Summary
실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.
Abstract
태아의 척수가 중추 신경계 (CNS)의의 연결과 glial 세포의 큰 백분율을 야기할 신경 전구 세포를 사이클링으로 구성되어 있습니다. 많이는 분자 메커니즘을 그 모양과 척수를 대해 알려진의 연결을 차별화 1, 2을 유도되지만, 우리는 세포 행동의 수준에서 이러한 초기 이벤트의 깊은 이해가 부족합니다. 그들은 neurogenesis를 받아야하는대로 실시간으로 신경 progenitors의 동작을 연구하기 때문에 중요합니다.
초기 배아 조직의 과거, 실시간 영상으로 세포 / 조직 문화의 생존뿐만 아니라 형광 이미징의 phototoxic 효과에 의해 제한되었습니다. 여기 소설 전직의 생체내 슬라이스 문화 프로토콜과 넓은 필드 형광 현미경 (그림 1)를 이용, 오랜 기간에 대한 이미지와 같은 조직에 대한 소설 분석을 제시. 이 접근법은 병아리 배아 s의 장기간 시간이 경과 모니터링 구현높은 공간과 시간적 해상도 pinal 코드 전구 세포.
이 분석은 유전자 활동을위한 세포 및 서브 셀룰러 행동, 소설의 개발과 고도로 민감한 기자의 관찰 이외에 이미지 배아 조직 3, 4의 범위에 수정할 수 있습니다 (예 : 노치 신호 5)이 분석을하게 신호 방법을 이해하기위한 강력한 도구는 배아 발달 동안 세포의 행동을 규정합니다.
Protocol
1. 음식 준비
- 슬라이스 배양에 사용되는 요리 (WillCo 요리) (거점으로 coverslip에) 유리 바닥입니다. 이러한 유리 바닥을 더럽히지 않으 6cm 조직 배양 접시에 렌즈 티슈에 표시됩니다.
- 실험 전날, 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥에 수 있도록 상온에서 5 분 용 유리 바닥 접시와 부화 두 ML 0.1 % 폴리-L-라이신 솔루션을 추가합니다.
- 폴리-L-라이신 솔루션을 제거하고 deionised 물에 세 번 헹굼 후 한때 70 % 에탄올 인치
- 하룻밤 건조 둡니다. 요리도 부드럽게 30~45초위한 낮은 전력에서 전자 레인지에 가열하여 건조하실 수 있습니다.
2. 배아 Electroporation
- 37 알을 품어 ° C에서 햄버거 - 해밀턴 (HH) 10 단계 (~ 36시간) (또는 다른 원하는 단계)로 변경합니다.
- 시작은 유리 바늘을 (우리가 불타는 / 브라운 모델 p87 microcapillary 풀러 사용) 준비 needl의 팁을 끊다 전에전자 해부 현미경 미세 집게를 사용하여. 그것이 DNA 솔루션의 주입을 막는 정도로 좁은 신중하지 못한 상태에서 바늘의 끝이 배아 피어스에 충분한 날카로운 있어야합니다.
- 배아의 양쪽에 윈도우 계란과 장소 전극 (5mm 간격)
- 신경 튜브로 - DNA를 (빠른 녹색의 소량으로 물들고 deionised 물에 0.5 μg / μl ~ 0.025) 주사.
- 현재 적용 - 펄스 사이의 950 MS와 12-17 V를 세 번, 50ms 펄스 길이를.
- 우리는 각각의 세포를 추적할 수 있도록 모자이크 표현을 달성하기 위해 DNA의 낮은 농도와 낮은 electroporation 전압을 사용합니다.
- cellotape과 달걀 껍질에 창문을 커버하고는 밀폐되어 있는지 확인하십시오.
- 배아는 37 3~4시간 또는 하룻밤 동안 복구할 수 있도록 허용 ° C.
3. 콜라겐과 슬라이스 문화 매체 준비
- 깔끔히 전에 시간 정도 콜라겐 믹스와 슬라이스 문화 매체를 준비합니다.
- 300 μl t까지ype 한 콜라겐 100 μl 0.1 % 초산 용액 100 μl 5 X L15 매체를 추가하십시오. 각 또한 후에 철저하게 소용돌이. 솔루션은 노란색 켜야합니다.
- 지금 15-20 μl 7.5 % 나트륨 중탄산염 철저히 와동를 추가합니다. 솔루션은 약간 분홍색이 되었 을텐데이 필요한 중탄산 볼륨이 다를 수 있습니다. 빙판에 유지하고 매번 신선하다.
- 10 ML neurobasal 매체는 1 X 최종 농도와 10 μl Gentamicin 솔루션으로, B-27 보충 및 Glutamax을 추가하려면.
- 37 ° C 배양기에서 개최 매체 5 % CO 2와 버퍼. 그것은 CO 2와 평형 수 있도록하는 컨테이너의 상단은 자유롭게 둡니다.
4. 슬라이스 문화
- 난자에서 배아를 제거하고 L15 중간에 씻는다.
- 하단 sylgard의 레이어와 그들이 긴장 뻗어되도록 주변 엑스트라 배아 세포막을 통해 그들을 핀으로 조직 배양 접시에있는 장소.
- 마이크 사용roknife, 관심 영역을 통해 슬라이스 배아 더할 나위없이 가능한. 척수의 경우 조각은 두께 1-2 somites 사이 여야합니다. 당신이 그들을 손실되지 않도록 다른 배아를 썰어 동안 배아에 붙어 슬라이스를 남겨주세요.
- 팁 중 ~ 1mm를 잘라와 P2 또는 p10 이것을 장착하여 200 μl micropipette 팁을 준비합니다. 이 단서는 유리 바닥 접시에 척수의 조각을 전송하는 데 사용됩니다. 10 μl 팁은 조각을 데리러만큼 광범위하지 않습니다.
- 코트 이전 준비 1 μl 콜라겐 믹스를 pipetting하여 콜라겐과 팁의 내부. L15 매체와 헹굼 후 1-2 분 동안 둡니다합니다. 이 팁 내부를 지키는로부터 조직을 방지할 수 있습니다.
- microknife를 사용하는 배아에서 슬라이스를 분리하고 200 μl 제보를 들으며 1 μl로 설정 P2 또는 p10를 사용하여 요리에서 제거합니다. 가능한 한 작은 매체로 소요될보십시오.
- 폴리-L-라이신 코팅 요리에 대한이의 소용돌이 콜라겐 믹스와 드롭 5-8 μl.
- Immediately 벌금 포셉 한 켤레와 장소에 콜라겐과 위치로 배아 슬라이스를 넣어. 조각이 몇 군데되는 측면이 coverslip으로 플러시되도록 배치해야합니다. 조직 coverslip에 폴리-L-라이신 코팅을 준수해야합니다.
- 당신 coverslip에 몇 조각을 가지고 때까지이 단계를 반복합니다. 우리는 대개 한 접시에 6-9 조각을 넣을 수 있습니다.
- 모든 조각이 제자리에있는되면 접시를 커버하고 콜라겐 20 분 동안 설정할 수 있습니다. 초기 배치 콜라겐의 일부는 이미 건조하기 시작했을 수 있습니다. 이것이 취재 전에 L15 소량을 추가 방지합니다.
- 한번 설정 조심스럽게 적어도 한 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2에서 equilibrated되었습니다 2ml 슬라이스 문화 매체를 추가하십시오. 케어는 coverslip에서 콜라겐을 이동시키다하지 않도록 촬영해야합니다.
- 37 ° / 5% CO 2 배양기에서 장소와 조각은 이미징 전에 적어도 3 시간 동안 복구할 수 있습니다. perspex 상자 재치에는 습도, 장소 요리가없는 경우한 구석에 젖은 티슈 중 하 비트.
5. 이미징 배아 조각
- 우리는 이미지 조각으로 WeatherStation 환경 챔버를 들으며 DeltaVision 코어 와이드 필드 현미경을 사용합니다. 챔버는 지속적으로 5 % CO 95분의 2 %의 공기에서 현미경 스테이지를 유지하는 CO 2 관류 장치와 37 ° C,에서 관리하고 있습니다.
- 이미징은 보통 40 X / 1.30 NA 기름 침지 렌즈를 사용하고 영상이 CCD 카메라를 냉각 CoolSnap HQ2으로 캡처되어 수행됩니다.
- Z-섹션 45 μm의 조직을 통해 매년 1.5 μm의를 점령하고 있습니다. 노출 시간은 가능한 한 낮은 보관해야합니다. 우리는 일반적으로 각각의 Z-섹션에 5-50 MS에 대해 쉽게받을 수 있습니다. 이미지는 매 7 분 캡처되어 최대 9 조각이 함수를 방문 DeltaVision 시스템의 정확한 지점을 이용하여 방문하실 수 있습니다.
6. 대표 결과
척수의 전구 세포의 예를 촬영된 시퀀스는그림. 2A와 해당 영화 1. 이미징은 이틀짜리 (HH 단계 12) 배아에서 척수의 단면에서 시작되었습니다. 이 세포는 GFP-αTubulin을 표현 구조로 transfected되었다. 이러한 초기 개발 단계 동안, 신경 전구 세포는 주로 세포가 두 개의 추가 사이클링 전구 세포를 생성하기 위해 분할하는 동안 시조 - 시조 모드 부문을 받고있다. 그림. 2B와 해당 동영상 2 세포막을 마킹, GFP-GPI (GPI는 GFP를 정박)로 transfected 세포를 보여줍니다. 이 세포는 기초 과정을 둘로 분할하고 똑같이 딸 세포에 의해 상속되는 동안 부서를 겪습.
1 그림. 촬영된 영상을위한 슬라이스 문화 프로토콜.
그림 2. 세포 B정상 척수 개발 중에 ehavior. 영화 1 () 선택된 프레임. GFP-tubulin을 표현 세포는 다시한번 (24 H 23 분 25 H 54 분) 나누어 두 딸 세포를 생성, 혀끝의 표면 (2 H 20 분)에 수직이다 절단 비행기로 나눕니다. (b)는 영화 2 선택된 프레임. GFP-GPI로 transfected 세포는 기저 과정이 분할 (흰색 화살표)와 동등 딸 세포에 의해 상속되는 동안 세포 분열을 거쳐.
영화 1. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영화 2. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
우리는 닭 배아 슬라이스 문화 셀 동작을 모니터링하려면 여기를 소설 촬영된 영상 분석을 제시. 24-48시간 사이의 시간을 프레임 캡처하여 쉽게 있지만, 이러한 분석은 70 시간 동안 살아있는 조직의 고해상도 이미징을 가능하게합니다. 높은 NA 오일 객관적이고 시간 지점 사이에 상대적으로 짧은 간격의 사용은 물론 우리가 흔히 빠르게 발생 셀 동작을 모니터링할 수 있도록로서, 높은 해상도 이미지 획득을 가능하게하고, 쉽게 공촛점를 사용하여 기존 촬영된 영상 중에 놓친 수 현미경.
이 분석의 주요한 이점은 오랜 기간 동안 이미지 셀에 대한 능력입니다. 7 현미경을 스캔 공촛점 레이저 대신 넓은 필드 6의 사용은 이것에 대한 중요합니다. 공촛점 현미경은 전통적으로 광학 부분을 직접 초점 정보를 밖으로 제거하는 기능을 포함하여 넓은 필드 현미경을 통해 몇 가지 장점을 제공하고있다
형광 단백질의 선택은 세포 생존에 영향을 미칠 수있는 중요한 요소이다. 우리는 최상의 결과를 마커로 녹색 형광 단백질 (GFP) 12를 사용하는 구조에서 얻을다는 것을 찾을 수 있습니다. 현재 효과적으로 듀얼 채널 건너 뛰자위한 GFP와 함께 사용할 수있는 적색 형광 단백질의 범위를 평가하고 있습니다. 13 사용 가능한 이러한 단백질의 여러 가지가 있습니다. 많은 단백질은 형광 단백질로 fusions로 안정 있지만일부 단백질은 감소 세포 생존 능력의 결과로, 융합에 의한 불안 정한 렌더링할 수 있습니다. 그러한 경우에는 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES)을 포함하는 구성 요소의 사용은 형광 단백질로부터 관심 단백질을 분리하는 데 유용합니다.
언제 이미징 척수의 조각,주의가 형광등에 노출을 최소화하기 위해 이동해야합니다. 현미경의 eyepieces는 조각을 찾아 입장하는 전송 빛 (brightfield)에서만 사용해야합니다. 형광 이미지는 항상 최소한의 노출 시간을 이용한 현미경 소프트웨어를 사용 취득해야합니다. 이들은 5-50 MS의 범위에 보관해야하며 중성 밀도 필터의 사용으로 실험한다. 긴 노출 시간이 처음 선명한 이미지를 생산할 수 있지만, 형광등 노출 phototoxic 효과는 세포 사망을 초래할 수 있습니다. 이 지역 중에 손상되었을 수 있습니다 티슈가 들어 있으므로 coverslip에 가장 가까운 조직의 첫 번째 5-10 μm의가 몇 군데하지 말아야깔끔히.
여기에 제시된 예제는 HH 단계 10과 나중에 몇 군데 6~7시간에서 electroporated 배아으로하지만,이 방법은 스테이지 18 HH하는 배아에 사용할 수 있습니다. 나중 단계에서 척수 조직이 훨씬 더 크네요 그래서 손으로 썰어하기 어렵습니다. 이러한 경우, 낮은 용융 점 아가로 오스의 배아를 내장하고 vibratome와 sectioning하면 더 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 우리가 개발 척수의 영상 전지 방법으로 이러한 분석을 제시하더라도,이 접근법은 또한 감각 placodes 3를 포함해 이미지를 다른 배아 조직에 수정되었습니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
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