Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Summary

Primaire hepatocyten een waardevol hulpmiddel om biochemische, moleculaire en metabolische functies in een fysiologisch relevante experimentele systeem te evalueren. We beschrijven een betrouwbaar protocol voor rat in situ leverperfusie, die consequent levensvatbare hepatocyten genereert tot to1.0 × 10

Abstract

Primaire hepatocyten cultuur is een waardevol instrument, dat uitvoerig is gebruikt voor fundamenteel onderzoek van de leverfunctie, ziekte, pathofysiologie, farmacologie en andere gerelateerde onderwerpen. De methode op basis van twee-staps collagenase perfusie voor isolatie van intacte hepatocyten werd voor het eerst geïntroduceerd door Berry en vriend in 1969 ¹ en sindsdien is er veel aan wijzigingen. De meest gebruikte techniek is beschreven door Seglenin 1976 ^2. In wezen, hepatocyten zijn gescheiden van volwassen ratten verdoofd door een niet-recirculerende collagenase perfusie via de poortader. De geïsoleerde cellen worden vervolgens gefiltreerd door een 100 pm gaas poriegrootte nylonfilter en gekweekt op platen. Na 4 uur cultuur, wordt het medium vervangen met serum-bevattende of serum-vrij medium, bijvoorbeeld HepatoZYME-SFM, voor extra tijd om cultuur. Deze procedures vereisen chirurgische en steriele cultuur stappen die beter kunnen worden door video aangetoond dan door tekst. Here, we documenteren de gedetailleerde stappen voor deze procedures video en schriftelijk protocol, die steeds mogelijk de productie van levensvatbare hepatocyten in grote aantallen.

Protocol

1. Voorbereiding

Alle buffers worden vers bereid met behulp van steriele techniek en filter-gesteriliseerd met behulp van een Corning 0,22 pm filter.

1. Bereid Perfusie buffer I door de volgende voor Balanced Salt Solution Hank's (HBSS, zonder ^{Ca2 + en} Mg2 ^+, zie tabel 1): ^{Mg2 +} _(MgCl2) tot 0,9 mM EDTA 0,5 mM en HEPES 25 mM.
2. Bereid Perfusie buffer II door de volgende voor HBSS (met ^{Ca2 + en} Mg2 ^+, zie tabel 1): HEPES tot 25 mm.
3. Bereid Perfusie buffer II plus collagenaseII: Los collagenase II (1000 U) met 300 ml Perfusie buffer II en houdt de oplossing warm in water-bad voor perfusie. Deze oplossing dient binnen 30 min omdat de activiteit van collagenase II af met de tijd.
4. Bereid volledige Medium William's: Voeg de volgendeMedium voor E Williams: L-glutamine en 2 mM, foetaal runderserum (FBS) tot 5% insuline 100 nM, 100 nM dexamethason, penicilline 100 IU / ml streptomycine en 100 mg / ml.
5. Deze buffers worden verwarmd gedurende 30 minuten in een waterbad bij 42 ° C, een optimale temperatuur die overeenkomt met een uitlaattemperatuur in de canule van 37 ° C.

2. Rat Perfusie voor lever Isolatie

1. De perfusie-systeem bestaat uit de pomp, autoclaveerbaar silastic buizen en een waterbad (zie figuur 1). Vooraf stelt u het debiet van de peristaltische perfusie pomp tot 10 ml / min.
2. Verdoven volwassen rat (300 g lichaamsgewicht) met intraperitoneale (ip) ketamine (87 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (13 mg / kg). Diepte van de anesthesie moet worden gecontroleerd door de teen knijpen. Als de rat niet meer reageert op schadelijke stimulus, scheren buik haar en prep de buik met betadine en ethanol. Geef door middel van een middellijn incisie.
3. Blootstellende poortader door voorzichtig het verplaatsen van de ingewanden aan de rechterkant buiten de buikholte, en plaats een 18-gauge angiocath in de poortader (zie figuur 1).
4. Sluit de perfusaat slang aan op de naald en start de infusie in situ op een laag debiet (10 ml / min) met voorverwarmd (37 ° C) Perfusie Buffer I.
5. Als dit goed wordt uitgevoerd, moet de lever direct beginnen te blancheren. Eens dit met succes cannulatie wordt bevestigd, maakt u een ketting op vena cava inferior (IVC) naar efflux (figuur 1) mogelijk te maken. Een verdere proef voor succesvolle infusen kan worden uitgevoerd met een lichte druk met desinfectiedoekje de IVC, alle lobben van de lever moeten snel beginnen te zwellen.
6. Verhoog de snelheid van stroming, 25 ml / min. De lever zou moeten worden bleek van kleur.
7. Schakel de perfusie oplossing voor perfusie buffer II plus collagenase II zonder onderbreking van de stroom voor een extra 6 minuten.
<li> Van tijd tot tijd (5-10 keer tijdens de spijsvertering) toe te passen druk met wattenstaafje om de IVC voor 5-seconden. De lever zal opzwellen, wat leidt tot verhoogde hepatische cel dissociatie, op zijn beurt het verminderen van de totale spijsvertering tijd, en het verhogen van uiteindelijke opbrengst.
8. Na collagenase perfusie, moet de lever beginnen te kijken papperig. Ontleden de lever vrij, plaats in een vooraf gekoeld steriele beker met 20 ml compleet medium William, en dan neem het mee naar weefselcel cultuur kap.

3. Hepatocyt celisolatie

1. Binnen de celkweek kap, gebruik dan een cel schraper om voorzichtig de cellen verspreiden in compleet medium William's in een steriele petrischaal.
2. Filter de cel dispersie door een 100 um zeef poriegrootte cel in een 50 ml conische buis om bindweefsel en onverteerd weefselfragmenten verwijderen.
3. Suspendeer cellen in 40 ml compleet medium William en centrifugeer 50 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
4. Zuig het supernatant envoorzichtig opnieuw te schorten cellen in compleet medium 40 ml koud William's aan cellen te wassen. Herhaal centrifugeren.
5. Zuig het supernatant, en voorzichtig opnieuw te schorten cellen met 25 volledige Medium ml William's. 25 ml 90% Percoll in PBS in de buis en meng.
6. Centrifugeer 200 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig het dode cellen van de top van de gradiënt omdat de levensvatbare cellen blijven de bodem van de Percoll verloop.
7. Hang de cel pellet in 30 ml warme volledig medium William's, en herhaal centrifugeren en de cel pellet opnieuw te schorten in 20 ml warme volledig medium William's.
8. Tel de cellen in de celsuspensie met een hemocytometer en bepaal cel levensvatbaarheid van trypan blauw kleuring.

4. Hepatocyt Cultuur

1. Verdun cellen met volledig medium warm William aan voorkeursconcentratie, bijvoorbeeld 2,5 x 10 ⁵ cellen / ml. Plate-cellen op een gewenst volume op celcultuur platen, bijv.. 5 x 10 ⁵ cellen / 2 ml / putje, 6 put / plaat, of 2,5 x 10 ⁵ cellen / 1,5 ml / putje, 12 put / plaat. Un-gecoate plaat is prima voor de lever celculturen.
2. In een typische prep met> 85% levensvatbare cellen, moet de celdichtheid bereikt ongeveer 60-70% confluentie, waardoor cel-cel contact met behoud van voldoende ruimte voor de hepatocyten te groeien hun volledige celgrootte geven een laatste samenvloeiing van 90-95%.
3. Om een ​​nog monolaag van hepatocyten vormen, met andere woorden, de neiging om cellen te minimaliseren aggregaat in het centrale gebied van de bron (waarschijnlijk te wijten aan de luchtstroom in de cel incubator), dat de platen achterblijven de celkweek kap voor 30 minuten voordat ze in een couveuse.
4. Culture de cellen bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 95% lucht en _5% CO2. Na 4 h-cultuur kan de cellen ofwel in hetzelfde serum bevattend medium of vervangen medium met serum-free medium, bijvoorbeeld HepatoZYME-SFM (zie tabel 1). Het serum-vrij medium helpt celmorfologie handhaven zonder nadelige effecten van hormonen als een serum-vrij medium gebruikt.
5. Laat cellen te herstellen en ten minste een dag te behalen voorafgaand aan de experimenten. Wij raden aan om de cellen voor de test binnen 24 uur te gebruiken, omdat dit kan bijdragen aan het behoud van de functie van kritische enzymen (bijv. P450).
6. Plaats het groeimedium van 2 dagen, indien nodig.

5. Representatieve resultaten

De beschreven voorwaarden regelmatig te genereren cel oogsten van 1,0 x 10 ⁸ cellen per voorbereiding van een rat lever. De levensvatbaarheid van de hepatocyten gemeten trypan blauw uitsluiting was telkens binnen het bereik van 88 ~ 96%.

Zoals weergegeven in figuur 2 de hepatocyten aggregaat en vorm cluster na 4 uur zaaien. De meeste geïsoleerde cellen plat en verspreid in de typische monolaag groei. Na 24 uur vanaf de rand van cellen gedefinieerd celoppervlak vrij glad en vetdruppels zichtbaar. De cellen een tot drie nucleoli een ronde, in het midden van de cellen en de kernen elkaar gelijk formaat tussen cellen (Figuur 2).

Figuur 1. Een diagram van leverperfusie. Een 18-gauge angiocath wordt ingebracht in de poortader van de lever, is dan een perfusaat slang aangesloten op de naald. Eens dit met succes cannulatie wordt bevestigd, maakt u een ketting op vena cava inferior (IVC) om efflux.

Figuur 2. Morfologie van gekweekte hepatocyten na verloop van tijd (4 uur tot 24 uur), vergroting x 200. Na gekweekt gedurende 24 uur werden de cellen verdeeld in typische monolaag groei en de knooppunten tussen de cellen lineair.

Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +)	Invitrogen	14174
HBSS (met Ca2 + en Mg2 +)	Invitrogen	14025
Medium E Williams	Invitrogen	12551-032
Collegenase II	Worthington	LS004176
Cell zeef (100 micrometer)	BD	352360
HepatoZYME-SFM	Invitrogen	17705
Percoll	Sigma	P4937
Angiocath (18-gauge)	BD	381705

Tabel 1.

Discussion

Primaire cultuur van hepatocyten is een in vitro model algemeen gebruikt om de verschillende aspecten van lever fysiologie en pathologie te bestuderen. Zo wordt de primaire cultuur gebruikt om de expressie en functie van geneesmiddel-metaboliserende enzymen waaronder cytochroom P450, metabolisme van geneesmiddelen, geneesmiddel-geneesmiddel interacties, en de mechanismen van cytotoxiciteit en genotoxiciteit ^3-7 te beoordelen. Het protocol beschrijft het kweken van ratten levercellen is een bewerking van de vorige verslagen van Aiken et al.. ^8, en anderen ^2,9,10 met wijzigingen. De voorwaarden beschreven consequent genereren levensvatbare hepatocyten tot 1,0 x 10 ⁸ cellen per preparaat met levensvatbaarheid van de cellen tussen de 88 ~ 96%. De volgende zijn ook andere kritische stappen:

1. Zoals bij elk protocol beschrijft celcultuur, de meest kritische aspect is om besmetting van bacteriën of schimmels te voorkomen door gebruik te maken strikte aseptische technieken ^11.
2. Desmosome, ook bekend als vlek adherens, een celstructuur gespecialiseerd cel-celadhesie. De integriteit van de desmosome vereist calcium, en het wordt afgebroken door EDTA en calcium-vrije media. De enzymen collagenase kan dissociëren de desmosome, waardoor de isolatie levercellen. Daarom perfusie maakt gebruik van Ca ^{2 +} vrij medium en vervolgens Ca ^{2 +} rijk medium met Ca ^{2 +} afhankelijk collagenase, voor de spijsvertering.
3. Passende collagenase behandeling is absoluut cruciaal voor hepatocyt voorbereiding. Het debiet van Perfussion buffer II plus collegenase II moet worden bewaard bij 25 ml / min. Veelvoorkomende oorzaken van mislukte hepatocyt cultuur zijn onder andere: 1) slechte mobiele dissociatie, die zouden kunnen te wijten zijn aan perfusie buffers onvoldoende verwarmd tot 37 ° C en / of langzaam perfusie snelheid, en 2) celdood, die Could zijn door overmatige collagenase spijsvertering.
4. Wees voorzichtig bij het veranderen van de media na de eerste 4-h cultuur, zoals de hepatocyten nog steeds zijn relatief kwetsbaar en kunnen gemakkelijk worden beschadigd of verstoord door direct contact; pipet alleen langs de zijkant van de put, en nooit rechtstreeks op de top van de cellen.