Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

Summary

Изображений эмбриональной ткани в режиме реального времени является сложной задачей в течение длительного периода времени. Здесь мы представляем анализ для контроля клеточного и субклеточные изменения в куриных спинного мозга в течение длительного времени с высоким пространственным и временным разрешением. Этот метод может быть адаптирован и для других регионов нервной системы и развитие эмбриона.

Abstract

Эмбрионального спинного мозга состоит из нервных клеток велосипеде предшественников, которые приводят к большой процент нейронов и глиальных клеток центральной нервной системы (ЦНС). Хотя многое известно о молекулярных механизмах, модель спинного мозга и вызывает нейронную дифференциацию ^{1, 2,} нам не хватает глубокого понимания этих ранних событий на уровне поведения клеток. Таким образом, решающее значение для изучения поведения нейронных предшественников в режиме реального времени, как они проходят нейрогенеза.

В прошлом, в режиме реального времени изображения ранней эмбриональной ткани была ограничена клеток / жизнеспособности тканей в области культуры, а также фототоксических эффекты флуоресцентных изображений. Здесь мы представляем новый тест для визуализации, такие ткани в течение длительного периода времени, с использованием естественных роман бывшего часть протокола культуры и широким полем флуоресцентной микроскопии (рис. 1). Такой подход позволяет достичь долгосрочного покадровой мониторинга куриных эмбриональных сPinal шнур клеток-предшественников с высоким пространственным и временным разрешением.

Этот анализ может быть изменен, чтобы изображение спектра эмбриональных тканей ^{3, 4} в дополнение к наблюдению клеточном и субклеточном поведения, развитие новых и очень чувствительны к журналистам активности генов (например, Notch сигнального ⁵⁾ делает этот анализ мощный инструмент, с которым понять, как сигнализации регулирует поведение клеток в процессе эмбрионального развития.

Protocol

1. Блюдо подготовка

1. Посуда для срез культуры стеклянным дном (с покровным в качестве базового) (WillCo блюда). Они размещаются на объектив ткани в 6 см блюдо культуры тканей держать чистым стеклянным дном.
2. За день до эксперимента, добавить 2 мл 0,1% поли-L-лизин решение стекло дном посуды и инкубировать 5 минут при комнатной температуре, чтобы поли-L-лизин, чтобы покрыть стеклянным дном.
3. Удалить поли-L-лизин решение и промыть три раза дистиллированной водой, а затем один раз в 70% этаноле.
4. Оставьте сохнуть на ночь. Посуда может также быть высушены, осторожно нагревая в микроволновой печи при малой мощности в течение 30-45 секунд.

2. Эмбрион Электропорация

1. Инкубировать яйца при температуре 37 ° С до Гамбургер-Гамильтона (HH) этап 10 (~ 36 часов) (или другого желаемого этап).
2. Прежде чем начать готовить стекло иглы (мы используем Горячие / коричневый модель P87 микрокапиллярных съемник) и разорвать кончик needlE с помощью тонкого пинцета при вскрытии микроскопом. В конце иглы должна быть достаточно острым, чтобы проникнуть в зародыше не будучи настолько узки, что он препятствует введения раствора ДНК.
3. Окна яйцами и место электродов (5 мм друг от друга) с обеих сторон эмбриона
4. Вводите ДНК (~ 0,025 - 0,5 мкг / мкл деионизированной воды окрашены с небольшим количеством быстрых зеленый) в нервной трубки.
5. Применение тока - 12-17 V в три раза, длительность импульса 50 мс с 950 мс между импульсами.
6. Мы используем низкой концентрации ДНК и низкого напряжения электропорации для достижения мозаика выражение, так что мы можем проследить отдельные клетки.
7. Крышка окна в яичной скорлупе с cellotape и убедитесь, что она решена.
8. Позвольте эмбрионов восстановить в течение 3-4 часов или на ночь при температуре 37 ° C.

3. Коллаген и фрагмент культуры средних подготовка

1. Подготовка смеси коллагена и средний срез культуры, примерно за час до нарезки.
2. К 300 мкл тype 1 коллаген добавляют 100 мкл 0,1% раствора уксусной кислоты и 100 мкл 5 х L15 среды. Vortex тщательно после каждого дополнения. Решение должно желтеть.
3. Теперь добавьте 15-20 мкл 7,5% раствором бикарбоната натрия и тщательно вихря. Решение должно стать немного розового, а объем бикарбоната натрия, необходимых для этого могут быть разными. Хранить на льду и составляют свежие каждый раз.
4. К 10 мл neurobasal среднего добавить B-27 дополнения и Glutamax, в 1 х конечной концентрации и 10 мкл раствора гентамицина.
5. Место среды в 37 ° C инкубатор буфере с 5% CO _2. Оставьте в верхней части контейнера свободно, чтобы позволить ему равновесие с CO _2.

4. Slice культуры

1. Удалить из эмбриона яйцо и мыть в L15 среды.
2. Место в культуре ткани блюдо слоем sylgard внизу и прикрепите их по окрестным экстра-эмбриональные мембраны так, чтобы они плотно прилегать.
3. С помощью микрофонаroknife, часть эмбрионов как можно более прямо через область интересов. Для спинного мозга, кусочки должны быть в пределах 1-2 сомитов толщиной. Оставьте кусочки прикреплены к эмбрион во время нарезать других эмбрионов, чтобы не потерять их.
4. Подготовьте 200 мкл наконечник пипетки, отрезав ~ 1 мм от наконечника и крепления этого Р2 или p10. Этот совет будет использоваться для передачи спинного кусочки шнур блюдо со стеклянным дном. 10 мкл наконечник не достаточно широким, чтобы подобрать кусочки.
5. Пальто внутри наконечника с коллагеном с помощью пипетки 1 мкл смеси коллагена подготовленных ранее. Оставьте на 1-2 минут, а затем промыть L15 среды. Это позволит предотвратить ткань прилипает к внутренней поверхности наконечника.
6. Снимите часть из эмбриона помощью microknife и снимите с использованием блюдо Р2 или p10 оснащен 200 мкл наконечник и установлен в 1 мкл. Попробуйте взять в качестве маленький средний насколько это возможно.
7. Vortex смеси коллагена и падения 5-8 мкл этого на поли-L-лизин покрытием блюдо.
8. Immediately положить ломтик эмбриона в коллагена и положение на месте с парой тонких щипцов. Ломтики должны быть расположены так, что стороны быть отображены на одном уровне с покровным. Ткань должна придерживаться поли-L-лизин покрытие на покровное.
9. Повторите это, пока у вас есть несколько кусочков на покровное. Обычно мы можем поместить 6-9 ломтика на одном блюде.
10. Когда все кусочки на месте, накройте блюдо и дайте коллагена для установки в течение 20 минут. Некоторые из самых ранних размещены коллагена, возможно, уже начали иссякать. Для предотвращения этого добавить небольшое количество L15 с этими перед покрытием.
11. После установки, осторожно добавить 2 мл культуральной среды кусочек, который был уравновешенную 5% CO ₂ при 37 ° С, по крайней мере час. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не выбить из коллагена покровным.
12. Место в 37 ° / 5% СО ₂ инкубатора и позволяет кусочки восстановить, по крайней мере за 3 часа до съемки. Если нет влажности, место блюдо в остроумии окна из плексигласага немного влажной салфеткой в ​​одном углу.

5. Фрагменты изображения эмбрионов

1. Мы используем Основные DeltaVision широким полем микроскоп снабжен WeatherStation экологические камеры изображение ломтиками. Камера постоянно поддерживается на уровне 37 ° C, с СО ₂ перфузии аппарат для поддержания микроскопа на 5% CO _2/95% воздуха.
2. Изображения, как правило, осуществляется с помощью 40-х / 1.30 NA иммерсионным объективом и изображения будут захвачены с CoolSnap HQ2 охлаждение CCD камеры.
3. Z-секции записываться каждые 1,5 мкм на 45 мкм ткани. Выдержка должна быть как можно более низкой. Мы обычно выставить на 5-50 мс для каждого Z-секции. Изображения захватываются через каждые 7 минут и до 9 кусочков можно посетить с использованием точных момент система DeltaVision, посещающих функции.

6. Представитель Результаты

Например покадровой последовательности спинного клеток-предшественников шнурпоказанной на рис. 2а и соответствующие Фильм 1. Изображений была начата спинной кусок шнура от двух-дневных (HH этап 12) эмбриона. Эта ячейка была трансфицированных конструкцией выражения GFP-αTubulin. В этой ранней стадии, нервные клетки-предшественники подвергаются преимущественно предшественников-предшественников режиме подразделений в ходе которого клетки делятся для создания еще двух клеток-предшественников на велосипеде. Рис. 2b и соответствующий фильм 2 показаны клетки трансфицированных GFP-GPI (GPI якорь GFP), маркировка клеточных мембран. Эта клетка претерпевает разделение в ходе которой базальных процесс распадается на два, и в равной степени унаследованы дочерними клетками.

Рисунок 1. Slice культуры протокол для покадровой съемки.

Рисунок 2. Сотовые бehavior во время нормального развития спинного мозга. () Отдельные кадры из фильма 1. Сотовые выражения GFP-тубулина делит с расщеплением плоскости, перпендикулярной к апикальной поверхности (2 ч 20 мин), создавая две дочерние клетки, которые делятся еще раз (24 ч 23 мин и 25 ч 54 мин). (Б) Отдельные кадры из фильма 2. Сотовые трансфицированных GFP-GPI проходит деление клеток в течение которого базальной процесс делится (белые стрелки), и в равной степени унаследованы дочерними клетками.

Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 2. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Discussion

Мы приведем здесь роман покадровой визуализации анализа для контроля поведения клеток в культуре эмбриональных куриных срез. Этот анализ позволяет высокого разрешения живой ткани до 70 часов, хотя временные рамки между 24-48 часов легче захватить. Использование высоких цен на нефть Н.А. объективных и относительно короткие промежутки времени между точками обеспечивает получение изображений с высоким разрешением, а также позволяет нам контролировать поведение клеток, что часто происходит быстро, и могут быть легко пропущены во время обычной покадровой визуализации с помощью конфокальной микроскопии.

Основным преимуществом данного анализа является возможность изображения клеток в течение длительного периода времени. Использование широкого поля ⁶ вместо конфокальной лазерной сканирующей микроскопии ⁷ имеет решающее значение для этого. Конфокальной микроскопии традиционно предлагают несколько преимуществ по сравнению с широким полем зрения микроскопа, в том числе способность принимать оптические разделов и устранить не в фокусе информацию непосредственно 8, исключая значительный объем информации, а также необходимым более длительное время экспозиции. Широкое поле микроскопа, с другой стороны, использует полное освещение поля и весь свет, проходящий через объектив направляется в детектор. Это в сочетании с высокой квантовой эффективностью охлаждения связью (ПЗС), камера обеспечивает изображение с высоким отношением сигнал-шум по сравнению с конфокальной микроскопии ^9, с очень малым временем экспозиции. В нашем приложении, мы должны изображение в течение длительного времени, записывать 3D-стеков и в конечном итоге решать малого почти дифракционного предела структуры. Несмотря на то, конфокальной микроскопии позволяет вне фокуса свет от доходя до детектора и тем самым значительно снизить уровень фоновых в толстых, плотно-меченных образцов ^{7, 8,} только достигает использовать сигнал-шум с гораздо большей, чем свет вход широкий микроскопии ^10. Для очень светочувствительный sparselу-меченные образцы, как наши электропорации спинного кусочки мозга, поэтому широкого поля микроскопии работает лучше, чем конфокальной микроскопии. В сочетании с восстановления изображения по деконволюции, который удаляет из фокуса информации и повышает контрастность, широкие поля является то особенно хорош для обнаружения малых, слабых объектов ^11. Не подходит для любой эксперимент изображений тканей, этот подход был очень эффективным для нашей жизни приложения визуализации клеток.

Выбор флуоресцентный белок является важным фактором, который может повлиять на выживаемость клеток. Мы считаем, что наилучшие результаты получаются от конструкции, которые используют зеленый флуоресцентный белок (GFP) ¹² в качестве маркера. В настоящее время мы оценке ряда красных флуоресцентных белков, которые могут быть эффективно использована в сочетании с GFP для двухканальной временем утратит свою силу. Есть целый ряд таких белков доступно ^13. Хотя многие белки являются стабильными, как слияния с флуоресцентный белокНекоторые белки могут быть оказаны неустойчивым путем слияния, что приводит к снижению жизнеспособности клеток. В таких случаях использование конструкций содержащие внутренний сайт рибосомы запись (IRES) полезно отделить белок от флуоресцентного белка.

При визуализации спинного кусочки мозга, необходимо позаботиться, чтобы минимизировать воздействие дневного света. Микроскоп Окуляры должны использоваться только в проходящем свете (светлое), чтобы найти и положение ломтиками. Флуоресцентные изображения всегда должны быть получены с помощью микроскопа, программное обеспечение, используя минимальное время экспозиции. Они должны быть в диапазоне 5-50 мс и использование нейтральные фильтры должны быть опробованы. Несмотря на более длительное время экспозиции может сначала произвести более четкие изображения, фототоксических эффекты воздействия дневного света может привести к гибели клеток. Первые 5-10 мкм ткани, которая находится ближе всего к покровным не должны быть отображены как эта область содержит ткани, которые могут быть повреждены во времянарезки.

Хотя примеры, представленные здесь эмбрионов электропорации на этапе HH 10 и отображаемого 6-7 часов спустя, этот метод может быть использован для эмбрионов до стадии Высочеству 18. На более поздних стадиях, спинной мозг ткани намного больше, и так трудно резать вручную. В этом случае вложения эмбрионов при низкой температуре плавления агарозы и секционирования с vibratome может дать лучшие результаты. Хотя мы и представить этот анализ как метод визуализации клеток в спинной мозг развивается, этот подход также был изменен на другой изображение эмбриональных тканей, в том числе сенсорных плакод ^3.