Summary
हम एक संशोधित गर्म जलीय phenol के ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं से lipopolysaccharide (LPS) सफ़ाई के लिए निष्कर्षण विधि का वर्णन. एक बार निकाले LPS बाद एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया जा सकता है और प्रत्यक्ष धुंधला हो जाना या पश्चिमी immunoblot के द्वारा कल्पना.
Protocol
1. जीवाणु की LPS निष्कर्षण के लिए तैयारी
- Luria (पौंड) शोरबा, यदि आवश्यक हो तो एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक की 5 एमएल में एक रात में संस्कृति शुरू करो. 37 में इनक्यूबेटर मिलाते डिग्री सेल्सियस और 200 rpm में रातोंरात (12-18 घंटे) संस्कृति आगे बढ़ें.
- लेग साथ संस्कृति 01:10 पतला और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक आयुध डिपो 600 पढ़ने ले लो. आयुध डिपो 600 पढ़ने के आधार पर, 0.5 के एक आयुध डिपो 600 के लिए अपने जीवाणुओं की 1.5 एमएल निलंबन.
- गोली 10,600 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए एक microcentrifuge में बैक्टीरिया. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. गोली -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, अगर LPS तुरंत निकाला जाना नहीं जा रहा है.
2. LPS का निकालना
- सबसे पहले, 2x एसडीएस बफर तैयार करते हैं. 0.1 में 4% β-mercaptoethanol (बीएमई), 4% एसडीएस 50 एमएल समाधान और 20% ग्लिसरॉल Tris - एचसीएल एम, 6.8 पीएच. समाधान डाई bromophenol नीले रंग की एक चुटकी जोड़ें. 2X है कमजोर द्वारा एक 1x एसडीएस बफर स्टॉकबाँझ आसुत एच 2 ओ में tock 01:01 यह कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
- बाँझ आसुत एच 2 ओ में तीन अलग DNase मैं, RNase और proteinase कश्मीर के 10 मिलीग्राम / एमएल समाधान करें
- एसडीएस बफर 1x 200 μl में 1.3 कदम से pelleted बैक्टीरिया Resuspend. सुनिश्चित करें कि गोली पूरी तरह से समाधान pipetting और धीरे धीरे नीचे से resuspended है. भंवर मत करो.
- 15 मिनट के लिए एक नहाने के पानी में निलंबित बैक्टीरिया उबाल लें. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा समाधान की अनुमति दें.
- दोनों DNase मैं और RNase 2.2 में तैयार समाधान के 5 μl जोड़ें. 37 ° सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते हैं. * यह कदम वैकल्पिक है, वहाँ nuclease इलाज और गैर इलाज के नमूने के बीच LPS की गुणवत्ता में कम से कम अंतर है.
- Proteinase कश्मीर 2.2 में तैयार समाधान के 10 μl जोड़ें. 59 ° C पर 3 घंटे के लिए नमूने सेते हैं. यह कदम रातोंरात किया जा सकता है, अगर समय की कमी हैं.
- प्रत्येक नमूना विज्ञापन,घ 200 की μl बहुत ठंडा Tris संतृप्त फिनोल (पानी संतृप्त phenol के एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर Tris संतृप्त फिनोल उपलब्ध नहीं है). टोपियां पर नलियों कसकर बंद हो जाती हैं, और लगभग 5 से 10 सेकंड के लिए प्रत्येक नमूना भंवर सुनिश्चित करें.
- 65 ° सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूने, सेते हैं, कभी कभी vortexing. कमरे के तापमान को शांत incubating के बाद, तो 1 कमरे के तापमान Diethyl ईथर के प्रत्येक नमूना एमएल और 5 से 10 सेकंड के लिए भंवर जोड़ें. यकीन है कि एक धूआं हुड में संभाल आकाश करने के लिए, के रूप में यह अस्थिर है.
- 20,600 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. ध्यान, अपकेंद्रित्र से नमूने नीचे नीले रंग की परत को हटाने और निकालने. ऊपरी, स्पष्ट परत से बचने के लिए सुनिश्चित. नीले रंग की परत की एक छोटी राशि पीछे छोड़कर ऊपरी परत के साथ संदूषण के लिए बेहतर है.
- 2.9 - 2.7 कदम दोहरा द्वारा नमूने पुनः निकालने. दो extractions के आमतौर पर पर्याप्त है. यदि नमूने बादल दिखाई देते हैं, और extractions के performe हो सकता हैद. एसडीएस पृष्ठ से निकाले नमूनों में से प्रत्येक के लिए अलग से पहले 2x एसडीएस बफर के 200 μl जोड़ें. नमूने 8% -15% एसडीएस polyacrylamide जैल पर चला जा सकता है. इस पद्धति का उपयोग करके तैयार LPS के पांच से पंद्रह μl दृश्य के लिए आमतौर पर पर्याप्त है.
3. प्रतिनिधि परिणाम
LPS इसके बाद के संस्करण के रूप में तैयार नमूने प्रत्यक्ष धुंधला द्वारा कल्पना एसडीएस पृष्ठ पर जुदाई के बाद एक मानक प्रोटोकॉल चांदी धुंधला हो जाना या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध LPS धुंधला किट का उपयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, polyacrylamide जेल अलग LPS nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरित किया जा सकता है और पश्चिमी अधीन LPS-विशेष विरोधी सीरा का उपयोग immunoblotting. इस प्रोटोकॉल के लिए, हम समर्थक क्यू पन्ना 300 Lipopolysaccharide जेल दाग किट (आण्विक जांच) का इस्तेमाल किया है, और निर्माता के निर्देशों का पालन.
चित्र 1 में दिखाया है एक प्रो - क्यू पन्ना 300 दाग 12% एसडीएस polyacrylamide जेल. प्रत्येक लेन अलग से तैयार LPS 15 μlBurkholderia dolosa अलग उपभेदों सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के थूक के नमूने से अलग है. अलग बैंडिंग LPS, सीढ़ी पैटर्न अलग संख्या ओ - प्रतिजन oligosaccharide कोर से जुड़ी इकाइयों को दोहराने के चिंतनशील है, इस पद्धति का उपयोग करके स्पष्ट कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, 1 और 6 लेन में नमूने एक दूसरे के समान बैंडिंग पैटर्न (लाल रंग में बॉक्सिंग).
चित्रा 1 Burkholderia dolosa नैदानिक आइसोलेट्स से प्रो - क्यू पन्ना 300 दाग LPS. बी सात से LPS सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों में एक प्रकोप से dolosa उपभेदों इस प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित अलग थे. पंद्रह μl 12% एसडीएस polyacrylamide जेल, समर्थक क्यू 300 पन्ना के साथ और दाग पर अलग हो गए थे, निर्माता के निर्देशों के अनुसार. LPS कोर एक तीर संकेत दिया है, और हे प्रतिजन दोहराता के समान बैंडिंग पैटर्न दिखा के LPS लाल में बॉक्सिंग हैं. एम = आण्विक वजन मार्कर.
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Discussion
हम LPS न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन सहित अन्य सेलुलर घटक, से दूर शुद्ध करने की एक विधि का वर्णन किया है. इस विधि उच्च गुणवत्ता LPS कि एसडीएस पृष्ठ जैल की कार्बोहाइड्रेट धुंधला सहित विभिन्न दृश्य तरीकों, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है की एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करता है. इस विधि उपभेदों की एक किस्म से LPS सीरोटाइप, विशिष्ट विरोधी - सीरा का उपयोग, या प्रत्यक्ष दृश्य से आइसोलेट्स के बीच संबद्धता दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हाल ही में एक जीनोम चौड़ा LPS लक्षण वर्णन के साथ संयोजन में अनुक्रमण परियोजना बी के प्रकोप से dolosa एक एकल nucleotide (SNP) बहुरूपता है कि उपस्थिति और इन 11 उपभेदों में LPS की अनुपस्थिति के साथ संबद्ध की खोज करने के लिए नेतृत्व किया. हम मानते हैं कि इस विधि के पूरे सेल lysates हिचकॉक और 9 ब्राउन द्वारा वर्णित के protease उपचार के लिए बेहतर है, के रूप में यह एक अपेक्षाकृत जल्दी, अभी तक पर्याप्त कठोर आगे विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले LPS उपज हैहै.
जब तक हम केवल एक Burkholderia dolosa का उपयोग कर उदाहरण दिखाने के लिए, इस प्रोटोकॉल अन्य ग्राम नकारात्मक प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से. हम सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है करने के लिए निकालने और अन्य Burkholderia एसपीपी से LPS कल्पना, Escherichia कोलाई, हेलिकोबेक्टर, Pseudomonas aeruginosa और साल्मोनेला एसपीपी. कम या कोई LPS उपज में प्रोटोकॉल परिणाम अगर, यह हो सकता है कि LPS निष्कर्षण चरणों में एक अलग परत, 2.7-2.9 के लिए fractionates. इस समस्याओं का निवारण करने के लिए, प्रोटोकॉल दोहराना और निष्कर्षण चरणों के दौरान प्रत्येक परत का एक नमूना बचाने के लिए, इन एक जेल एसडीएस पृष्ठ धुंधला क्रम में जहां LPS fractionates निर्धारित देखे जा, कर सकते हैं और प्रोटोकॉल के अनुसार संशोधित किया जा सकता है. यह भी कहा जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल, जबकि विश्लेषणात्मक प्रयोजनों के लिए आदर्श, LPS कि संरचनात्मक विश्लेषण के रूप में अन्य अनुप्रयोगों, के लिए उपयुक्त है उपज नहीं करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य और सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche Group | 04716728001 | |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | |
| Proteinase K | Fisher Scientific | BP1700 | |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher Scientific | BP1750-100 | |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 | |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes, Life Technologies | P20495 |
References
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