一个小鼠模型，通过神经肌肉电刺激肌肉训练

Summary

小鼠模型的神经肌肉电刺激（NMES），临床安全和廉价的方式，车厢前部肌肉被描述。这种模式有针对性和具体的肌肉收缩引发小鼠的目的修改一个现成的临床设备的优势。

Abstract

神经肌肉电刺激（NMES）是临床上常见的方式，被广泛用于恢复，保持或提高^3-5肌功能的能力。皮的表面刺激骨骼肌涉及阴极和阳极之间的电流流动，从而引起电机的单位和周围的肌肉纤维的兴奋。

神经肌肉电刺激是一个有吸引力的方式来评估骨骼肌的适应性反应，有以下几个原因。首先，它提供了一个可重复的实验模型，是有据可查的生理适应，如肌纤维hypertophy和⁶加强肌肉，血管生成^7-9，9-11生长因子的分泌和肌肉前体细胞活化^12。这种生理反应，可仔细滴定使用不同的刺激参数（Cochrane回顾，见^13）。此外，NMES新兵运动单位的非选择性，在一个固定的空间和时间同步的方式^14，提供所有纤维的治疗效果发挥优势，无论纤维类型。虽然也有特定的禁忌症，在临床的人口，包括周边静脉疾病或恶性肿瘤，神经肌肉电刺激，例如，神经肌肉电刺激是安全和可行的，甚至为那些生病和/或长期卧床和严格锻炼可具有挑战性的人群。

在这里，我们展示市售电极适应和利用小鼠模型进行神经肌肉电刺激协议的协议。这种动物模型利用临床上​​可用的设备，并提供即时反馈电极引出所需的肌肉收缩作用的定位优势。本手稿的目的，我们将描述为鼠标后肢前车厢肌肉刺激肌肉的协议。

Protocol

1。电极的制备

• 切载体电路板1厘米×1厘米一节。
• 稳定2 wirewrap引脚副把手，使用间隔约3.5毫米外销。引脚岔完应朝上。
• 弯曲在90°角wirewrap针，约一半沿其长度，使用needlenose钳子。
• 揭露连接器，导线连接约7厘米，剥电线绝缘的铜线。
• 锡铜线之一wirewrap引脚岔。重复为其他wirewrap引脚焊接一步。
• 拉收缩铜线和金销之间的焊接连接管，以隔离和稳定。使用烙铁头加热管。
• 插入相邻线路板电路板开口的wirewrap引脚unsoldered提示。
• 确保了wirewrap引脚是相互平行和STICK提示位于相同的距离，通过放置在电路板时，通过线路板等。
• 嵌入在清晰环氧树脂的引脚焊完。允许环氧树脂固化约10分钟，或直至完全干燥。
• 重复直到载体的引脚和电路板，以提供结构完整性和导线应变消除完全嵌入环氧树脂应用。
• 沙下环氧树脂使用一个金属文件揭露黄金引脚的提示。
• 用万用表的两根导线，以确保电气短路和导线有适当的连续性
• 将电极从神经肌肉电刺激装置，导致女性2路电线连接器（波莫纳跳线）。

2。动物的制备

• 动物是通过2的％isofluorane（雅培，北芝加哥，IL）使用100％的O ₂气体吸入麻醉。动物应保持整个ţ麻醉他NMES会议。
• 在开始之前，神经肌肉电刺激协议执行脚趾捏，以确保该动物是完全麻醉。
• 动物应定期检查，以确保麻醉的水平是足够的刺激。麻醉应根据需要进行调整。运动刺激的腿，呼吸深度的变化，和粘膜的颜色都应该定期评估监测麻醉深度。
• 放置侧卧动物。
• 适用于眼科润滑剂在手术过程中，以防止角膜干燥的眼睛。
• 刮胡子后肢区域来对待，用酒精擦拭。
• 用3％漂白粉擦拭电极，然后用清水冲洗干净。
• 应用层进行了电极将应用于网站的凝胶。必要再涂整个神经肌肉电刺激协议，以确保电极与皮肤之间的电流流动。
• 一个热灯Øŕ应使用循环水毯，以维持正常的身体核心范围。
• 注：由美国匹兹堡大学制度的动物护理和使用委员会已审查和批准的所有程序，在保证小灵通和AAALAC认证诠释演出。认可的程序和设施。

3。刺激

• 电极的位置：
  • 前车厢的肌肉，包括在胫骨前和，伸趾长肌的肌肉刺激，将直接通过动物的深腓骨神经，1远端分支腓总神经断的表面电极，是位于只是前了腓骨头。
  • 前室肌肉的刺激，放置电极确认时刺激引起全踝关节背屈和数字扩展。另一方面，背屈位分机的情况下，建议只胫事前rior肌肉受到刺激。这种有针对性的收缩反应，可能是可取的，这取决于研究设计。
  • 肌肉收缩分为2个阶段的刺激：一个自由的移动，同心阶段，在最初的发生〜0.5秒。在第一阶段，爪子移动到最大背屈位分机从静止位置。第二阶段的刺激是在结束范围背屈位分机持续等长收缩。
• 刺激参数：
  • 神经肌肉电刺激模式采用300光伏EMPI多功能电疗设备，它提供了传统的神经肌肉电刺激2通道（见表）。对于这种模式的目的，只有1个通道。
  • 使用的参数包括对称波形，150μs的脉冲持续时间和频率为50Hz。刺激的时间设置为5秒，0.5秒的上升和0.5秒的斜坡下降。这将使肌肉逐渐accli队友来刺激。在目前的协议，关闭之间的收缩时间设置为10秒，但是这取决于预期的效果可能会有所调整。减少关闭时间将导致更快速的启动了肌肉疲劳。这些刺激参数，根据临床方案设计，以提高使用神经肌肉电刺激肌肉力量，不引起显着的骨骼肌损伤^{1，15，16。}
  • 小鼠完成两套10收缩，在5分钟的休息间套。
  • 对于成年动物，神经肌肉电刺激强度通常始于9毫安。从我们的经验，这是接近最大强度不引起明显的步态障碍，紧随刺激。为会议后续神经肌肉电刺激，强度增加1 mA的动物是能够完成20个完整的dorsiflexions每次。
• 刺激协议和RECO完成后非常麻醉，动物通常表现出正常的步态和姿势。步态应该继续受到损害整个神经肌肉电刺激计划的持续时间。

4。代表结果

已实施几个小鼠品系，包括：野生型（B6/10），B6.SCID和MDX / SCID小鼠神经肌肉电刺激在这篇文章中描述的协议。 MDX / SCID的老代表进行了4周（20届）在3-5个月的神经肌肉电刺激结果提出。

动物人道安乐死，而麻醉下颈椎脱位。胫骨前肌收获，并立即冻结在2甲基丁烷在液氮预冷，并保存在-80°C。串行的横截面（10微米），获得并安装到幻灯片。使用标准的统计软件包（SPSS软件，v19.0软件）进行统计分析。首先，列文的测试是用来评估是否有WA差异的平等。独立样本t检验，然后进行探讨神经肌肉电刺激组和对照组之间的差异。

苏木精伊红（H＆E）的污渍进行了探讨神经肌肉电刺激的协议是否会导致营养不良肌肉损伤增加。选择一节，并获得了使用光学显微镜（日本）;尼康，尼康的Eclipse E800的图片。手工计算，使用国立卫生研究院（NIH） - 开发的图像分析软件，图像J.再生指数没有显着增加（中央核纤维纤维和位于市中心的核纤维数量总数/总数在提交给神经肌肉电刺激动物纤维），较对照组（P = 0.802; 图1）。这表明，神经肌肉电刺激的应用不会增加在营养不良的动物中观察到的变性再生级联，因此不可能被诱导增加​​肌肉损伤。

CD31的免疫染色进行探讨肌肉血管的4周神经肌肉电刺激协议的影响。简言之，肌肉部分被固定在4％福尔马林和阻止使用5％马血清（HS）目录。部分培养与鼠抗鼠抗体（1:300稀释于5％HS）和555标记的羊抗鼠二抗（1:300稀释于5％HS）治疗。量化的CD31阳性细胞总数，一节被选中，并拍下使用荧光显微镜（日本尼康的Eclipse E800的）。毛细血管的总人数是手动计算使用北Eclipse软件（Empix影像公司）。有一个在提交给神经肌肉电刺激动物的CD31阳性细胞数量显着增加，比对照组（P <0.01，图2）时，表明，神经肌肉电刺激协议描述促进骨骼肌血管生成。

在原位收缩测试：四个星期的神经肌肉电刺激协议完成后，车厢前部肌肉收缩测试使用原位测试仪器（型号809B，极光科技公司，加拿大），刺激（型号701C，极光科技有限公司，加拿大），力传感器（极光科技公司，加拿大）。简言之，通过一个小切口膝外侧腓总神经的麻醉动物分离。小鼠仰卧，然后放置在一个平台上，脚被测试踏板的位置上。膝盖和脚用布带用于测试后肢稳定。使用钩插入皮下的电极刺激肌肉。肌肉强直收缩，在150Hz频率为350MS测试调查4周神经肌肉电刺激的协议是否会诱发肌肉力量改善。结果正常化湿肌肉的重量。约30％的增幅在tetanIC提交给神经肌肉电刺激动物的收缩时，比对照组（P = 0.005）（ 图3），表明所述的协议，提高了MDX / SCID的动物骨骼肌肉力量。

图1苏木精和曙红营养不良骨骼肌染色（MDX）/免疫缺陷小鼠（4-5月）（10倍放大）：一）未经处理的控制，二）经过4周的神经肌肉电刺激。

图2。4周后，CD31的免疫（红色），作为骨骼肌血管标记，在营养不良的骨骼肌（MDX）/免疫缺陷小鼠（4-5月）（20倍放大）一）未经处理的控制，二）神经肌肉电刺激。

收缩测试图3。在控制前车厢肌肉和4周神经肌肉电刺激治疗的动物。 MNM =毫牛顿米。 点击这里查看大图 。

Discussion

这些结果表明，我们发达的小鼠模型的神经肌肉电刺激促进骨骼肌血管生成（ 图2）和加强（ 图3），但不引起骨骼肌肉损伤（ 图1）。

应当指出的是，这里所描述的刺激参数已超载车厢前部肌肉引起肌肉。就像是为临床情景的情况下，电极位置可能会有所调整，以刺激其他肌肉群，虽然肌肉到神经肌肉电刺激的反应可能会有所不同，取决于纤维类型组成。根据研究设计，神经肌肉电刺激的持续时间，疗程的总人数，以及重复的总数可能会修改。

这种方法有任何协议，应注意限制。在本研究中，进行深腓骨神经刺激。然而，在诊所，刺激我小号通常在电机单位管理。在动物模型，对神经的刺激将需要较低的强度，以引起全肌肉收缩。作为提出的模型的另一个限制是，我们无法获得有关的舒适程度，在神经肌肉电刺激的应用，给动物麻醉。因此，在临床人口可比强度的耐受性是难以估量。然而，我们的组织学研究结果表明我们的神经肌肉电刺激模型，描述的那样，不会引起肌肉损伤。

动物模型，模拟通常在门诊实施的方式提供有用的实验工具，可以更好地了解细胞和分子反应治疗干预的发展。此外，这种模式是有用的，要进行临床前研究，同时完善现有的康复协议，并开发新的迹象。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vector wire wrap posts with bifurcated solder terminal	Newark Inc	T68
Vector circuit board	Newark Inc	3662-2
Pomona patch cord	Newark Inc	P-36-0
5 minute epoxy	VO Baker Co.	4001
Spectra 360 Electrode Gel	Milliken Medical	MR41217
Portable neuromuscular stimulation device	EMPI	300pv