Summary
इमेजिंग वास्तविक समय में भ्रूण ऊतक समय की लंबी अवधि में चुनौती दे रहा है. यहाँ हम उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ लंबी अवधि के लिए सेलुलर और उप सेलुलर लड़की रीढ़ की हड्डी में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक परख मौजूद है. इस तकनीक तंत्रिका तंत्र और विकासशील भ्रूण के अन्य क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
भ्रूण तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) की neuronal और glial कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत को जन्म दे साइकिल की रीढ़ की हड्डी होते हैं. हालांकि ज्यादा आणविक है कि रीढ़ की हड्डी पैटर्न तंत्र के बारे में जाना जाता है और neuronal 1 भेदभाव, 2 प्रकाश में लाना है, हम सेल व्यवहार के स्तर पर इन प्रारंभिक घटनाओं की एक गहरी समझ की कमी है. यह इस प्रकार वास्तविक समय में तंत्रिका progenitors के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में वे neurogenesis से गुजरना है.
अतीत, जल्दी भ्रूण ऊतक के वास्तविक समय इमेजिंग / कोशिका ऊतक संस्कृति में व्यवहार्यता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट इमेजिंग के phototoxic प्रभाव सीमित कर दिया गया. यहाँ हम इमेजिंग समय की लंबी अवधि के लिए इस तरह के ऊतक के लिए एक उपन्यास परख वर्तमान में, एक उपन्यास पूर्व vivo टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल और व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि (1) का उपयोग. यह दृष्टिकोण लड़की भ्रूण है की लंबी अवधि के समय चूक निगरानी प्राप्तPinal उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ गर्भनाल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं.
(पायदान 5 संकेतन, उदाहरण के लिए) यह परख सेलुलर और उप सेलुलर व्यवहार उपन्यास के विकास और जीन गतिविधि के लिए अत्यधिक संवेदनशील संवाददाताओं से अवलोकन करने के लिए इसके अलावा भ्रूण 3 ऊतकों, 4 की एक सीमा छवि के लिए संशोधित किया जा सकता है इस परख करता है साथ जो समझने के लिए कैसे संकेत एक शक्तिशाली उपकरण भ्रूण विकास के दौरान सेल व्यवहार को नियंत्रित करता है.
Protocol
1. डिश तैयार
- बर्तन की टुकड़ा संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गिलास तली (आधार के रूप में एक coverslip साथ) (WILLCO व्यंजन). इन लेंस के ऊतक पर एक 6 सेमी टिशू कल्चर गिलास नीचे को साफ रखने के पकवान में रखा जाता है.
- प्रयोग से पहले दिन पर, कांच तली और 5min के लिए कमरे के तापमान पर पकवान सेते हैं 2 मिलीलीटर 0.1% पाली एल Lysine समाधान जोड़ने के लिए पाली एल Lysine गिलास नीचे कोट करने के लिए अनुमति देते हैं.
- पाली एल Lysine समाधान निकालें और deionised पानी में तीन बार कुल्ला, और फिर 70% इथेनॉल में एक बार.
- रात भर सूखी छोड़ दें. बर्तन भी धीरे 30-45 सेकंड के लिए कम शक्ति पर एक माइक्रोवेव में हीटिंग से सूख जा सकता है.
2. भ्रूण electroporation
- 37 में अंडों को सेते हैं डिग्री सेल्सियस से हैम्बर्गर हैमिल्टन (एच एच) 10 चरण (~ 36 घंटे) (या अन्य वांछित चरण) के लिए.
- इससे पहले शुरुआत गिलास सुई (हम एक ज्वलंत / ब्राउन p87 मॉडल microcapillary डांड़ी उपयोग) तैयार करने और needl की टिप को तोड़नेई विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक ठीक संदंश का उपयोग कर. सुई के अंत पियर्स के लिए पर्याप्त तेज भ्रूण होगा, जबकि इतनी संकीर्ण है कि यह डीएनए समाधान के इंजेक्शन में बाधा उत्पन्न किया जा रहा है नहीं होना चाहिए.
- खिड़की पर अंडे और भ्रूण के दोनों ओर जगह इलेक्ट्रोड (अलग 5mm)
- न्यूरल ट्यूब में - डीएनए (0.5 / deionised पानी तेजी से हरे रंग की एक छोटी राशि के साथ रंग में μg μl ~ 0.025) इंजेक्षन.
- वर्तमान लागू 12-17 वी तीन बार, दालों के बीच 950 एमएस के साथ 50ms पल्स लंबाई.
- हम डीएनए की कम मात्रा और कम electroporation voltages का उपयोग के मोज़ेक अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के इतना है कि हम व्यक्ति की कोशिकाओं का पालन कर सकते हैं.
- खोल में विंडो को cellotape के साथ कवर सुनिश्चित करें कि यह बंद है.
- भ्रूण 3-4 घंटे या रात भर के लिए 37 पर ठीक करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस
3. कोलेजन और स्लाइस संस्कृति मध्यम तैयारी
- टुकड़ा करने की क्रिया से पहले कोलेजन और एक घंटे के बारे में टुकड़ा संस्कृति के माध्यम मिश्रण तैयार करें.
- 300 μl टीype 1 कोलेजन 100 μl 0.1% एसिटिक एसिड समाधान और 100 5 μl x l15 मध्यम जोड़ें. इसके अतिरिक्त प्रत्येक के बाद अच्छी तरह से भंवर. समाधान पीला बारी चाहिए.
- अब 15-20 μl 7.5% सोडियम बिकारबोनिट और अच्छी तरह भंवर में जोड़ें. थोड़ा गुलाबी समाधान हो जाना चाहिए, और इस के लिए आवश्यक बिकारबोनिट सोडियम की मात्रा अलग हो सकता है. बर्फ पर रखें और हर बार ताजा बना.
- 10 मिलीलीटर neurobasal मध्यम एक 1 x अंतिम एकाग्रता और 10 μl Gentamicin समाधान के लिए बी 27-पूरक और Glutamax के जोड़.
- 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह मध्यम बफर. कंटेनर के ऊपर यह सीओ 2 के साथ संतुलित करना करने की अनुमति ढीला छोड़ दें.
4. टुकड़ा संस्कृति
- अंडे से भ्रूण निकालें और l15 माध्यम में धो.
- नीचे में sylgard की एक परत और उन्हें पिन के आसपास के अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली के माध्यम से इतना है कि वे तना हुआ खींच रहे हैं के साथ एक ऊतक संस्कृति डिश में रखें.
- एक mic का उपयोग करनाroknife, ब्याज की क्षेत्र के माध्यम से टुकड़ा के रूप में सीधे संभव भ्रूण. रीढ़ की हड्डी के लिए, स्लाइस 1-2 मोटी somites के बीच होना चाहिए. भ्रूण से जुड़ी स्लाइस छोड़ दो जबकि आप अन्य भ्रूण टुकड़ा ताकि आप उन्हें खोना नहीं है.
- बंद ~ 1 मिमी टिप के काटने और एक p2 या p10 इस संलग्न द्वारा एक 200 μl micropipette टिप तैयार करते हैं. इस टिप गिलास नीचे डिश के लिए रीढ़ की हड्डी की स्लाइस का हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. एक 10 μl टिप व्यापक स्लाइसें लेने के लिए पर्याप्त नहीं है.
- कोट 1 μl कोलेजन पहले से तैयार मिश्रण pipetting द्वारा कोलेजन के साथ टिप के अंदर. 1-2 मिनट के लिए छोड़ दो और फिर l15 के माध्यम से कुल्ला. इस टिप के अंदर करने के लिए चिपके से ऊतक को रोकने जाएगा.
- भ्रूण से एक microknife का उपयोग टुकड़ा अलग करें और p2 या p10 200 μl टिप के साथ फिट और 1 μl करने के लिए सेट का उपयोग पकवान से हटा दें. थोड़ा माध्यम के रूप में संभव के रूप में लेने की कोशिश करो.
- पाली एल Lysine लेपित पकवान पर भंवर कोलेजन मिश्रण और ड्रॉप 5-8 इस μl.
- Immediately ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ जगह में कोलेजन और स्थिति में भ्रूण टुकड़ा डाल दिया. स्लाइसें में तैनात किया जाना चाहिए ताकि imaged किया जा पक्ष coverslip साथ भरा है. ऊतक को coverslip पर पाली एल Lysine कोटिंग पालन करना चाहिए.
- दोहराएँ जब तक आप coverslip पर कई स्लाइसें है. हम आम तौर पर एक डिश पर 6-9 स्लाइस जगह कर सकते हैं.
- एक बार सभी स्लाइस जगह में हैं, पकवान कवर और कोलेजन 20 मिनट के लिए सेट करने के लिए अनुमति देते हैं. जल्द से जल्द रखा कोलेजन के कुछ पहले से ही बाहर सूखी शुरू हो सकता है. को रोकने के लिए इस कवर करने से पहले इन l15 की एक छोटी राशि जोड़ने.
- एक बार सेट, ध्यान से 2ml टुकड़ा संस्कृति मध्यम है कि 5% सीओ 2 में equilibrated किया गया है कम से कम एक घंटे के लिए 37 ° सी में जोड़ें. केयर coverslip से कोलेजन जगह देना नहीं लिया जाना चाहिए.
- एक 37 ° / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में जगह और स्लाइस कम से कम 3 घंटे के लिए इमेजिंग से पहले ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. अगर वहाँ कोई नमी, एक कड़ा बॉक्स बुद्धि में जगह पकवान हैनम ऊतक कागज के एक कोने में हा बिट.
5. इमेजिंग भ्रूण स्लाइस
- हम DeltaVision कोर व्यापक क्षेत्र एक WeatherStation पर्यावरण चैम्बर के साथ माइक्रोस्कोप छवि स्लाइस के लिए फिट का उपयोग करें. कक्ष लगातार एक CO 2 छिड़काव उपकरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस, पर बनाए रखा करने के लिए 5% 2 सीओ / 95% हवा में खुर्दबीन मंच बनाए रखने.
- इमेजिंग सामान्य रूप से बाहर एक 40 x 1.30 / एनए तेल विसर्जन लेंस का उपयोग किया जाता है और छवियों एक CoolSnap HQ2 के साथ कब्जा कर रहे हैं सीसीडी कैमरा ठंडा.
- जेड वर्गों 45 माइक्रोन ऊतक के माध्यम से हर 1.5 माइक्रोन कब्जा कर रहे हैं. एक्सपोज़र समय कम के रूप में संभव के रूप में रखा जाना चाहिए. हम सामान्य रूप से प्रत्येक Z - अनुभाग के लिए 5-50 एमएस के लिए बेनकाब. छवियाँ हर 7 मिनट पर कब्जा कर रहे हैं और 9 स्लाइस DeltaVision सिस्टम सटीक समारोह का दौरा बिंदु का उपयोग दौरा किया जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
एक रीढ़ की हड्डी पूर्वपुस्र्ष सेल का एक उदाहरण के समय चूक अनुक्रमछवि में दिखाया गया है. 2a और इसी एक मूवी. इमेजिंग भ्रूण दो दिन की उम्र में 12 चरण) (एच एच से एक रीढ़ की हड्डी टुकड़ा पर शुरू किया गया था. इस सेल GFP-αTubulin के व्यक्त निर्माण के साथ में ट्रांसफ़ेक्ट गया था. इस प्रारंभिक चरण के दौरान, तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज मुख्य रूप से गुजरना पूर्वज - पूर्वज मोड डिवीजनों के दौरान जो कोशिकाओं को दो साइकिल चालन के पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं उत्पन्न विभाजित चित्र. 2 मूवी 2b और इसी एक GFP जीपीआई (जीपीआई GFP लंगर) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट सेल से पता चलता है, कोशिका झिल्ली अंकन. यह कोशिका विभाजन के दौरान जो बेसल प्रक्रिया दो भागों में विभाजित है और समान रूप से बेटी की कोशिकाओं द्वारा विरासत में मिली आए.
आकृति 1. समय चूक इमेजिंग के लिए टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल.
चित्रा 2. सेल खसामान्य रीढ़ की हड्डी के विकास के दौरान ehavior मूवी से 1 (एक) चयनित फ्रेम. GFP-ट्यूबिलिन व्यक्त सेल कि शिखर सतह (2 घंटे 20 मिनट) के लिए खड़ा है एक दरार विमान के साथ विभाजित है, दो बेटी कोशिकाओं है कि एक बार फिर से विभाजित (24 घंटे 23 मिनट और 25 घंटे 54 मिनट). (ख) 2 मूवी से चयनित फ्रेम. GFP जीपीआई साथ ट्रांसफ़ेक्ट सेल कोशिका विभाजन के दौरान जो बेसल प्रक्रिया (सफेद तीर) विभाजित है और समान रूप से बेटी की कोशिकाओं द्वारा विरासत में मिली आए.
मूवी 1. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
मूवी 2. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
Discussion
हम यहाँ एक उपन्यास इमेजिंग समय चूक परख वर्तमान चिकन भ्रूण टुकड़ा संस्कृति में सेल के व्यवहार पर नजर रखने. इस परख के लिए 70 घंटे तक जीवित ऊतक के उच्च संकल्प इमेजिंग में सक्षम बनाता है, हालांकि 24-48 घंटे के बीच समय फ्रेम पर कब्जा करने में आसान हैं. एक उच्च एनए तेल उद्देश्य और अपेक्षाकृत कम समय अंक के बीच अंतराल के उपयोग उच्च संकल्प छवि अधिग्रहण के लिए सक्षम बनाता है, के रूप में हमें सेल व्यवहार है कि अक्सर तेजी से होता है पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है के रूप में अच्छी तरह से, और आसानी से पारंपरिक समय चूक confocal का उपयोग इमेजिंग के दौरान याद कर सकते हैं माइक्रोस्कोपी.
इस परख के प्रमुख लाभ छवि कोशिकाओं के लिए समय की लंबी अवधि से अधिक क्षमता है. व्यापक क्षेत्र confocal 7 माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर की बजाय 6 का उपयोग इस के लिए महत्वपूर्ण है. Confocal माइक्रोस्कोपी पारंपरिक रूप से व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी पर कई फायदे की पेशकश करने के लिए ऑप्टिकल वर्गों लेने और ध्यान केंद्रित जानकारी के बाहर सीधे को खत्म करने की क्षमता सहित,
फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चुनाव एक महत्वपूर्ण कारक है कि सेल अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है. हम पाते हैं कि सबसे अच्छा परिणाम constructs कि एक मार्कर के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 12 (GFP) के उपयोग से प्राप्त कर रहे हैं. वर्तमान में हम लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि प्रभावी ढंग से दोहरी चैनल समय - खामियों के लिए GFP साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है की एक सीमा का आकलन कर रहे हैं. वहाँ में 13 उपलब्ध प्रोटीन की एक किस्म है. हालांकि कई प्रोटीन fusions के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ स्थिर रहे हैंकुछ प्रोटीन संलयन द्वारा अस्थिर गाया जा सकता है, कम सेल व्यवहार्यता में जिसके परिणामस्वरूप. ऐसे मामलों में, एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) युक्त constructs का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन से ब्याज की प्रोटीन को अलग करने के लिए उपयोगी है.
जब इमेजिंग रीढ़ की हड्डी की स्लाइस, देखभाल करने के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए जोखिम को कम लिया जाना चाहिए. खुर्दबीन eyepieces प्रेषित प्रकाश (brightfield) के साथ ही इस्तेमाल किया जाना चाहिए पता लगाने और स्थिति स्लाइस. फ्लोरोसेंट छवियों हमेशा माइक्रोस्कोप का उपयोग कम से कम जोखिम बार के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर हासिल किया जाना चाहिए. इन 5-50 एमएस के रेंज में रखा जाना चाहिए और तटस्थ घनत्व फिल्टर के उपयोग के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए. हालांकि अब जोखिम बार शुरू में स्पष्ट छवियों का उत्पादन कर सकते हैं, फ्लोरोसेंट रोशनी जोखिम के phototoxic प्रभाव कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. ऊतक के पहले 5-10 माइक्रोन कि coverslip के सबसे करीब है के रूप में इस क्षेत्र के ऊतकों है कि के दौरान किया गया है क्षतिग्रस्त हो सकता है शामिल नहीं किया जा imaged किया जाना चाहिएटुकड़ा करने की क्रिया.
एचएच 10 मंच और छवि 6-7 घंटे बाद में electroporated भ्रूण के उदाहरण यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं, हालांकि इस विधि भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अप करने के लिए 18 चरण HH. बाद के चरणों में, रीढ़ की हड्डी ऊतक बहुत बड़ा है और इसलिए हाथ से टुकड़ा करने के लिए मुश्किल है. इन मामलों में, कम पिघलने बिंदु agarose में भ्रूण एम्बेड और एक vibratome साथ सेक्शनिंग बेहतर परिणाम उपज हो सकती है. हालांकि हम विकासशील रीढ़ की हड्डी में इमेजिंग कोशिकाओं के लिए एक पद्धति के रूप में इस परख मौजूद है, इस दृष्टिकोण भी छवि को संवेदी 3 placodes सहित अन्य भ्रूण के ऊतकों, के लिए संशोधित किया गया.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
References
- Ulloa, F., Briscoe, J. Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord. Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).
- Briscoe, J., Novitch, B. G. Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).
- Shiau, C., Das, R., Storey, K. An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis. BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis. BMC Biology. 9, 58 (2011).
- Herman, B. Fluorescence microscopy. Bios Scientific Publishers. , (1998).
- Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).
- Pawley, J. B. Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. Pawley, J. B. , Springer US. (2006).
- Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).
- Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).
