Rening och visualisering av lipopolysackarid från Gram-negativa bakterier genom varm vattenhaltig fenol Extraktion

Summary

Vi beskriver en modifierad varm vattenhaltig-fenolextraktion förfarande för rening av lipopolysackarid (LPS) från Gram-negativa bakterier. Gång extraherades kan LPS därefter analyseras med SDS-PAGE och visualiserades genom direkt färgning eller Western immunoblotting.

Abstract

Lipopolysackarid (LPS) är en huvudkomponent i Gram-negativa bakteriella yttre membranen. Det är en tredelad molekyl bestående av lipid A, som är inbäddad i det yttre membranet, en kärna oligosackarid och upprepande O-antigenenheter som sträcker sig utåt från ytan av cellen ^{1, 2.} LPS är en immundominant molekyl som är viktig för virulens och patogenesen för många bakteriearter, inklusive Pseudomonas aeruginosa, Salmonella-arter, och Escherichia coli ^3-5, och skillnader i LPS O-antigen komposition utgör grunden för serotypning av stammar. LPS är involverad i anslutning till värdceller i början av infektionen och ger skydd mot komplement-medierad dödande, stammar som saknar LPS kan dämpas för virulens ^6-8. Av dessa skäl är det viktigt att visualisera LPS, i synnerhet från kliniska isolat. Visualisera LPS bandmönster och erkännande av särskilda enntibodies kan vara användbara för att identifiera stam linjer och för att karakterisera olika mutanter.

I denna rapport beskriver vi en varm vattenhaltig fenol-metoden för isolering och rening av LPS från Gram-negativa bakterieceller. Detta protokoll möjliggör utvinning av LPS bort från nukleinsyror och proteiner som kan interferera med visualisering av LPS som inträffar med kortare och mindre intensiva extraktionsmetoder ^9. LPS framställdes på detta sätt kan separeras genom natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) och direkt färgas med användning av kolhydrat / glykoprotein fläckar eller standard silver metoder missfärgning. Många anti-sera mot LPS innehålla antikroppar som korsreagerar med yttermembranproteiner eller andra mål antigena som annars skulle hämma reaktivitet observerades efter Western immunoblotting med SDS-PAGE-separerade råa cell-lysat. Proteasbehandling av råa cellysat enbart är inte alltid ett effektivt sätt att avlägsna dennabakgrunden med denna eller andra metoder visualisering. Vidare kan omfattande proteas behandling i ett försök att avlägsna denna bakgrund att leda till dålig kvalitet LPS som inte är väl upplösta genom någon av de förutnämnda metoderna. Av dessa skäl anser vi att följande protokoll, anpassas från Westpahl och Jann ^10, är idealisk för LPS extraktion.

Protocol

1. Beredning av bakterier för LPS Extraction

1. Starta en odling över natten i 5 ml Luria Broth (LB), kompletterat med antibiotika om så är nödvändigt. Växa kultur över natten (12-18 timmar) i en skakinkubator vid 37 ° C och 200 rpm.
2. Späd kulturen 1:10 med LB och ta en OD ₆₀₀ behandlingen i en spektrofotometer. Baserat på OD ₆₀₀ läsning, gör en 1,5 ml suspension av dina bakterier till en OD ₆₀₀ av 0,5.
3. Pelletera bakterier i en mikrocentrifug vid 10.600 x g under 10 minuter. Avlägsna och kassera supernatanten. Pelleten kan lagras vid -20 ° C, om LPS inte kommer att dras ut omedelbart.

2. Extraktion av LPS

1. Första, upprätta 2x SDS-buffert. Göra en 50 ml lösning av 4% β-merkaptoetanol (BME), 4% SDS och 20% glycerol i 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Lägg till en nypa bromfenolblå att färga lösningen. Gör en 1x SDS-buffertlager genom att späda 2X stock 1:1 i sterilt destillerat _H2O Detta kan lagras vid rumstemperatur.
2. Göra tre separata 10 mg / ml lösningar av DNas I, RNas, och proteinas K i sterilt destillerat _H2O
3. Resuspendera de pelleterade bakterier från steg 1,3 i 200 pl av 1 x SDS-buffert. Se till att pelleten är helt resuspenderas genom att pipettera lösningen upp och ner långsamt. Inte virvel.
4. Koka de suspenderade bakterier i ett vattenbad under 15 minuter. Låt lösningen svalna vid rumstemperatur under 15 minuter.
5. Tillsätt 5 pl både DNasI och RNas som bereds på 2,2. Inkubera proverna vid 37 ° C under 30 minuter. * Detta steg är valfritt, det är minimal skillnad i kvaliteten på LPS mellan nukleas-behandlade och obehandlade prover.
6. Tillsätt 10 pl proteinas K-lösning framställd i 2,2. Inkubera proverna vid 59 ° C under 3 timmar. Detta steg kan utföras över natten, om det finns tidsbegränsningar.
7. Till varje prov, add 200 ^ il av iskall Tris-mättad fenol (vattenmättad fenol kan användas som ett substitut om Tris-mättad fenol inte är tillgänglig). Se locken på de rör som är slutna tätt och virvelblandades varje prov under ca 5 till 10 sekunder.
8. Inkubera proverna vid 65 ° C under 15 minuter, virvling då och då. Efter inkubering svalna till rumstemperatur, tillsätt sedan 1 ml av rumstempererat dietyleter till varje prov och virvel under 5 till 10 sekunder. Var noga med att utföra handtag eter i ett dragskåp, eftersom det är flyktigt.
9. Centrifugera proverna vid 20.600 x g under 10 minuter. Noggrant avlägsnande av proverna från centrifugen och extrahera den nedre blå skiktet. Var noga med att undvika det övre, klara skikt. Kvarlämnande en liten mängd av den blå skiktet är att föredra att kontaminering med det övre skiktet.
10. Packa proverna genom att upprepa steg från 2,7 till 2,9. Två extraktioner räcker vanligtvis. Om proven visas molnigt, kan mer extraktioner vara performed. Tillsätt 200 pl av 2x SDS-buffert till varje av de extraherade proverna före separation genom SDS-PAGE. Prover kan köras på 8% -15% SDS-polyakrylamidgeler. Fem till femton il LPS framställda med användning av denna metod är vanligtvis tillräcklig för visualisering.

3. Representativa resultat

LPS prover framställda enligt ovan kan visualiseras genom direkt färgning efter separation på SDS-PAGE med användning av en standard silverfärgning protokoll eller ett kommersiellt tillgängligt LPS färgningskit. Alternativt kan LPS separerade på en polyakrylamidgel överföras till en nitrocellulosa-membran och utsattes för Western-immunläskning med användning av LPS-specifika anti-sera. För detta protokoll har vi använt Pro-Q Emerald 300 Lipopolysackarid Gel Stain Kit (Molecular Probes) och följde tillverkarens instruktioner.

Visas i figur 1 är en Pro-Q Emerald 300 färgades 12% SDS-polyakrylamidgel. Varje bana innehåller 15 | il av LPS framställda från difnan stammar av Burkholderia dolosa isolerade från sputum prover av patienter med cystisk fibros. Olika LPS bandbildande mönstren stege, reflekterande av olika antal O-antigen upprepande enheter bundna till kärnan oligosackarid, är uppenbara med denna metod, till exempel, prov i spår 1 och 6 har liknande bandmönster med varandra (box i rött).

Figur 1. Pro-Q Emerald 300 infärgade LPS från Burkholderia dolosa kliniska isolat. LPS från sju B. dolosa stammar från ett utbrott i patienter med cystisk fibros isolerades som beskrivs i detta protokoll. Femton | il separerades på en 12% SDS-polyakrylamidgel och färgades med Pro-Q Emerald 300, enligt tillverkarens instruktioner. LPS-kärnan anges en pil, och LPS som gav likartade bandmönster av O-antigen upprepningar är inramade i rött. M = Molekylviktsmarkör.

Discussion

Vi har beskrivit ett förfarande för rening av LPS från andra cellulära komponenter, inklusive nukleinsyror och proteiner. Denna metod tillhandahåller hög kvalitet LPS som kan användas i ett antal olika visualisering metoder, inklusive kolhydrat-färgning av SDS-PAGE-geler, såsom visas i figur 1. Denna metod kan användas för att serotypa LPS från olika stammar, med användning av specifika anti-sera, eller för att visa släktskap mellan isolat genom direkt visualisering. Till exempel en nyligen Genomvid sekvensering projekt i kombination med LPS karakterisering av ett utbrott av B. dolosa ledde till upptäckten av en enstaka nukleotidpolymorfism (SNP) som korrelerar med närvaron och frånvaron av LPS i dessa stammar ^11. Vi tror att denna metod är att föredra framför proteasbehandling av hela cellysat beskrivs av Hitchcock och Brown ^9, eftersom det är ett relativt snabbt, men tillräckligt stränga för att ge hög kvalitet LPS för vidare analyss.

Även om vi bara visa ett exempel med hjälp av Burkholderia dolosa kan detta protokoll anpassas till andra Gram-negativa arter. Vi har med framgång använt detta protokoll för att extrahera och visualisera LPS från andra Burkholderia SPP., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa och Salmonella spp.. Om protokollet resulterar i liten eller ingen LPS utbyte, kan det vara att LPS fraktionerar till ett annat lager i extraktionssteg, 2,7-2,9. För att felsöka, upprepa protokollet och spara ett urval av varje lager under extraktion steg kan dessa vara visualiseras genom färgning en SDS-PAGE gel för att avgöra var LPS fraktionerar och protokollet kan ändras. Det bör också noteras att detta protokoll, medan perfekt för analytiska ändamål, inte ger LPS som är lämplig för andra applikationer, såsom strukturella analyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase I recombinant, RNase-free	Roche Group	04716728001
RNase A	Roche Group	10109169001
Proteinase K	Fisher Scientific	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher Scientific	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes, Life Technologies	P20495