Summary
Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para a identificação e separação de diferentes sub-populações de células em glioblastoma humano com base na frequência de divisão celular.
Abstract
Heterogeneidade tumoral representa uma característica fundamental apoio robustez tumor e apresenta um obstáculo fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas 1. Para superar o problema da heterogeneidade de tumores, que é essencial para desenvolver ensaios e ferramentas que permitam fenotípica, identificação (epi) genéticos e funcionais e caracterização de sub-populações de tumor que conduzem a doenças específicas e patologias representam alvos clinicamente relevantes. Está agora bem estabelecido que os tumores apresentam distintas sub-fracções de células com diferentes frequências de divisão celular, e que os critérios funcionais de ser lento ciclismo está positivamente associado com a capacidade de formação de tumor em vários cancros, incluindo as do cérebro, da mama, pele e pâncreas, bem como leucemia 2-8. O corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) tem sido utilizado para controlar a frequência de divisão de células, in vitro e in vivo em sangue-carregada tumors e tumores sólidos tais como o glioblastoma 2,7,8. A célula-permeante não fluorescente pró-droga é convertido de CFSE por esterases intracelulares para um composto fluorescente, a qual é retida no interior das células por ligação covalente a proteínas através da reacção da sua porção de succinimidilo com grupos amina intracelulares para formar ligações amida estáveis 9. O corante fluorescente é distribuído igualmente entre as células filhas após divisões, conduzindo à redução para metade da intensidade de fluorescência em cada divisão celular. Isso permite o acompanhamento da freqüência do ciclo celular até 8-10 rodadas de divisão 10. Capacidade de retenção de CFSE foi utilizado com células tumorais do cérebro para identificar e isolar uma subpopulação de ciclismo lenta (topo 5% de retenção de corante de células) demonstraram a ser enriquecida em actividade de células do cancro da haste 2.
Este protocolo descreve a técnica de coloração de células com CFSE e o isolamento de populações individuais dentro de uma cultura de GLIO humanoblastoma (GBM) derivadas de células que possuem taxas de divisão diferentes usando citometria de fluxo 2. A técnica tem servido para identificar e isolar uma população de tumor cerebral ciclismo lenta das células por virtude da sua capacidade para reter a rotulagem CFSE.
Protocol
1. Preparando Glioblastoma suspensão de célula única
- Cultura Gliomasphere é estabelecido e mantido utilizando o ensaio neuroesfera (NSA), como descrito anteriormente 2,11,12.
- No momento apropriado para as passagens em gliomaspheres, o meio contendo as esferas é removido, colocado num tubo de cultura apropriado tamanho estéril de tecidos, e centrifugadas a 800 rpm (110 g) durante 5 min à temperatura ambiente.
- O sobrenadante é eliminado eo sedimento de esferas é ressuspenso em 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C num banho de água durante 3-5 min.
- Um volume igual de inibidor de tripsina de soja é, então, utilizado para parar a actividade de tripsina.
- A suspensão celular é suavemente pipetados para cima e para baixo, para assegurar a homogeneidade e a neutralização completa da actividade da tripsina.
- A suspensão de células é novamente centrifugado a 800 rpm durante 5 min. O sobrenadante é removido e as células são ressuspensas em 1 ml de NeuroCultNSC Meio Basal.
- 10 uL da suspensão de célula única é misturado com 90μl de azul de tripano para realizar uma contagem de células.
2. A coloração com celular Rastreamento Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) Verde corante fluorescente
- Por cada 1 milhão de células a ser corado, 1 ml do reagente de coloração é preparado pela adição de 1 ul de 5 mM de corante CFSE celular Trace (Molecular Probes, Invitrogen) a 1 ml de Meio NeuroCult NSC Basal para dar uma concentração final de coloração com 5 uM .
- O reagente de coloração que contém as células é bem misturada até à homogeneidade e incubados à temperatura ambiente durante 10 min.
- Durante a incubação, gelada NeuroCult Meio Basal NSC é preparada como a solução de têmpera.
- Para interromper o processo de coloração, aproximadamente 5-10 volumes de solução gelada de extinção é adicionado às células CFSE-carregados.
- A solução é, então, centrifugadas a 800 rpm durante 5 min e o sobrenadante é descartado.
- Ao ªÉ ponto, deve aparecer um pellet de células na parte inferior do tubo com um matiz brilhante de verde de cor, indicando a coloração foi bem sucedida.
- As células são lavadas por ressuspensão do sedimento em 1-2 ml de meio fresco NSC NeuroCult Basal, centrifugação a 800 rpm durante 5 min e descartando o sobrenadante. Este procedimento é repetido para um total de três lavagens.
- Após a terceira lavagem, as células são ressuspensas em 1 ml de NeuroCult Meio Basal NSC e uma contagem de células é realizada.
- As células CFSE coradas são então semeadas em frascos de cultura de tecidos estéreis, a uma densidade adequada [50000 células / ml] e colocados em uma de 37 ° C / 5% de CO2 incubadora humidificada.
3. Verificação Carregando CFSE
- As células plaqueadas em cultura NSA pode ser monitorizado sob um microscópio de fluorescência para verificar a coloração CFSE. Nesta fase, todas as células exibem cor verde brilhante (Figura 1). Alternativamente, uma gota da suspensão de células a partir deCFSE células coradas pode ser colocado sobre uma lâmina de microscópio e coberta com uma lamela para visualizar as células sob um microscópio fluorescente.
- Rotulagem CFSE sucesso é ainda confirmada por meio de citometria de fluxo. Tal como muitos como 1-5 x 10 5 células de cada grupo são suficientes para a verificação de coloração CFSE. O CFSE células carregadas e descarregadas células de controlo negativo, respectivamente, são de novo suspensas em 1 x PBS-ou NeuroCult Meio Basal NSC para um volume total de 500 ul e colocados em tubos separados FACS.
- O citômetro de fluxo é ajustada com base em suas instruções manual do usuário para os parâmetros relacionados. CFSE tem um máximo de comprimento de onda de excitação de 492 nm e um máximo de emissão de 517 nm.
- Em primeiro lugar, as células de controlo não carregados são executados e os eventos adquiridos são registadas em dispersão frontal e lateral (FSC vs SSC) e histograma, e a população de células principal está fechado (Figura 2A).
- Do mesmo modo, as células CFSE carregados são analisados usando o mesmo parâmetros utilizados para as células de controlo (Figura 2B).
4. O isolamento do Slow-divisão [CFSE ie Retenção] População de células utilizando separação de células activada fluorescente (FACS)
- Após a divisão, a intensidade é reduzida e CFSE células hGBM formar gliomaspheres que são compostos de células que exibem diferentes níveis de intensidade de fluorescência verde (Figura 3). Quando os gliomaspheres ter atingido um tamanho médio de cerca de 150-200 um de diâmetro (cerca de 5 a 10 dias pós-carregamento CFSE dependendo da taxa de crescimento da linha de células), o meio contendo as esferas são removidas, colocadas em cultura de tecido apropriado um tamanho estéril tubo, e centrifugadas a 800 rpm durante 5 min à temperatura ambiente.
- A suspensão de célula única é preparado como descrito nas etapas anteriores e as células são ressuspensas em PBS para uma contagem de células, a fim de preparar uma suspensão de células com uma densidade de até 10 7 células por mililitro.
- À réer ressuspensão das células num volume apropriado de PBS, iodeto de propídio (PI, Sigma, 500 ug / ml) é adicionado a uma concentração de 1 ul / ml de suspensão de células para excluir as células mortas quando ordenadas / analisados por citometria de fluxo.
- Dois tubos de 15 ml de tecido estéreis cultura de cada 1 ml contendo de completa Médio NSC NeuroCult é usado para coletar as células ordenadas lento divisórias (células CFSE de retenção) e as células de divisão rápida (células CFSE diluição).
- Em primeiro lugar, a suspensão de células a partir do grupo de células descarregado é executado através do citómetro de fluxo.
- As células (eventos) são traçados com base em dispersão frontal (FSC) versus dispersão lateral (SSC) e parâmetros de tensão de ambos os parâmetros são ajustados de modo que a maioria das células são incluídos no fluxo de trama.
- Para excluir as células mortas ou danificadas, as células são traçados com base na reactividade contra SSC PI ea população única célula viva (PI negativo) é fechado.
- Em seguida, uma população de células homogéneas é seleccionado com base na fdispersão orward (FSC) e lado de dispersão (SSC).
- A população de células homogéneas único vivo é em seguida representados num histograma com base na frequência de células versus intensidade de CFSE definido em uma escala logarítmica. A intensidade do laser CFSE é ajustada por forma a colocar o sinal negativo entre 0 e 100.
- Utilizando os mesmos parâmetros e uma estratégia de gating semelhante, as células CFSE rotulados são executados por meio da citometria de fluxo e analisadas (Figura 4C).
- Subsequentemente, uma população de células de divisão lenta e uma população total (células que se dividem mais rapidamente) são identificados com base na sua capacidade de reter CFSE (CFSE alta superior a 5% e inferior CFSE baixa de 85%, respectivamente).
- Estas populações de células diferentes são então classificadas em diferentes tubos de 15 ml de tecidos estéreis de cultura contendo 1 mL de meio completo NSC.
- Células seleccionadas são então centrifugadas a 800 rpm durante 5 min.
- O sobrenadante é eliminado eo sedimento é ressuspenso em um adeo volume adequado de meio (dependendo do número de eventos isolados ou tamanho pellet) e uma contagem de células é realizada.
- As células a partir das diferentes populações classificadas são então colocadas em placas a 50.000 células por mililitro, em um frasco de cultura de tecido estéril apropriado e colocadas numa 37 ° C / 5% de CO2 incubadora humidificada durante 5-10 dias, antes de ser passado seriadamente ou utilizados em experiências a jusante.
5. Resultados representativos
Após o carregamento CFSE, todas as células apresentam uma fluorescência verde intensa como visualizada ao microscópio (Figura 1). Esta cor esverdeada pode ser visto até mesmo a olho nu (veja o vídeo). Analisando estas células por citometria de fluxo também mostra muito intensa fluorescência verde em comparação com células de controlo (Figura 2). Após células em placas de cultura CFSE carregados neuroesfera, estas células proliferam e formam gliomaspheres 150-200 uM em 5-10 dias. À medida que as células proliferam, t ele corante fluorescente é distribuído igualmente entre as células filhas após divisões, conduzindo à redução para metade da intensidade de fluorescência em cada divisão celular. Glioblastomas são funcionalmente heterogéneas e são compostos de células que proliferam em diferentes escalas de tempo. O método descrito no presente protocolo permite identificar e isolar rápida e lenta de células em divisão, em virtude da sua capacidade de diluir ou reter CFSE, respectivamente (Figura 3, ver também o vídeo).
A análise de citometria de fluxo de gliomaspheres dissociadas gerados a partir de CFSE células carregadas, em comparação com células não carregados demonstra as propriedades de retenção de CFSE diversas (Figura 4). Células em divisão rápida (85% inferior) ou lentas as células em divisão (a 5% do topo - CFSE alta) gliomapshere exibem capacidade de formação, quando cultivadas nas condições do ensaio neuroesfera (Figura 5).
gura 1 "/>
Figura 1. Células tumorais dissociadas imediatamente após carregamento com corante CFSE. As células apresentam cor verde brilhante demonstrando rotulagem sucesso. Ampliação original, 10 x.
Figura 2. Confirmação CFSE carregamento utilizando citometria de fluxo. A) CFSE células descarregado, B) carregados células e c) comparação da intensidade de fluorescência em células CFSE carregados contra descarregado. Note-se que há várias ordens de magnitude diferença na intensidade de fluorescência entre as células marcadas e não marcadas.
Figura 3. Um representante gliomasphere derivada de uma célula CFSE-loaded 6 dias após o plaqueamento. Algumas células apresentam coloração CFSE muito brilhante. Ampliação original; 63 x.
Figura 4. Representante de citometria de fluxo / parcelas histogramas para o isolamento rápido e lento de células em divisão 6 dias após coloração com CFSE. A) FSC vs SSC para mostrar a população de célula inteira, B) versus reactividade SSC PI para excluir as células mortas ou danificadas, C) FSC vs SSC a porta de uma população homogénea de células vivas, D) demonstra a presença de células CFSE retenção 6 dias após a rotulagem CFSE como evidenciado por uma maior intensidade de fluorescência em comparação com o controlo negativo. O histograma mostra que a intensidade CFSE deteriorado ao longo do tempo. E) Histograma mostrando a estratégia modular para identificar as células de fixação (CFSE top 5%) e as células CFSE diluição inferior (85%).
Figura 5. Gliomaspheres representativos gerados a partir de
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Um crescente número de estudos demonstraram a importância de uma lenta dividindo compartimento sub-células de cancro em que contribuem para a formação de tumores e resistência ao tratamento 2-8. Por isso, é crítico para descrever e padronizar os métodos experimentais que permitem o estudo desta subpopulação específica de células ou, mais geralmente para comparar as subpopulações com diferentes taxas de crescimento. Usando CFSE para identificar e isolar sub-fracções de células com base na sua taxa de divisão celular é um ponto de partida para promover a caracterização destas fracções celulares específicas, contribuindo para uma melhor compreensão da heterogeneidade descritos em tumores. Neste protocolo, deram o exemplo de identificação e isolamento de uma população de baixa divisória dentro glioblastoma, mas este protocolo pode também ser aplicada a outras células de tumores, incluindo e não se limitando a cancros da mama do pâncreas, e da pele. Análise a jusante dessas populações podem ser realizados e podem incluir functional estudos comparando potencial proliferativo 2, a capacidade de formação de tumor 2, sensibilidade, tratamento e (epi) comparações genéticas. Esta metodologia pode também ser utilizada com sistemas de não-cancerosas e podem ser aplicados, por exemplo, a haste somática / células precursoras.
Pontos críticos de técnicas no procedimento envolveu a dissociação de células adequadas com tripsina e ressuspensão das células suficiente nos meios de coloração para estabelecer uma densidade adequada e assegurar a coloração homogénea. Uma pequena amostra de células coradas frescos devem ser verificadas por citometria de fluxo para assegurar a etiquetagem homogéneo caracterizado por um perfil do tipo Gaussiano estreito (ver Figura 2B). No caso da etiquetagem inicial heterogénea, uma espécie de pré-podem ser realizadas de modo a melhorar a resolução dos picos com gama mais estreita de fluorescência CFSE. No entanto, deve ser assegurado que este tipo pré-não seleciona para tamanhos específicos. A utilização de iodeto de propídio (PI) a rotulagem é important para identificar as células vivas e para morrer / danificado remoção da população, desde a porta de trabalho, devido ao preconceito que as células mortas pode introduzir em aplicações a jusante. Vale a pena notar em particular a intensidade de fluorescência elevada, na rotulagem CFSE e seu potencial para sangrar em outros canais quando se usa fluorocromos vizinhos no espectro, tal como a ficoeritrina fluorocromo (PE). É importante notar que os ensaios multiplex de rotulagem com CFSE e fluorocromo-conjugados de anticorpos podem requerer um processo de compensação para o tempo de aquisição e análise. Certifique-se de ter todos os controles necessários, que incluem células não coradas (fornecendo o nível de autofluorescência), individualmente células marcadas e sua combinação específica. Policromáticos rotulagem em combinação com CFSE funciona melhor com fluorocromos tais como Pacific Blue ou aloficocianina (APC). Se o objetivo do experimento é quantificar o número absoluto de divisões celulares ao longo de um período de tempo definido, o CFSE intensidade média de fluorescência (MFI) tem de ser medida a um mínimo de dois pontos de tempo diferente 2, com a primeira, pelo menos, 24 horas de carregamento CFSE post. Intensidade CFSE cai drasticamente dentro das primeiras 24 horas na ausência de divisão celular, mas depois estabiliza e diminui em relação à divisão celular. Também é necessário incluir um controlo com células não-proliferativas CFSE carregados proporcionando a linha de base para o decaimento de intensidade CFSE não relacionados com a divisão celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Centro de Pesquisa da Flórida tumor cerebral, o Preston A. Wells Jr. Centro de Terapia do tumor cerebral e os Institutos Nacionais de Saúde (1R21CA141020-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
