ラット肝細胞の単離及び初代培養

Summary

初代肝細胞は、生理学的に関連する実験系の生化学的、分子生物学、代謝機能を評価するための貴重なツールを提供しています。我々は一貫してto1.0×10アップ可能な肝細胞を生成する現場肝灌流、ラットの信頼性の高いプロトコルを記述する

Abstract

初代肝細胞培養は、広範囲に肝機能、疾患、病態生理学、薬理学および他の関連科目の基礎研究に使用されている貴重なツールです。無傷の肝細胞の単離のための二段階コラゲナーゼ灌流に基づく方法は、1969年¹ベリーと友人によって導入されたと、それ以来、多くの変更を受けています。最も一般的に使用される技術はSeglenin 1976年²によって記述されていた。本質的に、肝細胞は門脈を介して非循環コラゲナーゼ灌流により麻酔成体ラットから分離しています。単離された細胞は、100μmの細孔サイズのメッシュナイロンフィルターを通して濾過し、プレート上に培養される。 4時間培養後、培地は、培養への追加時の血清含有又は無血清培地、例えば、HepatoZYME-SFM、置き換えられます。これらの手順は、優れたテキストよりもビデオで実証することができる外科手術、無菌培養工程を必要とします。 HERE、我々は大量に実行可能な肝細胞の生成に一貫してできるように、ビデオと書かれたプロトコルの両方でこれらの手順の詳細な手順を文書化します。

Protocol

1。準備

すべてのバッファは、新たに滅菌技術を用いて調製されており、コーニング0.22μmのフィルターを用いて濾過滅菌。

1. 0.5〜25 mMとHEPES、0.9 mMのEDTAにはMg ^{2 +（MgCl} _2の ）：ハンクス平衡塩溶液（HBSSは、Ca ^{2 +}およびMg ²なしで^+、 表1を参照）に以下を加えることで、 私をバッファ灌流を準備します。 mMの。
2. （HBSSに以下を追加することにより、 灌流緩衝液IIを準備するのCa ^{2 +}およびMg ^{2 +、} 25 mMのHEPESに： 表1）を参照してください。
3. 灌流緩衝液IIプラスcollagenaseIIを準備します 。コラゲナーゼII（1000 U）300ミリリットル灌流バッファーIIで溶解し、灌流前に水浴中で解決策を暖かく保つ。コラゲナーゼIIの活性は時間とともに減少するので、この溶液を30分以内に使用する必要があります。
4. ウィリアムの完全培地を準備します。次の行を追加します。100nmにインスリン、デキサメタゾンは100nM、ペニシリン100 IU / mlおよびストレプトマイシン〜100 mg / mlに、L-グルタミン2mMのに、5％ウシ胎児血清（FBS）：ウィリアムズのミディアムEへ。
5. これらのバッファは、42℃水浴中で30分間加温する必要があります°C、37のカニューレの出口温度に対応する最適な温度は℃、

2。肝臓の分離のためのラット灌流

1. 灌流システムは、ポンプ、オートクレーブシラスティックチューブや水浴（ 図1を参照）で構成されています。 10ミリリットル/分に蠕動灌流ポンプの流量を事前に設定します。
2. 腹腔内（ip）ケタミン（87 mg / kg体重）とキシラジン（13 mg / kg体重）で成体ラット（300 g体重）を麻酔。麻酔の深さはつま先のピンチによって監視されるべきである。ラットは、もはや有害刺激に応答しない場合は、腹部の毛と準備betadineとエタノールで腹部を剃る。正中切開を介して入力してください。
3. さらす慎重に腹腔の右外側に内臓を移動することで、肝門脈、と（ 図1を参照）肝門静脈に18ゲージangiocathを挿入します。
4. 針に灌流チューブを接続し、予め温めておいた（37℃） 潅流緩衝液Iで低流量（10ml /分）で、in situで注入を開始します。
5. 適切に実行した場合、肝臓は即座に湯通しを開始する必要があります。一度成功したカニュレーションが確認され、流出（ 図1）を可能にするために下大静脈（IVC）で切断してください。成功したカニ​​ュレーションのためにさらなるテストがIVCに滅菌綿棒で軽い圧力を適用することによって行うことができます。肝臓のすべての葉はすぐに膨潤を開始する必要があります。
6. 25ミリリットル/分の流量を増加させます。肝臓は色が蒼白になる必要があります。
7. 追加の6分間の流れが中断されない、 灌流緩衝液IIプラスコラゲナーゼIIへの灌流液を切り替えます。
<LI>定期的に（消化中の5-10倍）は5秒間隔でIVCに綿棒で圧力を適用します。肝臓は、順番に合計消化時間を短縮し、最終的な収率を増加させる、強化された肝細胞解離につながる、膨張します。
8. コラゲナーゼ灌流した後、肝臓はどろどろ見て開始する必要があります。 20ミリリットルウィリアムの完全培地であらかじめ冷却し、滅菌ビーカーに肝臓フリー、場所を分析し、組織細胞培養フードにそれを取る。

3。肝細胞の分離

1. 細胞培養フード内に、穏やかに滅菌シャーレ内にウィリアムの完全培地に細胞を分散させるために、セルスクレーパーを使用しています。
2. 結合組織および未消化の組織片を除去するために、50 mlコニカルチューブに100μmの細孔径のセルストレーナーを介して細胞分散をフィルタリングします。
3. 4℃で3分間、50×gで40ミリリットルウィリアムの完全培地と遠心で細胞をサスペンド
4. 上清を吸引し、穏やかに細胞を洗浄するには、40 mlの冷ウィリアムの完全培地で細胞を再懸濁する。遠心操作を繰り返します。
5. 上清を吸引し、ゆっくりと25ミリリットルウィリアムの完全培地で再懸濁細胞。チューブにPBSで25ミリリットルの90％パーコール溶液を加え、穏やかに混ぜる。
6. 4℃で10分間、200 xgで遠心分離生細胞は、Percoll勾配の最下部に残っているため、グラデーションの上から死んだ細胞を吸引します。
7. 30ミリリットル暖かいウィリアムの完全培地中で細胞ペレットを一時停止し、遠心分離を繰り返し、20ミリリットル暖かいウィリアムの完全培地中で細胞ペレットを再懸濁する。
8. 血球計算板を用いた細胞懸濁液内の細胞をカウントし、トリパンブルー染色により細胞の生存を決定します。

4。肝細胞培養

1. 好ましい濃度に暖かいウィリアムの完全な媒体、例えば2.5×10 ⁵細胞/ mlで細胞を希釈します。細胞培養プレート上の任意のボリュームで板細胞、例えば。 5×10 ⁵細胞/ 2ミリリットル/ウェル、6ウェル/プレート、または、2.5×10 ⁵細胞/ 1.5ミリリットル/ウェル、12ウェル/プレート。非コーティングしたプレートは、肝細胞の培養には問題ありません。
2. > 85％、生細胞の典型的な予備校では、細胞密度は、肝細胞は、完全な細胞の大きさに成長するための十分なスペースを維持しながら、細胞間接触を可能にする約60〜70％コンフルエントに達するとの最終的な合流が得られるはず90から95パーセント。
3. 井戸の中心部に集約するセルの傾向を最小限に抑えるために、換言すれば、肝細胞のさえ単分子膜を形成するために（細胞インキュベーターの空気の流れの内部に起因する可能性が最も高い）、プレートの内部に残るようにインキュベーターに置く前に30分間細胞培養フード。
4. 37℃で細胞を培養温度95％空気および5％CO ₂の加湿大気中のC。 4時間培養後、細胞は、同じ血清含有培地に残ったか、血清fで培地を交換する希土類元素の媒体、例えばHepatoZYME-SFM（ 表1を参照）。無血清培地は無血清培地が使用されているホルモンからも副作用の影響で細胞の形態を維持するのに役立ちます。
5. 細胞は実験前にを回復し、少なくとも一晩成長することができます。これは重要な酵素（例えば、P450の）の機能を維持するのを助けるかもしれないので私達は24時間以内にテスト用の細胞を使用することをお勧めします。
6. 必要に応じて、2日間隔で培地を交換してください。

5。代表的な結果

条件は、定期的に1匹のラットの肝臓から調製当たり1.0×10 ⁸細胞の細胞収穫を生成する説明します。トリパンブルー排除法によって測定した肝細胞の生存率は88〜96％の範囲内で一貫していた。

図2に、4時間の播種後肝細胞集合体とフォームのクラスタに示されている。ほとんどの単離された細胞は、典型的な単層成長に平らに広がる。 24時間では、セルの端が定義されて、細胞の表面はかなり滑らかで、脂肪滴が表示されています。細胞は1〜3セルの中央に位置する円形で核小体、、、、細胞間の核ディスプレイ一貫性のある大きさ（ 図2）を持っています 。

図1肝灌流の図。 18ゲージangiocathは、肝臓の門脈に挿入され、その後灌流チューブを針に接続されています。一度成功したカニ​​ュレーションが確認され、下大静脈（IVC）のカットが流出できるようになります。

2時間以上培養肝細胞の形態（4時間〜24時間）、倍率×200 図 。 24時間培養後、細胞は、典型的な単層の成長に広がり、細胞間の接合部は直線状です。

試薬の名前	会社	カタログ番号
HBSS（Ca 2 +を 、およびMg 2 +なし）	インビトロジェン	14174
HBSS（Ca 2 +を 、およびMg 2 +）	インビトロジェン	14025
ウィリアムズのミディアムE	インビトロジェン	12551-032
Collegenase II	ワージントン	LS004176
セルストレーナー（100μm以下）	BD	352360
HepatoZYME-SFM	インビトロジェン	17705
パーコール	シグマ	P4937
Angiocath（18ゲージ）	BD	381705

表1。

Discussion

肝細胞の初代培養は、広く肝臓生理学と病理学のさまざまな側面を勉強するために使用されるin vitroモデルである。例えば、初代培養は、チトクロームP450、薬物代謝、薬物相互作用し、細胞毒性および遺伝毒性^3-7のメカニズムを含む薬物代謝酵素の発現と機能を評価するために使用されます。修正を加えたラット肝細胞の単離および培養は、エイケンらの以前のレポートから構成されている記述プロトコル^。8、その他の^2,9,10。条件は一貫して88の間に細胞の生存と準備当たり1.0×10 ⁸細胞〜96％に可能な肝細胞を生成する説明します。以下は、他の重要な手順は、次のとおりです。

1. 細胞培養を記述する任意のプロトコルと同様に、最も重要な側面は、厳密な無菌操作のテクニック^11を使用して細菌や真菌病原体による汚染を避けるためです。
2. デスモソーム、また黄斑接着として知られ、細胞間接着に特化したセル構造です。デスモソームの整合性は、カルシウムを必要とし、それがEDTAやカルシウムを含まない培地によって分解される。酵素コラゲナーゼは、分離肝細胞につながる、デスモソームの関連付けを解除することができます。したがって、血流は、Ca ^{2 +を}使用^しない培地とCa ^2を含むその後のCa ^{2 +}富栄養培地⁺依存性コラゲナーゼ、消化し ​​ます。
3. 適切なコラゲナーゼ処理では、肝細胞調製のために不可欠です。 PerfussionバッファーIIプラスcollegenase IIの流量は25ml /分で維持する必要があります。失敗した肝細胞培養の一般的な原因は次のとおり不十分な37°Cおよび/または低速血流速度に温め血流のバッファが原因である可能性があり1）悪い細胞解離、および2）細胞死、coul過度のコラゲナーゼ消化が原因であると思います。
4. 肝細胞はまだ比較的壊れやすく、容易に破損したり、直接接触によって破壊することができるように、最初の4時間培養した後、メディアを変更するときは慎重に、唯一の井戸の側を下に、決して直接細胞の上にピペット。