L'isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Summary

Hépatocytes primaires constituent un outil précieux pour évaluer biochimiques, moléculaires fonctions, et métabolique dans un système physiologiquement pertinente expérimentale. Nous décrivons un protocole fiable pour le rat en perfusion du foie in situ, ce qui génère constamment hépatocytes viables jusqu'à à 1,0 × 10

Abstract

La culture des hépatocytes primaires est un outil précieux qui a été largement utilisé dans la recherche fondamentale de la fonction hépatique, la maladie, la physiopathologie, la pharmacologie et autres sujets connexes. La méthode basée sur la perfusion de collagénase en deux étapes pour l'isolement des hépatocytes intacts a été introduite par Berry et ami en 1969 ¹ et, depuis lors, a subi de nombreuses modifications. La technique la plus couramment utilisée a été décrite par Seglenin 1976 ^2. Essentiellement, les hépatocytes sont dissociées de rats adultes anesthésiés par une perfusion de collagénase non-recirculation par la veine porte. Les cellules isolées sont ensuite filtrée à travers un 100 um de taille des pores du filtre en nylon de maille, et mis en culture sur des plaques. Après 4 heures de culture, le milieu est remplacé par du milieu contenant du sérum ou sans sérum, par exemple HepatoZYME-GDF, un délai supplémentaire pour la culture. Ces procédures nécessitent des étapes de la culture chirurgicales et stérile qui peut être mieux démontrée par la vidéo que par le texte. Havant, nous documentons les étapes détaillées pour ces procédures à la fois par la vidéo et protocole écrit, ce qui permet de manière cohérente dans la génération des hépatocytes viables dans de grands nombres.

Protocol

1. Préparation

Tous les tampons sont fraîchement préparés en utilisant une technique stérile et stérilisé par filtration à l'aide d'un filtre Corning um 0,22.

1. Préparer perfusion je tampon en ajoutant ce qui suit à la solution saline équilibrée de Hank (HBSS, sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +,} voir le tableau 1): Mg ^{2 +} (MgCl ₂₎ à 0,9 mM, EDTA à 0,5 mM, et HEPES à 25 mM.
2. Préparer un tampon de perfusion II en y ajoutant ce qui suit à HBSS (avec Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +,} voir le tableau 1): HEPES à 25 mM.
3. Préparer un tampon de perfusion II plus collagenaseII: Dissoudre la collagénase II (1000 U) avec 300 ml de tampon de perfusion II et de garder la solution chaude dans l'eau dans la baignoire avant la perfusion. Cette solution doit être utilisée dans les 30 minutes parce que l'activité de la collagénase II, a diminué avec le temps.
4. Préparer le milieu complet de Guillaume: Ajoutez la ligne suivanteà E moyen Williams: L-glutamine 2 mM, sérum de veau fœtal (FBS) à 5%, l'insuline à 100 nM, la dexaméthasone à 100 nm, la pénicilline à 100 UI / ml et de streptomycine à 100 mg / ml.
5. Ces tampons doivent être chauffés pendant 30 minutes dans le bain-marie à 42 ° C, une température optimale correspondant à une température de sortie à la canule de 37 ° C.

2. Perfusion Rat pour l'isolement du foie

1. Le système de perfusion se compose de la pompe, autoclavable tube silastic et un bain d'eau (voir Figure 1). Pré-régler le débit de la pompe de perfusion péristaltique à 10 ml / min.
2. Anesthésier un rat adulte (300 g de poids corporel) avec intrapéritonéale (ip) kétamine (87 mg de poids corporel / kg) ainsi que la xylazine (13 mg / kg). Profondeur de l'anesthésie doit être surveillée par pincement de l'orteil. Lorsque le rat ne répond plus aux stimulus nociceptif, raser les poils du ventre et de préparation de l'abdomen avec de la Bétadine et l'éthanol. Entrez par une incision médiane.
3. Exposerla veine porte hépatique en prenant soin de déplacer le viscères à l'extérieur, à droite de la cavité abdominale, et insérer une angiocath de calibre 18 dans la veine porte hépatique (voir Figure 1).
4. Raccordez le tuyau perfusat à l'aiguille et de lancer la perfusion in situ à un débit faible (10 ml / min) avec pré-chauffée (37 ° C) tampon de perfusion je.
5. S'il est effectué correctement, le foie doit instantanément commencer à blanchir. Une fois canulation réussie est confirmée, faire une coupe à la veine cave inférieure (VCI) pour permettre à efflux (Figure 1). Un autre test pour la canulation réussie peut être réalisée en appliquant une légère pression avec un tampon stérile sur la veine cave inférieure; tous les lobes du foie devraient rapidement commencer à gonfler.
6. Augmenter le débit à 25 ml / min. Le foie doit être de couleur pâle.
7. Mettez la solution de perfusion à la perfusion de tampon II, plus de la collagénase II sans interruption de la circulation pendant 6 minutes supplémentaires.
<li> périodiquement (5-10 fois lors de la digestion) appliquer une pression avec un tampon à l'IVC pour 5 secondes d'intervalle. Le foie se gonflent, conduisant à la dissociation accrue des cellules hépatiques, à son tour réduire le temps de digestion totale, et en augmentant le rendement final.
8. Après perfusion de collagénase, le foie doit commencer à regarder en bouillie. Disséquer le foie libre, dans un bécher de pré-réfrigérés stérile avec 20 ml de milieu complet de Guillaume, puis le prendre à la hotte de la culture des tissus cellulaires.

3. Isolement des hépatocytes

1. Dans la hotte de culture cellulaire, utiliser un grattoir à cellules en douceur disperser les cellules dans un milieu complet de Guillaume dans un boîte de Pétri stérile.
2. Filtrer la dispersion des cellules à travers une 100 um taille de cellule crépine pores dans un tube conique de 50 ml pour retirer les tissus conjonctifs et des fragments de tissus non digérées.
3. Suspendre les cellules dans 40 ml de milieu complet de William et centrifuger à 50 xg pendant 3 min à 4 ° C.
4. Aspirer le surnageant etdoucement remis en suspension les cellules dans un milieu complet 40 ml froid William à laver les cellules. Répétez centrifugation.
5. Aspirer le surnageant, et doucement remis en suspension les cellules avec 25 ml de milieu complet de William. Ajouter 25 ml de solution de Percoll 90% dans du PBS dans le tube et mélanger délicatement.
6. Centrifuger à 200 xg pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer les cellules mortes de la partie supérieure du gradient parce que les cellules viables restent au bas de l'gradient de Percoll.
7. Suspendre le culot cellulaire dans 30 ml de milieu chaud William complète, puis répétez la centrifugation et remettre en suspension le culot cellulaire dans 20 ml de milieu chaud William complète.
8. Compter les cellules dans la suspension cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre et de déterminer la viabilité cellulaire par coloration au bleu trypan.

4. Culture des hépatocytes

1. Diluer les cellules avec du milieu complet chaude de William à la concentration préférée, par exemple 2,5 x 10 ⁵ cellules / ml. Cellules de la plaque à un volume souhaité sur plaques de culture cellulaire, par exemple. 5 x 10 ⁵ cellules / 2 ml / puits, 6 puits / plaque; ou 2,5 x 10 ⁵ cellules / 1,5 ml / puits, 12 puits / plaque. Un plaque revêtue est très bien pour des cultures de cellules hépatiques.
2. Dans une préparation typique avec> 85% de cellules viables, la densité cellulaire devrait atteindre environ 60-70% de confluence, ce qui permet de contact cellule-cellule tout en conservant suffisamment d'espace pour les hépatocytes de croître à leur taille de la cellule complète et donner un confluent de la finale 90-95%.
3. Afin de former une monocouche même des hépatocytes, en d'autres termes, pour réduire au minimum la tendance pour les cellules à se regrouper dans la zone centrale du bien (probablement dû à l'intérieur de l'air de la cellule incubateur), permettre aux plaques de rester à l'intérieur le capot de culture cellulaire pendant 30 minutes avant de les placer dans un incubateur.
4. Culture des cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée d'air de 95% et 5% de CO _2. Après 4-h culture, les cellules peuvent soit rester dans le même milieu contenant du sérum ou de remplacer le milieu avec sérum-free moyenne, par exemple HepatoZYME-GDF (voir tableau 1). Le milieu sans sérum aide à maintenir la morphologie des cellules, sans effets néfastes d'hormones quand un milieu sans sérum est utilisé.
5. Laisser les cellules de récupérer et de se développer au moins une nuit avant l'expérimentation. Nous vous recommandons d'utiliser les cellules pour le test dans les 24 heures parce que cela peut aider à préserver la fonction des enzymes essentiels (par exemple, P450).
6. Remplacez le milieu de croissance à 2 jours d'intervalle, si nécessaire.

5. Les résultats représentatifs

Les conditions décrites générer régulièrement les récoltes de cellules de 1,0 x 10 ⁸ cellules par la préparation de l'un foie de rat. La viabilité des hépatocytes mesurées par exclusion du bleu trypan a été constamment au sein de la gamme de 88 ~ 96%.

Comme le montre la figure 2, l'ensemble des hépatocytes et de cluster sous forme après 4 h d'ensemencement. La plupart des cellules isolées aplatir et la propagation de la croissance monocouche typique. Par 24 h, les bords de cellules sont définis, la surface de cellules est relativement lisse, et les gouttelettes lipidiques sont visibles. Les cellules ont un à trois nucléoles, qui sont ronds, situés au centre des cellules, et la taille d'affichage des noyaux cohérente entre les cellules (Figure 2).

Figure 1. Un diagramme de la perfusion du foie. Un angiocath de calibre 18 est inséré dans la veine porte du foie, un tube perfusat est relié à l'aiguille. Une fois canulation réussie est confirmée, faire une coupe à la veine cave inférieure (VCI) pour permettre à efflux.

Figure 2. Morphologie des hépatocytes cultivés au fil du temps (4 h à 24 h), grossissement x 200. Après culture pendant 24 heures, les cellules réparties de la croissance monocouche typique, et les jonctions entre les cellules sont linéaires.

Nom du réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue
HBSS (sans Ca 2 + et Mg 2 +)	Invitrogen	14174
HBSS (avec Ca 2 + et Mg 2 +)	Invitrogen	14025
Milieu E Williams	Invitrogen	12551-032
Collegenase II	Worthington	LS004176
Cellule de filtrage (100 um)	BD	352360
HepatoZYME-GDF	Invitrogen	17705
Percoll	Sigma	P4937
Angiocath (calibre 18)	BD	381705

Tableau 1.

Discussion

Culture primaire d'hépatocytes est un modèle in vitro largement utilisée pour étudier divers aspects de la physiologie et la pathologie du foie. Par exemple, la culture principale est utilisée pour évaluer l'expression et la fonction de enzymes métabolisant les médicaments, y compris cytochromes P450, métabolisme des médicaments, des interactions médicamenteuses, et les mécanismes de cytotoxicité et la génotoxicité ^3-7. Le protocole décrivant l'isolement et la culture de cellules hépatiques de rat est adapté à partir des précédents rapports de Aiken et al. ^8, et d'autres ^2,9,10 avec des modifications. Les conditions décrites constante générer hépatocytes viables jusqu'à 1,0 x 10 ⁸ cellules par la préparation avec la viabilité des cellules entre 88 ~ 96%. Ce qui suit sont les autres étapes critiques:

1. Comme avec n'importe quel protocole décrivant la culture cellulaire, l'aspect le plus critique est d'éviter la contamination par des pathogènes bactériens ou fongiques en utilisant des techniques aseptiques strictes ^11.
2. Desmosome, également connu sous le nom macula adherens, est une structure cellulaire spécialisée pour la cellule à cellule d'adhérence. L'intégrité de la desmosome a besoin de calcium, et il est décomposé par l'EDTA et le calcium-médias libres. La enzymes collagénase peut dissocier le desmosome, conduisant à des cellules hépatiques d'isolement. Par conséquent, la perfusion de Ca ^{2 +} utilise un milieu exempt de et par la suite de Ca ^{2 +} milieu riche contenant Ca ^{2 +} dépendante de la collagénase, pour la digestion.
3. Traitement à la collagénase appropriée est absolument crucial pour la préparation des hépatocytes. Le débit de Perfussion tampon II II plus collegenase devrait être maintenue à 25 ml / min. Les causes courantes de la culture des hépatocytes échec incluent: 1) pauvre cellule de dissociation, ce qui pourrait être due à des tampons de perfusion insuffisamment chauffées à 37 ° C et / ou la vitesse de perfusion lente, la mort cellulaire et 2), qui could être due à la digestion de la collagénase excessive.
4. Soyez prudent lorsque vous changez les médias après la première des 4-H de la culture, comme les hépatocytes sont encore relativement fragile et peut facilement être endommagé ou perturbé par contact direct; seule pipette sur le côté du bien, et jamais directement sur le dessus des cellules.