Summary
このビデオプロトコルは、細胞分裂の頻度に基づいて、ヒト神経膠芽腫の細胞の異なるサブ集団の同定と分離するための蛍光色素カルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE）のアプリケーションを示しています。
Abstract
腫瘍の不均一性は、腫瘍の堅牢性を支える基本的な特徴を表しており、治療戦略1の発展に中心的な障害となる。腫瘍の不均一性の問題を克服するためには、特定の疾患の病態を推進し、臨床的に関連するターゲットを表す腫瘍集団の表現型、（エピ）の遺伝的および機能的同定および特徴付けを可能にするアッセイおよびツールを開発することが不可欠である。それは、腫瘍は細胞分裂の周波数の異なる細胞の異なる亜分画を示すこと、および低速サイクリングという機能的な基準を積極的に脳を含めたいくつかの癌における腫瘍形成能力に関連付けられていることを今では十分に確立されている乳房、皮膚、膵臓ならびに白血病2-8。蛍光色素カルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE）は、in vitroおよび血液媒介トンを用いたin vivo での細胞の分裂頻度を追跡するために使用されてきたumorsや膠芽腫などの固形腫瘍2,7,8。 CFSEの細胞透過性の非蛍光プロドラッグは、安定したアミド結合9を形成する細胞内のアミン基とのスクシンイミジル部分との反応によってタンパク質と共有結合することにより細胞内に保持される蛍光化合物に細胞内エステラーゼによって変換されます。蛍光染料が均等にすべての細胞分裂による蛍光強度の半減につながる、部門により娘細胞の間で分配される。これは、部門10の8〜10ラウンドまでの細胞周期の周波数のトラッキングが可能です。 CFSE保持能力は、癌幹細胞活性2に濃縮されることが実証遅いサイクリング亜集団（上位5％の色素保持する細胞）を同定し、単離する脳腫瘍細胞で使用されました。
このプロトコルは、人間の文化の中でglio CFSEで細胞を染色する技術と、個々の集団の単離を記載芽腫（GBM）の由来のフローサイトメトリー2を使用して異なる分裂速度 を有する細胞。技術はCFSE標識を保持する能力によって細胞の脳腫瘍スローサイクリング人口を同定および単離するのに役立っています。
Protocol
1。膠芽腫単一の細胞懸濁液を準備する
- Gliomasphere文化は前述の2,11,12のようにニューロスフィアアッセイ（NSA）を使用して確立され、維持されます。
- gliomaspheresを継代するための適切な時期に、球を含む培地を除去し、適切なサイズの滅菌組織培養チューブに入れ、室温で5分間800回転（110 g）で遠心分離した。
- 上清を廃棄し、球のペレットを、0.05％トリプシン-EDTA 1mlに再懸濁し、37℃で3〜5分間水浴中でインキュベートする。
- 大豆トリプシンインヒビターの等量はその後トリプシン活性を停止するために使用されています。
- 細胞懸濁液を穏やかにトリプシン活性の均質性と完全な中和を確実にするために上下にピペッティングします。
- 細胞懸濁液を再び5分間800rpmで遠心分離する。上清を除去し、細胞をNeuroCultの1ミリリットル中に再懸濁されるNSCの基礎培地。
- 単細胞懸濁液の10μlのは、細胞数を数えるために、トリパンブルー90μlと混合される。
2。携帯トレースカルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE）緑色蛍光色素で染色
- 染色されたように各1万個の細胞では、染色試薬1mlを5μMの最終染色濃度を与えるためにNeuroCult NSC基礎培地1mlに5 MM細胞トレースCFSE色素（Molecular Probes社、Invitrogen社製）1μlを添加することにより調製される。
- 細胞を含む染色試薬が均一になるまで十分に混合し、10分間室温でインキュベートする。
- インキュベーションの間、氷のように冷たいNeuroCult NSCの基礎培地は、急冷溶液として調製されています。
- 染色プロセスを停止するには、氷のように冷たい焼入れ液の約5-10ボリュームがロードされたのCFSE細胞に添加される。
- 次いで、この溶液を5分間800rpmで遠心分離し、上清を廃棄する。
- 目でポイントは、染色が正常に行われたことを示す、色の鮮やかな緑の色合いでチューブの底に細胞のペレットが表示されるはずです。
- 細胞は、5分と上清を廃棄し800rpmで遠心分離、新鮮NeuroCult NSC基礎培地中1-2 mlにペレットを再懸濁することにより洗浄する。この手順を3回洗浄し、合計で繰り返されます。
- 第三洗浄後、細胞をNeuroCult NSC基礎培地と細胞数行われ1mlに再懸濁する。
- CFSE染色された細胞は、その後、[50,000細胞/ ml]を適切な密度で滅菌組織培養フラスコに播種し、37℃/ 5％CO2の加湿インキュベーター内に配置されます。
3。 CFSEローディング検証
- NSAの文化に播種した細胞をCFSE染色を検証するための蛍光顕微鏡下で監視することができます。この段階では、すべてのセルは明るい緑色（ 図1）を示す。から細胞懸濁液の代わりに、ドロップCFSE染色した細胞を顕微鏡スライド上に配置し、蛍光顕微鏡下で細胞を可視化するためにカバーガラスで覆われている可能性があります。
- 成功したCFSE標識はさらに、フローサイトメトリーを介して確認された。各グループ1から5×10 5個の細胞のように多くはCFSE染色の検証のために十分である。 CFSEロードされた細胞と無負荷陰性対照細胞を500μlの合計ボリュームに対して、1つのx-PBSまたはNeuroCult NSC基礎培地中に再懸濁させ、それぞれ別々のFACSチューブ内に配置されます。
- フローサイトメーターは、関連パラメータのためにそのユーザーマニュアルの指示に基づいて調整される。 CFSEは492 nmと517 nmの発光極大波長の励起極大を有する。
- まず、アンロードされたコントロール細胞が実行され、取得されたイベントは、前方および側方散乱光（FSC対SSC）とヒストグラムプロットに記録され、主細胞集団（ 図2A）ゲートされます。
- 同様に、CFSEロードされた細胞は、同じパラメータを使用して分析されるsコントロール細胞（ 図2B）に使用される。
4。遅い分割の分離蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いた細胞集団[擁すなわちCFSE]を
- 分裂時には、CFSE強度が減少し、hGBM細胞が緑色蛍光強度（ 図3）のさまざまなレベルを示す細胞から構成されているgliomaspheresを形成しています。 gliomaspheresの直径は約150から200ミクロン（約5〜10日で細胞株の成長率に応じてポストCFSEローディング）の平均サイズに達したら、球を含む培地を除去し、適切なサイズの滅菌組織培養に配置され管し、室温で5分間800rpmで遠心分離した。
- 前の手順で説明されて、細胞がアップミリリットル当たり10 7個の細胞の密度で細胞懸濁液を準備するために、細胞数を、PBS中に再懸濁されるような単一細胞懸濁液を調製する。
- アフトerはPBSの適切な音量で細胞を再懸濁し、ヨウ化プロピジウム（PI、Sigma社、500μg/ mlの）は、フローサイトメトリーによってソート/分析した場合、死細胞を除外するために細胞懸濁液の1μl/ mlの濃度で添加される。
- 完全NeuroCult NSC媒体の各1ミリリットルを含む2つの15 mlの滅菌組織培養管はソートが遅い分裂細胞（CFSE保持する細胞）と高速分裂細胞（CFSE希釈細胞）を収集するために使用されます。
- まず、アンロードされた細胞群からの細胞懸濁液を、フローサイトメーターを介して実行されます。
- 細胞（イベント）は、細胞の大部分が流れプロットに含まれるように調整されている前方散乱（FSC）の対側方散乱光（SSC）と両方のパラメーターの電圧パラメータに基づいてプロットされます。
- 死亡または損傷した細胞を排除するために、細胞は、SSCに対し、PIの反応性に基づいてプロットされ、単一の生細胞集団は、PI（負）ゲートされています。
- その後、均一な細胞集団では、fに基づいて選択されorward散乱（FSC）の対側方散乱光（SSC）。
- 均質な単一生細胞集団を対数目盛で設定されたセル周波数対CFSE強度に基づいてヒストグラムにプロットされます。 CFSEレーザー強度は、0〜100の間には負の信号を配置するために調整されます。
- 同じパラメータと同様のゲーティング戦略を用いて、CFSE標識された細胞は、フローサイトメーターを介して実行されており（ 図4C）を分析。
- その後、細胞を、全体的な人口の遅い割る人口は（速く分裂している細胞）をCFSE（それぞれCFSE 高上位5％とCFSE 低ボトム85％）を保持する能力に基づいて識別されます。
- これらの異なる細胞集団は、その後、完全NSC媒体の1ミリリットルを含む個別の15ミリリットル滅菌組織培養管に分類されます。
- 選別された細胞は、その後、5分間800rpmで遠心分離する。
- 上清を捨て、ペレットを適切に再懸濁するpriate媒体の容量（単離されたイベントまたはペレットの大きさの数に応じて）とセル数が実行されます。
- 異なるソート集団由来の細胞は、その後、適切な滅菌組織培養フラスコ内のミリリットル当たり50,000個の細胞を播種し、連続的に継代または下流の実験のために使用される前に5-10日を37℃/ 5％CO2の加湿インキュベーター内に配置されます。
5。代表的な結果
CFSEをロードした後、すべての細胞が顕微鏡（ 図1）に基づく可視化などの強い緑色蛍光を示す。この緑がかった色があっても肉眼（ビデオ参照）で見ることができます。フローサイトメトリーでこれらの細胞を分析することも、コントロール細胞（ 図2）と比較して非常に強烈な緑色の蛍光を示す。ニューロスフェア培養におけるめっきCFSE細胞読み込まれると、これらの細胞は増殖し、5〜10日間で150から200μmのgliomaspheresを形成している。細胞は、トンを増殖として彼蛍光染料が均等にすべての細胞分裂による蛍光強度の半減につながる、部門により娘細胞の間で分配される。膠芽腫は、機能的に異質であり、異なる時間スケールで増殖している細胞で構成されています。このプロトコールに記載された方法は、それぞれのCFSEを希釈または保持する能力（ 図3、また、ビデオを参照）のおかげで、高速と低速の分裂細胞を同定および単離するために1つを可能にします。
アンロードされた細胞と比較してのCFSEロードされた細胞から生成解離gliomaspheresのフローサイトメトリー分析は、多様なCFSE保持特性（ 図4）を示しています。ファスト分裂細胞（下85％）または低速分裂細胞（上位5％ - 高 CFSE）ニューロスフィアアッセイ条件（ 図5）で培養したときの能力を形成する展示gliomapshere。
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図1解離腫瘍細胞直ちにCFSE色素をロードした後。細胞が正常なラベリングを示す鮮やかな緑色を呈する。元の倍率、10×。
図2：フローサイトメトリーを用いてCFSEローディング確認。）無負荷細胞、B）CFSEは、ロードされた対無負荷の細胞でCFSE蛍光強度を比較すると）細胞とCをロードしました 。標識および非標識細胞との間の蛍光強度の大きさの違いのいくつかの注文があることに注意してください。
図3：6日間めっき後のCFSEロードされた細胞に由来する代表gliomasphere。いくつかの細胞は非常に明るく、CFSE染色を示す。元の倍率、63×。
図5から発生する代表gliomaspheres
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Discussion
研究数の増加は、腫瘍形成、治療抵抗2月8日に貢献癌の細胞の遅い分割するサブコンパートメントの重要性を実証している。したがって、それは別の成長率と集団を比較するために、より一般的に細胞またはこの特定の亜集団の研究を可能にする実験方法を記述し、標準化することが重要です。細胞分裂の彼らの率に基づいて、細胞の亜分画を同定および単離するために、CFSEを使用すると、腫瘍に記載されて異質の我々の理解を進めるために支援し、これらの特定の細胞画分を特徴付ける促進するための出発点です。このプロトコルでは、神経膠芽腫の中で遅い分割母集団を特定し、分離の例を挙げたが、このプロトコルはまた、乳癌、膵臓癌および皮膚癌を含むがこれらに限定されていない他の腫瘍細胞にも適用することができる。これらの集団の下流の解析を行うことができるとFUNCTを含めることができます増殖能2、腫瘍形成能2、治療の区別、（エピ）遺伝的比較を比較ional研究。この方法論はまた、非癌性のシステムで使用することができますおよび体幹/前駆細胞には、例えば、適用することができます。
プロシージャ内の重要な技術ポイントは、適切な密度を確立し、均質な染色を確保するために、トリプシンで細胞の十分な解離、染色培地中の細胞の十分な再懸濁に関与。新たに染色された細胞の小サンプルをガウスのような狭いプロファイル（ 図2B参照）によって特徴付けられる均質なラベリングを確保するために、フローサイトメトリーによってチェックする必要があります。異種の初期標識の場合には、事前にソートがCFSE蛍光の狭い範囲でピーク分解能を向上させるために行うことができます。しかしそれは、この事前ソートし、特定のサイズのために選択していないことを保証すべきである。ヨウ化プロピジウム（PI）の標識の使用がiである生きた細胞を同定するための細胞と死細胞を下流アプリケーションに導入することができますバイアスによるワーキングゲートから破損/デッド人口の除去のためのmportant。それはそのような蛍光色素フィコエリトリン（PE）などのスペクトルに隣接する蛍光色素を使用しているときCFSE標識と他のチャンネルに出血させる可能性の特に高い蛍光強度を注目に値する。それはCFSEと蛍光標識抗体との多重標識実験、買収や分析時に補正処理を必要とするかもしれないことに注意することが重要です。非染色細胞（自家蛍光のレベルを提供する）、単独で染色された細胞や特定の組み合わせを含むすべての必要なコントロールを持っていることを確認してください。 CFSEとの組み合わせで複数の色のラベルは、パシフィック·ブルーまたはアロフィコシアニン（APC）などの蛍光色素で最適に動作します。実験の目的は、定義された期間にわたって細胞分裂の絶対数は、CFSを定量化することである場合Eは平均蛍光強度（MFI）の最初のものは、少なくとも24時間後のCFSEの負荷を2つの異なる時点2の最小値で測定されなければなりません。 CFSE強度は、細胞分裂の非存在下での最初の24時間以内に急激に低下したが、その後安定化し、細胞分裂に関連して減少します。また、細胞分裂に関係しないCFSE強度の減衰のためのベースラインを提供する非増殖性のCFSE負荷された細胞を使用してコントロールを含める必要があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は脳腫瘍研究のためのフロリダセンター、脳腫瘍治療と米国立衛生研究所（NIH）のためにプレストンA.ウェルズ·ジュニア·センター（1R21CA141020-01）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
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