Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Summary

Wij beschrijven een gemodificeerd hot waterige fenol extractie werkwijze voor het zuiveren lipopolysaccharide (LPS) van Gram-negatieve bacteriën. Afgetapt kan de LPS vervolgens geanalyseerd door SDS-PAGE en gevisualiseerd door directe kleuring of Western immunoblot.

Abstract

Lipopolysaccharide (LPS) is een belangrijk onderdeel van Gram-negatieve bacteriën buitenste membranen. Het is een drieledige molecuul dat uit lipide A, die ingebed is in de buitenste membraan, een kern oligosaccharide en het herhalen O-antigeen eenheden die buiten uitstrekken vanaf het oppervlak van de cel ^{1, 2.} LPS is een immunodominante molecule die belangrijk is voor de virulentie en Pathogenese van vele soorten bacteriën, zoals Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, en Escherichia coli ^3-5, en verschillen in LPS O-antigen samenstelling vormen de basis voor serotypering stammen. LPS is betrokken bij de gehechtheid aan gastheercellen aan het begin van de infectie en biedt bescherming tegen complement-gemedieerde doden; stammen die LPS missen kunnen worden verminderd voor de virulentie ^6-8. Daarom is het belangrijk om LPS te visualiseren name van klinische isolaten. Het visualiseren van LPS banding patronen en erkenning door middel van specifieke eenntibodies kan nuttig zijn hulpmiddelen om stam lijnen te identificeren en om de verschillende mutanten te karakteriseren.

In dit verslag beschrijven we een hete waterige fenol werkwijze voor de isolatie en zuivering van LPS van Gram-negatieve bacteriële cellen. Dit protocol kan de extractie van LPS afstand van nucleïnezuren en eiwitten die interfereren met visualisatie van LPS dat optreedt bij kortere minder intensieve winningsmethoden ^9. LPS deze wijze bereid kunnen worden gescheiden natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) en direct gekleurd met koolhydraten / glycoproteïne vlekken of standaard zilverkleuring methoden. Veel anti-sera aan LPS bevatten antilichamen die kruisreageren met buitenste membraan eiwitten of andere antigene doelen die kunnen hinderen reactiviteit waargenomen na West-immunoblot van SDS-PAGE gescheiden ruwe cellysaten. Protease behandeling van ruwe cellysaten alleen is niet altijd een effectieve manier van verwijderen van dezeachtergrond met behulp van deze of andere visualisatie methoden. Verder kan uitgebreid protease behandeling in een poging om deze achtergrond verwijderen tot slechte kwaliteit LPS dat niet goed is opgelost door elk van de bovengenoemde methoden. Om deze redenen zijn wij van mening dat de volgende protocol, aangepast van Westpahl en Jann ^10, is ideaal voor LPS extractie.

Protocol

1. Voorbereiding van bacteriën voor LPS Extraction

1. Start een nacht cultuur in 5 ml Luria Broth (LB), aangevuld met antibiotica indien nodig. Groei cultuur overnacht (12-18 uur) in een schudincubator bij 37 ° C en 200 rpm.
2. Verdun de cultuur 1:10 met LB en neem een OD ₆₀₀ lezing in een spectrofotometer. Op basis van de OD ₆₀₀ lezen, maak dan een 1,5 ml schorsing van uw bacteriën om een OD ₆₀₀ van 0,5.
3. Pellet de bacteriën in een microcentrifuge bij 10.600 x g gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof. De pellet kan worden opgeslagen bij -20 ° C, indien LPS niet zal onmiddellijk geëxtraheerd.

2. Extractie van LPS

1. In de eerste plaats voor te bereiden 2x SDS buffer. Een 50 ml oplossing van 4% β-mercaptoethanol (BME), 4% SDS en 20% glycerol in 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Voeg een snufje broomfenolblauw om de oplossing te verven. Maak een 1x SDS-buffer voorraad door te verdunnen 2X stock 1:1 in steriel gedistilleerd H ₂ O. Dit kan bij kamertemperatuur bewaard.
2. Merk drie afzonderlijke 10 mg / ml oplossing van DNase I, RNase en Proteinase K in steriel gedestilleerd _H2O
3. Resuspenderen de gepelleteerde bacteriën stap 1,3 in 200 ul 1 x SDS-buffer. Zorg ervoor dat de pellet volledig geresuspendeerd door pipetteren de oplossing op en neer te langzaam. Doe niet vortex.
4. Kook de gesuspendeerde bacteriën in een waterbad gedurende 15 minuten. Laat de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten afkoelen.
5. Voeg 5 pi van zowel DNase I en RNase bereide 2.2. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 30 minuten. * Deze stap is optioneel, er nauwelijks verschil in de kwaliteit van LPS tussen nuclease behandeld en onbehandeld monsters.
6. Voeg 10 ul van de Proteinase K bereid in 2.2. Incubeer de monsters bij 59 ° C gedurende 3 uur. Deze stap kan 's nachts worden uitgevoerd, als er tijdsdruk.
7. Voor elk monster, add 200 ul ijskoude Tris-verzadigde fenol (water verzadigde fenol kunnen worden gebruikt als vervanging of Tris-verzadigde fenol niet beschikbaar is). Controleer de doppen op de buizen stevig gesloten en vortex elk monster gedurende 5 tot 10 seconden.
8. Incubeer de monsters bij 65 ° C gedurende 15 minuten, toe te vortexen. Na incubatie afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens 1 ml kamertemperatuur diethylether aan elk monster en vortex 5 tot 10 seconden. Zorg ervoor dat u handvat ether uit te voeren in een zuurkast, want het is vluchtig.
9. Centrifugeer de monsters 20600 x g gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de monsters uit de centrifuge en haal de onderste blauwe laag. Zorg ervoor dat de bovenste, heldere laag te voorkomen. Achterlating van een kleine hoeveelheid van de blauwe laag voorkeur besmetting met de bovenste laag.
10. Opnieuw uit te pakken de monsters door het herhalen van de stappen 2.7 - 2.9. Twee extracties meestal voldoende. Als de monsters lijkt troebel, kan meer extracties worden de presenced. Voeg 200 ul 2x SDS-buffer aan elk van de geëxtraheerde monsters voor scheiden door SDS-PAGE. Monsters kunnen worden uitgevoerd op 8% -15% SDS-polyacrylamide gels. Vijf tot vijftien ul van LPS opgesteld op basis van deze methode is meestal voldoende voor visualisatie.

3. Representatieve resultaten

LPS monsters bereid zoals hierboven gevisualiseerd door aankleuring direct volgend scheiding op SDS-PAGE met een standaard zilver kleuringsprotocol of een commercieel verkrijgbare kit LPS kleuring. Als alternatief kan LPS gescheiden op een polyacrylamide gel worden overgebracht naar een nitrocellulose membraan onderworpen aan Western immunoblotting met LPS-specifieke antisera. Voor dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit (Molecular Probes), en volgde de instructies van de fabrikant.

In figuur 1 is een Pro-Q Emerald 300 gekleurde 12% SDS-polyacrylamidegel. Elke baan bevat 15 pi LPS bereid uit diflende stammen van Burkholderia dolosa geïsoleerd uit sputum monsters van cystic fibrosis patiënten. Verschillende LPS strepen ladder patronen reflecterende verschillende getallen O-antigen herhalende eenheden aan kern oligosaccharide, zijn duidelijk deze methode, bijvoorbeeld monsters in laan 1 en 6 hebben soortgelijke bandenpatronen elkaar (doos in rood).

Figuur 1. Pro-Q Emerald 300 gekleurde LPS van Burkholderia dolosa klinische isolaten. LPS zeven B. dolosa stammen van een uitbraak bij cystic fibrosis patiënten werden geïsoleerd zoals beschreven in dit protocol. Vijftien ul werden gescheiden op een 12% SDS-polyacrylamidegel en gekleurd met Pro-Q Emerald 300 volgens de instructies van de fabrikant. LPS kern is aangegeven een pijl, en LPS met soortgelijke strepen patronen van O-antigeen herhalingen zijn verpakt in rood. M = molecuulmassa marker.

Discussion

Wij hebben een werkwijze beschreven voor het zuiveren van LPS afstand van andere cellulaire componenten, zoals nucleïnezuren en eiwitten. Deze methode levert hoogwaardige LPS die gebruikt kunnen worden in verschillende gebruikelijke methoden, zoals koolhydraten kleuring van SDS-PAGE gels, zoals weergegeven in figuur 1. Deze methode kan worden gebruikt om LPS serotype van verschillende stammen, met specifieke antisera, of verwantschap tonen tussen isolaten door directe visualisatie. Bijvoorbeeld, een recente genoom-brede sequencing project in combinatie met LPS karakterisering van een uitbraak van B. dolosa geleid tot de ontdekking van een nucleotide polymorfisme (SNP) dat samenhangt met de aanwezigheid en afwezigheid van LPS in deze stammen ^11. Wij denken dat deze methode de voorkeur om de behandeling van volledige protease-cellysaten beschreven Hitchcock en Brown ^9, omdat dit een relatief snel, maar zwaar genoeg om hoogwaardige LPS voor verdere analyse opleverens.

Hoewel we alleen een voorbeeld volgens de Burkholderia dolosa kan dit protocol worden aangepast aan andere Gram-negatieve soorten. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze protocol om uit te pakken en LPS visualiseren van andere Burkholderia spp., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa en Salmonella spp. Als het protocol levert weinig of geen LPS opbrengst kan het zijn dat de LPS fractioneert naar een andere laag in de extractiestappen, 2,7-2,9. Om deze problemen, het protocol te herhalen en opslaan van een steekproef van elke laag bij de extractie stappen, kunnen deze worden gevisualiseerd door kleuring een SDS-PAGE gel om waar de LPS fractioneert te bepalen, en het protocol dienovereenkomstig kunnen worden gewijzigd. Ook moet worden opgemerkt dat dit protocol, maar ideaal voor analytische doeleinden, niet LPS die geschikt is voor andere toepassingen, zoals structurele analyses opleveren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase I recombinant, RNase-free	Roche Group	04716728001
RNase A	Roche Group	10109169001
Proteinase K	Fisher Scientific	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher Scientific	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes, Life Technologies	P20495