Summary
Bu video protokol hücre bölünmesi sıklığına göre insan glioblastoma hücreleri farklı alt-popülasyonlarının belirlenmesi ve ayrılması için floresan boya carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) uygulamasını gösterir.
Abstract
Tümör heterojenite tümör sağlamlığı destekleyen temel bir özelliği temsil eder ve tedavi stratejilerinin 1 gelişiminde merkezi bir engel koymaktadır. Tümör heterojenliğin sorunu aşmak için, belirli bir hastalığın patolojiler sürücü ve klinik hedefleri temsil tümörün alt popülasyonlarının fenotipik, (epi) genetik ve fonksiyonel belirlenmesi ve tanımlanması sağlayan deneyleri ve araçlar geliştirmek esastır. Bu, şimdi de tümörleri yavaş bisiklet olma fonksiyonel kriterleri pozitif tümör oluşumu beyin, göğüs, cilt de dahil olmak üzere çeşitli kanser yeteneği ile ilişkili olduğu hücre bölünmesi, farklı frekanslarda bulunan hücrelerin alt fraksiyonlar ayrı göstermektedir ve olduğunun tespit edilmesi pankreas yanı sıra lösemi 2-8. Floresan boya carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) kan yoluyla in vitro olarak T hücrelerinin bölünmesini frekans izlemek için ve in vivo olarak kullanılmıştırumors ve bu glioblastoma 2,7,8 gibi solid tümörler. CFSE, hücre-geçirgenler floresan olmayan pro-ilaç kararlı amid bağı oluşturmak üzere hücre içi 9 amin grupları ile süksinimidil kısmının reaksiyon yoluyla proteinlere kovalent olarak bağlanarak hücre içinde tutulan bir floresan bileşik, içine hücre içi esterazlar ile dönüştürülür. Floresan boya eşit her hücre bölünmesi ile floresans şiddetinin ikiye bölme neden bölünmeler üzerine kızı hücreleri arasında dağıtılır. Bu bölünme 10 sekiz ila on mermi kadar hücre döngüsü frekans izleme sağlar. KAKE tutma kapasitesi kanseri kök hücre aktivitesi 2 zenginleşmektedir gösterdi yavaş bisiklet subpopülasyonu (üst% 5 boya tutucu hücreleri) belirlemek ve yalıtmak için beyin tümör hücreleri ile birlikte kullanılmıştır.
Bu protokol, insan glio kültürü içinde KAKE ile boyanan hücrelerin tekniği ve bireysel nüfus izolasyonu açıklarblastom (GBM)-türetilen akım sitometri 2 kullanarak farklı bölünme fiyatla sahip hücreler. Tekniği tanımlamak ve KAKE etiketleme korumak için onların yeteneği sayesinde hücrelerin beyin tümörü yavaş bisiklet nüfusu izole etmeye hizmet etmiştir.
Protocol
1. Glioblastoma Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması
- Gliomasphere kültür kurulmuş ve daha önce anlatıldığı gibi 2,11,12 neurosphere tahlil (NSA) kullanılarak korunur.
- Gliomaspheres pasajlanmasını için uygun bir zamanda, küre içeren orta boy bir uygun steril doku kültür tüpüne yerleştirilir, silinir, ve oda sıcaklığında 5 dakika için 800 rpm (110 g) santrifüj edilir.
- Yüzer madde ayrılır ve topak küreler% 0.05 tripsin-EDTA, 1 ml içinde tekrar süspanse edilir ve 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca bir su banyosunda kuluçkaya bırakılır.
- Soya fasulyesi tripsin inhibitörü eşit bir hacimde daha sonra tripsin aktivitesini durdurmak için kullanılır.
- Hücre süspansiyonu yavaşça homojenlik ve tripsin aktivitesinin tam nötralizasyonu sağlamak için aşağı yukarı pipetle ve.
- Hücre süspansiyonu yine 5 dakika için 800 rpm'de santrifüje tabi tutulur. NeuroCult 1 ml içinde süpernatant kaldırılır ve hücreler yeniden süspanseMGK Bazal Orta.
- Ve tek hücre süspansiyonu 10μl bir hücre sayımı gerçekleştirmek için tripan mavi 90μl ile karıştırılır.
2. Hücre Trace Carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) Yeşil Floresan Boya ile Boyama
- Lekeli olmak için her 1 milyon hücre için, reaktif boyama 1 ml 5 uM bir nihai konsantrasyon vermek için boyama NeuroCult NSC Bazal Orta 1 ml ila 5 mm hücre izleme CFSE boyası (Molecular Probes, Invitrogen) ve 1 ul ilave edilmesi ile hazırlanır .
- Hücrelerini içeren reaktif boyama homojenliği kadar iyice karıştırılır ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- İnkübasyon sırasında, buz NeuroCult MGK Bazal Orta soğutma çözümü olarak hazırlanmıştır.
- Boyama işlemini sonlandırmak için buz-soğuk su verme çözelti yaklaşık 5-10 hacim CFSE ile yüklenmiş hücrelere ilave edilir.
- Çözelti, daha sonra 5 dakika için 800 rpm'de santrifüje tabi tutulur ve süpernatan atılır.
- At thÖnemli olan, boyanma başarılı olduğunu gösteren bir renk arasında bir parlak yeşil bir renk tonu ile tüpün altına bir hücre peleti orada yer almalıdır.
- Hücreler 5 dk atarak süpernatant için 800 rpm'de santrifüj, taze NeuroCult MGK Bazal Orta 1-2 ml pelet resuspending tarafından yıkanır. Bu işlem üç yıkamadan bir toplam için tekrarlanır.
- Üçüncü yıkamadan sonra, hücreler NeuroCult NSC bazal ortamı ve hücre sayımı yapılır 1 ml içinde tekrar süspanse edilir.
- CFSE lekeli hücreler, daha sonra, uygun bir yoğunluk [50,000 hücre / ml] steril doku kültürü şişeleri içinde kaplanmış ve 37 ° C /% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir.
3. KAKE Yükleniyor Doğrulama
- NSA kültür kaplama Hücreler KAKE boyama doğrulamak için bir floresan mikroskop altında izlenebilir. Bu aşamada, bu hücrelerde parlak yeşil renk (Şekil 1) göstermektedir. Dan hücre süspansiyonu Alternatif olarak, bir damlaKAKE boyanan hücrelerin mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve floresan mikroskop altında hücreleri görselleştirmek için bir lamel ile kaplı olabilir.
- Başarılı KAKE etiketleme fazla akım sitometri yöntemiyle onaylanır. Her gruptan gibi birçok 1-5 x 10 5 hücre KAKE boyanma doğrulama için yeterlidir. CFSE hücreleri ve yüksüz bir negatif kontrol hücreler 1 x PBS-ya da 500 ul toplam hacim için NeuroCult NSC bazal medyum içinde yeniden asıldı ve sırasıyla ayrı FACS tüpler içine yerleştirilir yüklendi.
- Flowsitometri ilgili parametreler için cihazın kullanım kılavuzunu talimatlarına göre ayarlanır. KAKE 492 nm ve 517 nm emisyon, maksimum dalga boyu uyarım maksimum vardır.
- İlk olarak, yüksüz kontrol hücreleri çalıştırmak ve edinilen olayları ileri ve yana saçılım (FSC vs SSC) ve histogram araziler kaydedilir ve ana hücre popülasyonunu (Şekil 2A) işlenir.
- Benzer şekilde, CFSE yüklü hücreler aynı parametre kullanılarak analiz edilirler kontrol hücreleri (Şekil 2B) için kullanılır.
4. Yavaş bölünmesi Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) kullanarak Hücre Nüfus [yani KAKE İstinat] İzolasyonu
- Bölünmesi üzerine, CFSE şiddetinde azalma ve hGBM hücreleri yeşil floresan yoğunluğu farklı düzeylerde (Şekil 3) sergileyen hücreler oluşan gliomaspheres oluşturmak. Gliomaspheres çapı yaklaşık 150-200 mikron (yaklaşık 5 ila 10 gün hücre hattı büyüme hızına bağlı olarak yazılan KAKE yükleme) bir ortalama boyutu vardığınız zaman küre içeren orta uygun büyüklükte steril doku kültürü yerleştirilir, çıkarılır tüp, ve oda sıcaklığında 5 dakika için 800 rpm'de santrifüjlenmiştir.
- Önceki basamakta anlatılan ve hücrelerin mililitrede 10 7 hücreleri için bir yoğunluğu olan bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir hücre sayımı için PBS içerisinde yeniden süspanse edilen bir tek hücre süspansiyonu hazırlanmıştır.
- Kıçtaer PBS uygun bir hacim içinde hücreler resuspending, Propidium iyodür (PI, Sigma, 500 ug / ml), 1 ul / kriteri / akış sitometrisi ile analiz edildiğinde ölü hücreleri çıkarmak için hücre süspansiyonu ml 'lik bir konsantrasyonda ilave edilir.
- Tam NeuroCult NSC Medium içeren 1 ml her biri iki adet 15 ml'lik steril doku kültür tüpleri kriteri yavaş bölünen hücreler (CFSE tutucu hücreleri) ve hızla bölünen hücreler (CFSE seyreltilmesi hücreleri) toplamak için kullanılır.
- İlk olarak, boş hücre gruptan hücre süspansiyonu akış sitometresi ile çalıştırılır.
- Hücreleri (olaylar) hücrelerin çoğunluğu akışı arsa dahil edilir, böylece ayarlanır ileri saçılım (FSC) karşı yan dağılım (SSC) ve her iki parametre için gerilim parametreleri esas çizilir.
- Ölü ya da hasarlı hücrelerin dışlamak için, hücreleri DGM karşı PI reaktivite dayalı çizilen ve tek canlı hücre popülasyonu (PI negatif) işlenir edilir.
- Daha sonra, homojen bir hücre popülasyonu f esas alınarak belirlenirorward saçılım (FSC) karşı yan dağılım (SSC).
- Homojen tek canlı hücre popülasyonu sonra logaritmik bir ölçekte belirlenen hücre Frekans karşı KAKE yoğunluğuna dayalı bir histogram çizilir. KAKE lazer yoğunluğu 0 ile 100 arasında negatif sinyal yerleştirmek için ayarlanır.
- Aynı parametreleri ve benzer bir yolluk stratejiyi kullanarak, KAKE etiketli hücreleri akış sitometresinin aracılığıyla çalıştırılır ve (Şekil 4C) incelendi.
- Daha sonra hücreler, ve genel nüfus yavaş bir bölme nüfus (daha hızlı bölünen hücreler) CFSE (sırasıyla CFSE yüksek top% 5 CFSE ile düşük alt% 85), tutma yeteneği temelinde belirlenir.
- Bu farklı hücre popülasyonlarının sonra tam MGK orta 1ml içeren ayrı 15 ml steril doku kültürü tüpler halinde sıralanır.
- Sıralama hücreler daha sonra 5 dakika için 800 rpm'de santrifüjlenir.
- Bir onaylama içinde Yüzer madde ayrılır ve topak yeniden süspansevasatı (izole olaylar ya da topak boyutu sayısına bağlı olarak) ve bir hücre sayımı sürülen uygun hacim gerçekleştirilir.
- Farklı kriteri populasyonlardan Hücreler daha sonra, uygun bir steril doku kültürü şişesi içinde mililitre başına 50.000 hücre de kaplanmış ve seri olarak geçişli veya alt deneylerde kullanılmadan önce, 5-10 gün için, 37 ° C /% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Mikroskop (Şekil 1) altında görüntülendi olarak CFSE Yüklemeden sonra bütün hücreler yoğun bir yeşil floresan sunulmuştur. Bu yeşil renkli renk bile çıplak gözle (videoyu görmek) görülebilir. Akım sitometri ile bu hücrelerin incelenmesi de kontrol hücreleri (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında oldukça yoğun yeşil floresans gösterir. Neurosphere kültür kaplama KAKE yüklü hücreler üzerine, bu hücreler çoğalmaya başlar ve 5-10 gün içinde 150-200 mikron gliomaspheres oluştururlar. Hücreler, t çoğaldıkça O floresan boya eşit her hücre bölünmesi ile floresans şiddetinin ikiye bölme neden bölünmeler üzerine kızı hücreleri arasında dağıtılır. Glioblastomalar işlevsel olarak heterojen olan ve farklı zaman skalası üzerinde çoğalan hücrelerin oluşmaktadır. Bu protokolde tarif edilen yöntem, sırasıyla, seyreltik CFSE ya da tutma yeteneğini (Şekil 3, aynı zamanda video) sayesinde hızlı ve yavaş bölünen hücreleri tanımlamak ve izole etmek için bir olanak sağlar.
Yüksüz hücrelere göre CFSE ile yüklenmiş hücreler elde ayrılmış gliomaspheres akış sitometri analizi çeşitli CFSE tutma özellikleri (Şekil 4) göstermektedir. Hızlı bölünen hücreler (alt% 85) veya yavaş bölünen hücreleri (üst% 5 - KAKE yüksek) neurosphere test koşulları (Şekil 5) kültüre zaman yeteneği oluşturan sergi gliomapshere.
Güre 1 "/>
Şekil 1. Hemen KAKE boya ile yükledikten sonra Disosiye tümör hücreleri. Hücreler başarılı etiketleme gösteren parlak yeşil renk sergilerler. Orijinal büyütme; 10 x.
Şekil 2. Akım sitometri kullanarak KAKE yükleme onay. A) Unloaded hücreleri, B) KAKE yüklenen karşı boş hücrelerde KAKE floresans şiddetinin karşılaştırılması) hücreler ve C yüklenir. Etiketli ve etiketsiz hücreleri arasındaki floresans yoğunluğu büyüklük farkı birkaç emir olduğunu unutmayın.
Şekil 3,. 6 gün sonra kaplama bir CFSE-yüklü hücre türetilmiş bir temsilci gliomasphere. Bazı hücreler çok parlak KAKE boyanması sergilerler. Orijinal büyütme; 63 x.
Şekil 4. Örnek flow sitometri araziler / 6 gün KAKE boyandıktan sonra hızlı ve yavaş bölünen hücrelerin izolasyonu için histogramlar. Ölü veya zarar görmüş hücreleri çıkarmak için bir bütün hücre popülasyonunu göstermek için) FSC vs SSC B) SSC vs PI reaktivitesi, C) Geçide FSC vs SSC homojen bir canlı hücre popülasyonu, D) 6 gün negatif kontrol ile karşılaştırıldığında büyük bir floresan yoğunluğu ile kanıtlandığı gibi KAKE etiketleme sonra KAKE istinat hücrelerinin varlığını gösterir. Histogram da KAKE yoğunluğu) zaman. E içindeki KAKE istinat hücreleri (üst% 5) ve KAKE sulandırarak hücreleri (alt% 85) tespit etmek yolluk strateji görüntüleniyor Histogram çürümüş olduğunu gösterir.
Elde edilen Şekil 5,. Örnek gliomaspheres
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmalar artan bir sayıda tümör oluşumunu ve tedavi direnç 2-8 katkı kanser hücrelerinin bir yavaş alt bölme bölümünün önemini ortaya koymuştur. Bu nedenle, farklı büyüme oranları ile subpopülasyonunun karşılaştırmak için daha genel olarak hücre ya da bu belirli alt populasyonun çalışma deneysel sağlayan yöntemleri açıklanmaktadır ve standartlaştırmak için çok önemlidir. Hücre bölünmesi onların oranı esas alınarak hücre alt fraksiyonlarının belirlemek ve yalıtmak için KAKE kullanma tümörler açıklanan heterojenlik anlayışımızı ilerletmek için yardım, bu spesifik hücresel fraksiyonların karakterize ilerletmek için bir başlangıç noktasıdır. Bu protokolde, tanımlanması ve glioblastoma içinde yavaş bölme nüfus izole örnek verdi, ama bu protokol de dahil olmak üzere, meme, pankreas kanserleri ve deri bunlarla sınırlı olmayan başka tümör hücreleri için de uygulanabilir. Bu populasyonların Akışaşağı analizi yapılabilir ve fonksiyonu içerebilirproliferatif potansiyele 2, tümör oluşumu yeteneği 2, tedavi duyarlılık ve (epi) genetik karşılaştırmalar karşılaştıran ional çalışmaları. Bu yöntem, aynı zamanda, kanser olmayan sistemler ile birlikte kullanılabilir ve somatik kök / öncü hücreler, örneğin, uygulanabilir.
Prosedürü dahilinde Kritik teknik noktalar uygun bir yoğunluk kurmak ve homojen boyama sağlamak için tripsin ile hücrelerin yeterli ayrışma ve boyama medyada hücrelerin yeterli tabanda yer. Taze boyanmış hücrelerin küçük bir örneği, bir Gauss benzeri dar profili (Şekil 2B bakınız) ile karakterize homojen etiketleme sağlamak için flow sitometri ile kontrol edilmelidir. Heterojen ilk etiketleme durumunda, bir ön-tür CFSE floresans daha dar olan uç çözünürlüğünü arttırmak için gerçekleştirilebilir. Ancak bu önceden sıralamak belirli ölçüler için seçmez sağlanmalıdır. Propidium iyodür kullanımı (PI) etiketleme icanlı hücrelerin tanımlanmasında ve ölü hücreleri aşağı uygulamalarda tanıtmak olduğunu önyargı nedeniyle çalışma kapısı hasarlı / ölü nüfus kaldırılması için mportant. Böyle florokrom fikoeritrin (PE) gibi spektrum, komşu florokromlar kullanırken KAKE etiketleme ve diğer kanallar içine kanamaya potansiyelinin özellikle yüksek floresans yoğunluğu fazlalaştı. Bu KAKE ve florokrom-konjuge antikor multipleks etiketleme deneyleri edinimi veya analiz anda bir tazminat süreci gerektirebilir dikkat etmek çok önemlidir. Boyanmamış hücreleri (otofloresans düzeyini sağlayarak) tek başına, boyanan hücreleri ve belirli bir kombinasyonu içeren tüm gerekli kontroller var emin olun. KAKE ile birlikte Çoklu renk etiketleme, Pasifik Mavi veya Allophycocyanin (APC) olarak florokromlar ile iyi çalışır. Deneyin amacı zaman belirli bir süre, CFS üzerinde hücre bölünmeleri mutlak sayısını ölçmek için iseE Floresan Yoğunluğu (MFI) iki farklı zaman en azından ölçülmelidir ilki en az 24 saat sonrası KAKE yükleme ile 2 puan ortalamaları. KAKE yoğunluğu hücre bölünmesi yokluğunda ilk 24 saat içinde ve büyük ölçüde düşer ama sonra stabilize ve hücre bölünmesi ile ilgili olarak azalır. Aynı zamanda, hücre bölünmesi ile ilgili değildir CFSE yoğunluk bozunma için temel sağlayan non-proliferatif CFSE yüklü hücreler içeren bir kontrol dahil etmek gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu eser Beyin Tümörü Araştırma, Beyin Tümörü Tedavi ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (1R21CA141020-01) Preston A. Wells Jr Merkezi Florida Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
