المتزايد.

تم تنفيذ تلطيخ مناعي لCD31 للتحقيق في تأثير بروتوكول NMES التي تستمر 4 أسابيع على الأوعية الدموية في العضلات. لفترة وجيزة، تم إصلاح أجزاء عضلة في 4٪ من الفورمالين، ومنعت استخدام 5٪ مصل الحصان (HS). وحضنت المقاطع مع الأجسام المضادة لمكافحة فأر فأر الابتدائي (1:300 في تخفيف HS 5٪) وتعامل مع الأجسام المضادة 555 المسمى مكافحة فأر عنزة الثانوية (1:300 في تخفيف HS 5٪). لتحديد العدد الكلي للخلايا CD31 إيجابي، وقد تم اختيار قسم واحد، وتصويرها باستخدام المجهر فلوري (نيكون الكسوف E800، اليابان). وقد عدها يدويا إجمالي عدد الشعيرات الدموية باستخدام الشمالية الكسوف البرمجيات (Empix التصوير شركة). كانت هناك زيادة كبيرة في عدد من خلايا CD31 إيجابي في الحيوانات التي قدمت إلى NMES بالمقارنة مع الضوابط (P <0.01، الشكل 2)، مشيرا الى ان بروتوكول NMES صفها بأنها تشجع على الهيكل العظمي الأوعية الدموية في العضلات.

في الموضع اختبار مقلص: بعد أربعة أسابيع من الانتهاء من وضع بروتوكول NMES فقد تم اختبار مقلص للعضلات المقصورة الأمامية باستخدام جهاز الفحص في الوضع الطبيعي (الموديل 809B، أورورا العلمي المؤتمر الوطني العراقي، كندا)، ومشجعا على (النموذج 701C، أورورا العلمية خفيفة وكندا)، وقوة محول (أورورا العلمي المؤتمر الوطني العراقي، كندا). لفترة وجيزة، تم عزل العصب الشظوي تخدير الحيوانات من خلال شق صغير الوحشي في الركبة. ثم وضعت الفئران مستلق على منصة وكان وضعه القدم التي يجري اختبارها على الصفيحة القدمية. وقد استقر hindlimb لإجراء تجارب مع شريط من القماش على الركبة والقدم. وقد حفزت العضلات باستخدام أقطاب هوك إدراجها تحت الجلد. تم اختبار عضلة تقلص تكززي على تردد 150Hz ل350ms للتحقيق في ما اذا كان البروتوكول NMES التي تستمر 4 أسابيع قد يحفز تحسن في قوة العضلات. وتم تطبيع النتائج لوزن العضلات رطبة. كانت هناك زيادة بنسبة 30٪ تقريبا في الكزازIC تقلص من الحيوانات التي قدمت إلى NMES، بالمقارنة مع الضوابط (P = 0.005) (الشكل 3)، مما يدل على بروتوكول وصف يحسن قوة العضلات الهيكلية في MDX / SCID الحيوانات.

. الشكل 1 هيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ العضلات والهيكل العظمي من التصنع (MDX) / الفئران العوز المناعي (4-5 أشهر) (التكبير 10x): أ الضوابط) غير المعالجة، B) بعد 4 أسابيع من NMES.

الشكل 2. CD31 المناعي (الحمراء)، كعلامة من الأوعية الدموية الهيكل العظمي والعضلات، في العضلات والهيكل العظمي من التصنع (MDX) / الفئران العوز المناعي (4-5 أشهر) (20x والتكبير) أ) رقابة علاجية، B) بعد 4 أسابيع من NMES.

الشكل 3. اختبار مقلصمن العضلات مقصورة الأمامية في السيطرة والحيوانات تعامل مع NMES لمدة 4 أسابيع. MNM = ملي متر نيوتن. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

هذه النتائج تشير الى ان نموذجنا الفئران المتقدمة من NMES يعزز الهيكل العظمي والعضلات الأوعية الدموية (الشكل 2) وتعزيز (الشكل 3)، ولكن لا يسبب الضرر الهيكل العظمي والعضلات (الشكل 1).

وتجدر الإشارة إلى أنه تم تصميم المعلمات التحفيز وصفها هنا للحث على عضلة الحمولة الزائدة للعضلات مقصورة الأمامية. تماما كما هو الحال بالنسبة لسيناريوهات السريرية، يمكن تعديل وضع قطب كهربائي لتنشيط المجموعات العضلية الأخرى، على الرغم من استجابة العضلات لNMES قد تكون مختلفة، اعتمادا على تكوين نوع من الألياف. يجوز تعديل NMES مدة، إجمالي عدد جلسات العلاج، وعدد من حالات التكرار وفقا لدراسة تصميم.

كما هو الحال مع أي بروتوكول، وهذه الطريقة والقيود التي ينبغي أن يلاحظ. في هذه الدراسة، تم تنفيذ أكثر من تحفيز العصب الشظوي العميق. ومع ذلك، في العيادة، والتحفيز أناق تديرها عادة في وحدة المحرك. في نموذج حيواني، وتحفيز العصب تتطلب أقل كثافة من أجل انتزاع كامل تقلص العضلات. آخر حصر للنموذج كما قدم هو أننا غير قادرين على الحصول على المعلومات على مستوى الراحة أثناء بشأن تطبيق NMES، بالنظر إلى أن الحيوانات هي تخدير. ولذلك، فإن التحمل من شدة مماثلة في عدد السكان السريرية ومن الصعب تقدير. ومع ذلك، تشير نتائجنا النسيجية لدينا NMES النموذج، كما وصفها، لا يسبب اصابة في العضلات.

تطوير نماذج الحيوانات التي تحاكي أساليب تنفيذها عادة في عيادة توفر لنا أدوات مختبر مفيد يسمح لتحسين فهم الاستجابات الخلوية والجزيئية لتدخلات العلاج. وبالإضافة إلى ذلك، مثل هذه النماذج مفيدة لإجراء دراسات ما قبل السريرية على حد سواء لصقل البروتوكولات إعادة التأهيل القائمة ووضع مؤشرات جديدة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vector wire wrap posts with bifurcated solder terminal	Newark Inc	T68
Vector circuit board	Newark Inc	3662-2
Pomona patch cord	Newark Inc	P-36-0
5 minute epoxy	VO Baker Co.	4001
Spectra 360 Electrode Gel	Milliken Medical	MR41217
Portable neuromuscular stimulation device	EMPI	300pv