Summary
تصوير الأنسجة الجنينية في الوقت الحقيقي هو تحدي على مدى فترات طويلة من الزمن. نحن هنا يقدم فحص لرصد التغيرات الخلوية وشبه الخلوية في الحبل الشوكي فرخ لفترات طويلة مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية. ويمكن تكييف هذه التقنية في مناطق أخرى من الجهاز العصبي والأجنة النامية.
Abstract
الحبل الشوكي الجنينية يتكون من ركوب الدراجات الخلايا الاولية العصبية التي تؤدي إلى نسبة كبيرة من الخلايا العصبية والدبقية من الجهاز العصبي المركزي (CNS). على الرغم من أن يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية التي نمط الحبل الشوكي والحصول على تمايز الخلايا العصبية 1، 2، أننا نفتقر إلى فهم عميق لهذه الأحداث في وقت مبكر على مستوى سلوك الخلية. وبالتالي فإن من الأهمية بمكان لدراسة سلوك من الأسلاف العصبية في الوقت الحقيقي، لأنها تخضع لتكوين الخلايا العصبية.
في تصوير الماضي في الوقت الحقيقي، من الأنسجة الجنينية في وقت مبكر كان محدودا من قبل خلية / نسيج البقاء في الثقافة، فضلا عن التأثيرات الضوئية من التصوير فلوري. هنا نقدم لفحص جديدة لتصوير الأنسجة مثل لفترات طويلة من الزمن، وذلك باستخدام المجراة سابقا رواية شريحة بروتوكول ثقافة واسعة حقل مضان المجهري (الشكل 1). هذا النهج يحقق طويل الأجل الوقت الفاصل بين رصد كتكوت الجنينية قبينال الخلايا الاولية الحبل مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية.
يجوز تعديل هذا الفحص صورة لمجموعة من الخلايا الجنينية 3، 4 بالإضافة إلى مراقبة السلوكيات الخلوية وشبه الخلوية، ووضع رواية والمراسلين حساسة للغاية للنشاط الجين (على سبيل المثال، يشير الى الشق 5) يجعل من هذا الفحص أداة قوية مع الذي يدل على فهم كيفية تنظيم سلوك الخلية أثناء التطور الجنيني.
Protocol
1. طبق التحضير
- الأطباق المستخدمة في ثقافة شريحة وذات أرضية زجاجية (مع ساترة كقاعدة) (أطباق WillCo). وتوضع هذه في نسيج العدسة في صحن زراعة الأنسجة 6 سم للحفاظ على أسفل الزجاج نظيفة.
- في اليوم قبل التجربة، إضافة 2 مل 0.1٪ بولي-L-يسين حل لصحن زجاج القاع واحتضانها ل5min في درجة حرارة الغرفة للسماح للبولي-L-يسين معطف أسفل الزجاج.
- إزالة بولي-L-يسين حل وشطف ثلاث مرات في الماء deionised، ثم مرة واحدة في الايثانول 70٪.
- ترك ليجف بين عشية وضحاها. ويمكن أيضا أن تجفف أطباق بلطف عن طريق تسخين في الميكروويف على قوة منخفضة ل30-45 ثانية.
2. جنين Electroporation
- احتضان البيض عند 37 درجة مئوية إلى هاميلتون، هامبورغ (سمو) المرحلة 10 (~ 36 ساعة) (أو غيرها من مرحلة الرغبة).
- قبل البدء في إعداد الإبر الزجاج (نستخدم المشتعلة / براون نموذج p87 مجتذب microcapillary) وقطع غيض من needlه باستخدام ملقط غرامة تحت المجهر تشريح. وينبغي في نهاية إبرة تكون حادة بما فيه الكفاية لاختراق الجنين بينما لا يجري ضيق بحيث يعوق حقن الحمض النووي من الحل.
- بيض النافذة وأقطاب مكان (5mm بعيدا) على جانبي الجنين
- حقن الحمض النووي (~ ،025-0،5 ميكروغرام / ميكروليتر في المياه deionised الملونة مع كمية صغيرة من اللون الأخضر سريع) في الأنبوب العصبي.
- تطبيق الحالي - 12-17 الخامس ثلاث مرات، وطول نبض 50ms مع 950 مللي بين النبضات.
- نحن نستخدم تركيزات منخفضة من الحمض النووي والفولتية electroporation منخفض لتحقيق التعبير فسيفساء حتى نتمكن من متابعة الخلايا الفردية.
- تغطي نافذة في قشر البيض مع cellotape والتأكد من انها مختومة.
- السماح للأجنة لاستعادة ل3-4 ساعات أو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
3. الكولاجين وتحضير شريحة متوسطة الثقافة
- إعداد مزيج الكولاجين وشريحة متوسطة الثقافة قبل نحو ساعة من تشريح.
- إلى 300 ر ميكرولتريب] 1 الكولاجين إضافة 100 ميكروليتر 0.1٪ محلول حامض الخليك و 100 ميكروليتر 5 × L15 المتوسط. دوامة جيدا بعد كل إضافة. وينبغي حل اصفرار.
- الآن إضافة 15-20 ميكروليتر بيكربونات الصوديوم 7.5٪، ودوامة تماما. وينبغي أن الحل أصبح وردي قليلا، وحجم بيكربونات الصوديوم اللازمة لهذا قد تختلف. تبقي على الجليد والماكياج جديد في كل مرة.
- إلى 10 مل المتوسطة neurobasal إضافة B-27 والملحق Glutamax، إلى تركيز × 1 نهائي و 10 حل جنتاميسين ميكرولتر.
- مخزنة المتوسطة مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. ترك الجزء العلوي من حاوية فضفاض للسماح لها تتوازن مع CO 2.
4. شريحة الثقافة
- إزالة الأجنة من البيض، وأغسلها في L15 المتوسط.
- مكان في نسيج الثقافة طبق بطبقة من sylgard في أسفل وارجاعهم من خلال الأغشية خارج الجنينية المحيطة بحيث يتم امتدت هم مشدود.
- باستخدام هيئة التصنيع العسكريroknife، جنين شريحة كما مستقيم ممكن من خلال المنطقة من اهتمام. عن النخاع الشوكي، وينبغي أن يكون بين شرائح 1-2 somites سميكة. ترك شرائح تعلق على الجنين أثناء شريحة أجنة أخرى حتى لا تفقد لهم.
- يعد 200 رأس micropipette ميكرولتر بقطع ~ 1 ملم من طرف وربط هذا إلى P2 أو P10. وسيتم استخدام هذا تلميح لنقل شرائح الحبل الشوكي إلى أسفل الزجاج طبق. وهناك معلومات 10 ميكرولتر ليست واسعة بما يكفي لالتقاط شرائح.
- معطف الداخل من طرف مع الكولاجين بواسطة pipetting 1 مزيج الكولاجين ميكرولتر أعدت في وقت سابق. ترك لمدة 1-2 دقائق ثم شطف مع L15 المتوسط. وهذا يمنع النسيج من الالتصاق إلى الداخل من طرف.
- فصل شريحة من الجنين باستخدام microknife وإزالة من الطبق باستخدام P2 أو P10 مزودة طرف 200 ميكروليتر وتعيين إلى 1 ميكروليتر. حاول أن تتناول، حسب متوسط أقل قدر ممكن.
- دوامة في مزيج الكولاجين وانخفاض 5-8 ميكرولتر من هذا إلى صحن بولي-L-يسين المغلفة.
- Immediaوضع الجنين في tely شريحة الكولاجين وموقف في مكانه مع زوج من ملقط غرامة. وينبغي وضع شرائح بحيث الجانب ليمكن تصوير هو مطاردة مع ساترة. وينبغي أن النسيج التمسك طلاء بولي-L-يسين على ساترة.
- كرر هذا حتى يكون لديك عدة شرائح على ساترة. يمكن ان نضع عادة 6-9 شرائح في طبق واحد.
- مرة واحدة كل شرائح هي في مكان، وتغطي الطبق والسماح للالكولاجين لمجموعة لمدة 20 دقيقة. وقد سبق بعض من أقرب الكولاجين وضعت بدأت تجف. لمنع هذا إضافة كمية صغيرة من قبل L15 لهذه التغطية.
- مجموعة مرة واحدة، إضافة بعناية 2ml المتوسطة ثقافة شريحة التي تم معايرتها في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 في 37 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل. ويجب الحرص على عدم طرد الكولاجين من ساترة.
- مكان في الحاضنة 37 درجة / 5 2٪ ثاني أكسيد الكربون والسماح للشرائح لاسترداد ما لا يقل عن 3 ساعات قبل التصوير. إذا لم يكن هناك طبق الرطوبة مكان، في خفة دم مربع البرسبيكسهكتار قليلا من المناديل الورقية الرطبة في زاوية واحدة.
5. شرائح التصوير جنين
- نستخدم الأساسية DeltaVision واسعة حقل المجهر مزودة غرفة WeatherStation البيئية لشرائح الصور. ويحتفظ دائما للغرفة في 37 درجة مئوية، مع جهاز نضح ثاني أكسيد الكربون 2 إلى الحفاظ على مرحلة مجهر في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 / الهواء بنسبة 95٪.
- ويتم عادة خارج التصوير باستخدام 40 × النفط NA / 1.30 عدسة غمر ويتم التقاط الصور مع HQ2 CoolSnap تبريد لاتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا.
- ويتم التقاط Z-أقسام كل ميكرون 1.5 ميكرون من خلال النسيج 45. يجب أن تبقى مدة التعرض عند أدنى مستوى ممكن. نحن عادة لكشف مرض التصلب العصبي المتعدد 5-50 لكل Z-القسم. ويتم التقاط الصور كل 7 دقائق، ويمكن أن زار ما يصل إلى 9 شرائح باستخدام نقطة نظام DeltaVision في الدقيقة يزور وظيفة.
6. ممثل النتائج
على سبيل المثال الوقت الفاصل بين سلسلة من خلية والحبل الشوكي هو سلفهو مبين في الشكل. 2A وفيلم المقابلة 1. وقد بدأ التصوير على شريحة النخاع الشوكي من جنين (سمو مرحلة 12) لمدة يومين من العمر. وكان transfected هذه الخلية مع تأنشا معربا عن GFP-αTubulin. خلال هذه المرحلة المبكرة، والخلايا العصبية سلف تخضع في الغالب الانقسامات طريقة السلف، سلف خلالها انقسام الخلايا لتوليد 2 سلف الدراجات مزيد من الخلايا. الشكل. فيلم 2B وما يقابلها من 2 يبين خلية transfected مع GFP-GPI (GPI الراسية GFP)، بمناسبة غشاء الخلية. هذه الخلايا تخضع لعملية تقسيم خلالها عملية القاعدية الانقسامات الى مجموعتين ويورث بالتساوي بين الخلايا الوليدة.
الشكل 1. شريحة بروتوكول للثقافة الوقت الفاصل بين التصوير.
الشكل 2. الخلية (ب)ehavior خلال التطور الطبيعي في الحبل الشوكي. (أ) إطارات مختارة من فيلم 1. معربا عن خلية GFP-تويولين يقسم مع طائرة الانقسام الذي هو عمودي على سطح قمي (2 ساعة 20 دقيقة)، وتوليد خلايا ابنة في الثانية التي تقسم مرة أخرى (24 ساعة 23 دقيقة و 25 ساعة دقيقة 54). (ب) إطارات مختارة من فيلم 2. خلية transfected مع GFP-GPI يخضع لانقسام الخلايا خلالها يتم تقسيم عملية القاعدية (السهام البيضاء) ورثت نفس القدر من الخلايا الوليدة.
فيلم 1. انقر هنا لعرض الفيلم .
فيلم 2. انقر هنا لعرض الفيلم .
Discussion
نقدم هنا رواية فحص التصوير الوقت الفاصل بين لمراقبة سلوك الخلايا في ثقافة شريحة الدجاج الجنينية. هذا الاختبار تمكن ارتفاع القرار التصوير من الأنسجة الحية لمدة تصل إلى 70 ساعة، على الرغم من الأطر الزمنية بين 24-48 ساعة هي أسهل لالتقاط. استخدام هدفا ارتفاع النفط NA وفترات قصيرة نسبيا بين نقاط في الوقت يتيح الحصول على الصور بدقة عالية، فضلا عن السماح لنا بمراقبة سلوك الخلية التي غالبا ما يحدث بسرعة، ويمكن أن تضيع بسهولة خلال الوقت الفاصل بين التصوير التقليدي باستخدام مبائر المجهري.
والميزة الرئيسية لهذا الفحص هو القدرة على خلايا صورة على مدى فترات طويلة من الزمن. استخدام على نطاق ومجال 6 بدلا من ليزر متحد البؤر المسح 7 المجهري هو أمر حاسم لهذا. وعرضت متحد البؤر المجهري عادة العديد من المزايا واسعة المجال المجهري، بما في ذلك القدرة على اتخاذ المقاطع البصرية والقضاء عليها من معلومات التركيز مباشرة
اختيار بروتين فلوري هو عامل مهم يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية. نجد أن يتم الحصول على أفضل النتائج من التركيبات التي تستخدم البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) 12 كعلامة. ونحن حاليا بتقييم مجموعة من البروتينات الفلورية الحمراء التي يمكن استخدامها بشكل فعال في تركيبة مع GFP لقناة مزدوجة الوقت الهفوات. وهناك مجموعة متنوعة من البروتينات مثل متاح 13. على الرغم من أن العديد من البروتينات في حالة مستقرة كما اندماج مع بروتين فلوريقد يتم تقديم بعض البروتينات غير مستقر من قبل الانصهار، مما أدى إلى بقاء الخلية المنخفض. في مثل هذه الحالات، واستخدام التركيبات التي تحتوي على موقع داخلي دخول الريبوسوم (IRES) مفيد لفصل البروتين من الفائدة من بروتين فلوري.
عندما شرائح تصوير النخاع الشوكي، لا بد من توخي الحذر لتقليل التعرض لضوء الفلورسنت. يجب استخدام العدسات المجهر فقط مع الضوء المرسل (brightfield) لتحديد موقع وموقف شرائح. وينبغي دائما الصور فلوري سيتم شراؤها باستخدام برنامج المجهر باستخدام الحد الأدنى من التعرض مرات. يجب أن تبقى هذه في حدود 5-50 مللي، وينبغي أن جربت استخدام مرشحات الكثافة محايدة مع. على الرغم من أن التعرض لفترات زمنية أطول قد تنتج في البداية صور أكثر وضوحا، قد تكون تأثيرات الضوئية من التعرض للضوء الفلورسنت أن يؤدي إلى موت الخلية. لا ينبغي ميكرون 1 5-10 من الأنسجة التي هي الأقرب إلى ساترة كما يمكن تصوير هذه المنطقة تحتوي على الأنسجة التي قد تكون قد تضررت خلالتشريح.
على الرغم من أن الأمثلة المطروحة هنا هي من الأجنة في مرحلة electroporated سمو (10) والمصورة 6-7 ساعات في وقت لاحق، ويمكن استخدام هذه الطريقة لأجنة تصل إلى سمو المرحلة 18. في مراحل لاحقة، والأنسجة الحبل الشوكي هو أكبر من ذلك بكثير وذلك هو صعب لشريحة باليد. في هذه الحالات، قد غرس الأجنة في انخفاض ذوبان الاغاروز نقطة وباجتزاء مع vibratome تحقق نتائج أفضل. على الرغم من أننا تقديم هذا الاختبار كوسيلة للخلايا التصوير في الحبل الشوكي النامي، كما تم تعديل هذا النهج إلى الأنسجة الجنينية صورة أخرى، بما في ذلك placodes الحسية 3.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
References
- Ulloa, F., Briscoe, J. Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord. Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).
- Briscoe, J., Novitch, B. G. Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).
- Shiau, C., Das, R., Storey, K. An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis. BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis. BMC Biology. 9, 58 (2011).
- Herman, B. Fluorescence microscopy. Bios Scientific Publishers. , (1998).
- Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).
- Pawley, J. B. Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. Pawley, J. B. , Springer US. (2006).
- Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).
- Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).
