쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Summary

기본 hepatocytes는 생리학 관련 실험 시스템의 생화학, 분자, 그리고 신진 대사 기능을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다. 우리는 지속적으로 to1.0 × 10 백업 실행 가능한 hepatocytes를 생성 원위치 간 재관류에 쥐에 대한 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명

Abstract

기본 hepatocyte 문화는 광범위 간기능, 질병, pathophysiology, 약리학 및 기타 관련 과목의 기초 연구에 사용되고 유용한 도구입니다. 그대로 hepatocytes의 절연을위한 2 단계 collagenase 재관류를 기반 방법은 먼저 1,969 ¹ 베리와 친구에 의해 소개되었으며, 그 이후 많은 수정 작업을 거쳐왔다. 가장 일반적으로 사용되는 기술은 Seglenin 1,976 ^2로 설명되었다. 기본적으로 hepatocytes는 포털 정맥을 통해 비 순환 collagenase 재관류에 의한 anesthetized 성인 쥐에서 dissociated 있습니다. 분리된 세포 후 100 μm의 기공 크기의 메쉬 나일론 필터를 통해 여과하고, 접시에 배양해 있습니다. 4 시간 배양 후, 매체는 문화에 대한 추가적인 시간 동안 혈청 함유 또는 혈청 프리 매체, 예를 들어 HepatoZYME-SFM,로 대체됩니다. 이러한 절차는 더 나은 텍스트로보다 영상에 의해 입증하실 수 있습니다 외과 및 무균 배양 단계를 필요로합니다. H오히려, 우리는 다수의 유력한 hepatocytes의 생성에 항상 있도록 비디오 및 서면 프로토콜 모두에서 이러한 절차에 대한 자세한 단계를 문서화.

Protocol

1. 준비

모든 버퍼는 갓 무균 기술을 사용하여 준비하고 코닝 0.22 μm의 필터를 사용하여 소독을 필터링합니다.

1. 행크의 균형 소금 솔루션에 다음을 추가하여 전을 버퍼링 재관류 준비 (HBSS, ^{CA이없이 +} 및 MG ^{2 +,} 표 1 참조) : 25에 0.5 밀리미터, 그리고 HEPES에 0.9 밀리미터, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 MG ^{2 +} (MgCl ₂₎ 음.
2. (HBSS에 다음을 추가하여 관류 버퍼 II를 준비 칼슘 ^{2 +} 및 MG ^{2 +,} 25 MM에 HEPES : 표 1)을 참조하십시오.
3. 재관류 버퍼 II 플러스 collagenaseII 준비 : collagenase II (1000 U) 300 ML 재관류 버퍼 II와를 해산하고 재관류 전에 물을 욕조에 솔루션 보온. collagenase II의 활동이 시간과 함께 감소하기 때문에이 솔루션은 30 분 이내에 사용해야합니다.
4. 윌리엄의 전체 매체를 준비하려면 다음을 추가; 인슐린 ~ 100 nm의, dexamethasone ~ 100 nm의 페니실린을 100 IU / ML 및 스트렙토 마이신 100 밀리그램 / ML로 L-글루타민이 MM, 태아 소 혈청 (FBS) 5 %까지 : 윌리엄스 '보통 E됩니다.
5. 이러한 버퍼는 42에서 물을 욕조에 30 분간 예열해야 ° C, 37 정맥의 콘센트 온도에 대응하는 최적의 온도 ° C.가

2. 간 절연을위한 쥐 재관류

1. 관류 시스템은 펌프, autoclavable silastic 관 그리고 물 목욕 (그림 1 참조)으로 구성되어 있습니다. 10 ML / 분 연동 관류 펌프의 미리 설정된 유량.
2. intraperitoneal (IP) 케타민 (87 밀리그램 / kg 체중) 플러스 xylazine (13 밀리그램 / ㎏)과 성인 쥐 (300g의 체중)을 마취. 마취 심도는 발가락 핀치에 의해 감시되어야한다. 쥐가 더 이상 유해 자극에 응답하지되면 복부 머리 사립 betadine와 에탄올과 복부 면도. 중간선 절개를 통해 입력합니다.
3. 폭로신중하게 복강의 오른쪽 바깥으로 내장을 이동하고, 간장 포털 정맥 (그림 1 참조)에 18 게이지 angiocath을 삽입하여 간장 포털 정맥.
4. 바늘로 perfusate 튜빙을 연결하고 사전 예열 (37 ° C) 재관류 버퍼 내로 낮은 유속 (10 ML / 분)에서 원래의 장소에 주입을 시작합니다.
5. 제대로 수행한 경우, 간은 즉시 희게하기 시작한다. 성공 cannulation이 확정되면, 하부 대정 맥 (IVC)에서 잘라내기가 유출 (그림 1)을 허용합니다. 성공 cannulation을위한 추가 시험은 IVC에 멸균 면봉으로 가벼운 압력을 적용하여 수행할 수 있으며, 간장의 모든 돌출부가 빠르게 팽창하기 시작한다.
6. 25 ML / 분 흐름의 속도를 높이십시오. 간장은 색이 창백 수있게됩니다.
7. 추가 육분에 대한 흐름의 중단없이 함께 관류 버퍼 II 플러스 collagenase II에 대한 재관류 솔루션을 전환합니다.
<리> 주기적으로 (소화 동안 5-10 번) 5 초 간격 위해 IVC에 면봉으로 압력을 적용합니다. 간은 차례 총 소화 시간을 절감하고, 최종 수확량 증가, 향상된 간장 세포 분열로 이어지는, 팽창할 것입니다.
8. collagenase 재관류 후, 간 부드러운보고 시작합니다. 20 ML 윌리엄의 전체 매체와 미리 냉장 무균 비커에 간 무료로 장소를 해부하고 조직 세포 배양 후드로 가져가라.

3. Hepatocyte 세포 격리

1. 세포 배양 후드 내에서 부드럽게 멸균 배양 접시 내에서 윌리엄의 전체 매체에 세포를 분산하기 위해 셀 스크레이퍼를 사용합니다.
2. 결합 조직 및 소화되지 않은 조직 파편을 제거하기 위해 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 기공 크기의 셀 스트레이너를 통해 세포 분산을 필터링합니다.
3. 4 ° C.에서 3 분 50 XG 40 ML 윌리엄의 전체 매체와 원심 분리기로 세포를 일시 중지
4. 뜨는을 대기음, 그리고부드럽게 세포를 씻어 40 ML 감기에 윌리엄의 전체 매체에 세포를 다시 일시 중지합니다. 원심 분리를 반복합니다.
5. 뜨는을 대기음, 가볍게 25 ML 윌리엄의 완전한 매체로 다시 중지 세포. 튜브에 PBS에서 25 ML 90 % Percoll 용액을 넣고 가볍게 섞는다.
6. 4 ° C.에 10 분 200 XG에 원심 분리기 실행 가능한 세포가 Percoll 기울기의 하단에 남아 있기 때문에 그라데이션의 상단에서 죽은 세포를 기음.
7. 30 ML 따뜻한 윌리엄의 전체 매체에 세포 펠렛을 일시 중단하고 원심 분리를 반복 20 ML 따뜻한 윌리엄의 전체 매체에 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
8. hemocytometer를 사용하여 세포 현탁액 내에서 세포를 카운트하고 trypan 블루 염색법에 의해 세포 생존을 결정합니다.

4. Hepatocyte 문화

1. 원하는 농도에 대한 따뜻한 윌리엄의 완전한 매체로 세포를 희석, 예를 들어 2.5 × 10 ⁵ 세포 / ML. 세포 배양 접시에 원하는 볼륨에서 플레이트 세포, 예를 들어. 5 × 10 ⁵ 세포 / 2 ML / 음, 6 웰스 / 판, 또는 2.5 자 × 10 ⁵ 세포 / 1.5 ML / 12 웰스 / 접시. 취소 코팅 플레이트는 간장 세포 배양에 대한 벌금입니다.
2. hepatocytes가 전체 셀 크기로 성장 및 최종 합류를 반환하기위한 충분한 공간을 유지하면서> 85% 가능한 세포를 가진 전형적인 준비에서 세포 밀도는 세포 - 세포 접촉을 허용 약 60~70%의 합류를 도달한다 90~95%.
3. 잘의 중심 영역에서 총체적으로 세포에 대한 경향을 최소화하기 위해, 즉, hepatocytes의도 단일층를 형성하기 위해 (세포 배양기의 공기 흐름 안쪽에 의한 가능성이 높습니다), 접시 안에 남아있게 인큐베이터에 그들을 배치하기 전에 30 분 세포 배양 후드.
4. 문화는 37 전지 95 %의 공기 5 % CO _2의 humidified 분위기 속에서 ° C에서. 4-H 문화 후에는 세포도 동일한 혈청 함유 배지에 남아있을이나 혈청-f 옵션과 함께 매체를 교체ree 매체, 예를 들어 HepatoZYME-SFM (표 1 참조). 혈청이없는 매체는 혈청이없는 배지가 사용되는 호르몬로부터 악영향으로 세포 형태를 유지하는 데 도움이됩니다.
5. 세포 실험에 대한 사전을 복구하고 적어도 하룻밤 성장하도록 허용합니다. 이것이 중요한 효소 (예, P450s)의 기능을 보존하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 우리는 24 시간 이내에 검사를위한 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
6. 필요한 경우, 2 일 간격으로 성장 매체를 교체합니다.

5. 대표 결과

조건은 정기적으로 쥐를 간부터 준비 당 1.0 X 10 ⁸ 세포의 세포 수확을 생성 설명했다. trypan 파랑 제외로 측정 hepatocytes의 생존 능력 88 ~ 96 % 범위 내에서 일관했습니다.

그림 2, 4 시간의 시딩 후 hepatocytes의 집계 및 양식 클러스터에 묘사된. 대부분 절연 세포는 전형적인 단일층 성장에 평평하고 확산. 24 시간으로, 세포의 가장자리가 정의되고, 세포의 표면은 매우 부드럽고이며, 지질 방울은 볼 수 있습니다. 세포 한시 세 세포의 중앙에 위치한 원형이다 nucleoli,,, 그리고 세포 간의 핵 디스플레이 일관성있는 크기 (그림 2)가.

그림 1. 간 재관류의 도표. 18 게이지 angiocath가 간 포털 정맥에 삽입되는 다음 perfusate 튜브는 바늘에 연결됩니다. 성공 cannulation이 확정되면, 하부 대정 맥 (IVC)에서 잘라내기가 유출 허용합니다.

그림 2. 시간이 지남에 따라 교양 hepatocytes (4 시간 ~ 24 시간), 배율 X 200 형태론. 24 시간 동안 배양해 후 세포는 전형적인 단일층 성장에 확산하고, 세포 사이의 분기점은 선형입니다.

시약의 이름	회사	카탈로그 번호
HBSS (CA이없는 이상, MG 2 +)	Invitrogen	14,174
HBSS (CA 2 +, 그리고 MG 2 +)	Invitrogen	14,025
윌리엄스의 중간 E	Invitrogen	12551-032
Collegenase II	워딩턴	LS004176
셀 스트레이너 (100 μm의)	BD	352,360
HepatoZYME-SFM	Invitrogen	17,705
Percoll	시그마	P4937
Angiocath (18 게이지)	BD	381,705

표 1.

Discussion

hepatocytes의 차 문화가 널리 간 생리와 병리의 다양한 측면을 연구하는 데 사용되는 체외 모델입니다. 예를 들어, 주 문화는 P450 cytochromes, 약물 대사, 약물 - 약물 상호 작용 및 세포 독성 및 genotoxicity ^3-7의 메카니즘을 포함한 마약 metabolizing 효소의 표현과 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 쥐의 간장 세포의 격리와 문화를 설명하는 프로토콜은 ^8. Aiken 외의 이전 보고서에서 적응하고, 수정 다른 ^{2,9,10있다.} 조건은 지속적으로 1.0으로 가능한 hepatocytes를 생성 × 10 88 ~ 96% 사이의 세포 생존 능력과 준비 과정 당 ⁸ 세포. 설명 다음은 기타 중요한 단계이다 :

1. 세포 배양을 설명하는 모든 프로토콜과 마찬가지로 가장 중요한 측면은 엄격한 무균 기술에게 ^11을 사용하여 세균이나 곰팡이 병원균의 오염을 방지하는 것입니다.
2. Desmosome 또한 망막의 황반 adherens로 알려진, 휴대 전화 부착을위한 전문 세포 구조이다. desmosome의 무결성은 칼슘이되어 있어야하고, 그것은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 칼슘이없는 매체별로 세분화됩니다. 효소 collagenase는 절연 간장 세포로 이어지는, desmosome을 떼어 놓다 수 있습니다. 따라서 재관류는 칼슘 ^2를 사용합니다 ⁺ 무료 매체와 이후 칼슘 ^{2 +} 풍부한 매체 칼슘 ^2에 포함된을 ⁺ 종속 collagenase를 소화를 위해.
3. 적절한 collagenase 치료는 hepatocyte 준비 절대적으로 중요합니다. Perfussion 버퍼 II 플러스 collegenase II의 유속은 25 ML / 분에 보관해야합니다. 실패 hepatocyte 문화의 일반적인 원인은 다음과 같습니다 inadequately 37 ° C 및 / 또는 느린 관류 속도로 예열 재관류 버퍼로 인해있을 수 1) 가난한 세포 분리, 및 2) 세포 죽음, coulD 과도한 collagenase의 소화로 인해 수 있습니다.
4. 피펫만이 아니라 측면 아래로, 그리고 결코 직접적으로 세포의 위에, 최초의 4-H 문화 이후에 미디어를 변경할 때 hepatocytes 여전히 상대적으로되기 쉽고 쉽게 손상되거나 직접적인 접촉에 의해 중단될 수 수 있으므로,주의하십시오.