Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Summary

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Abstract

Embriyonik spinal kord merkezi sinir sistemi (MSS) ve nöronal gliyal hücreleri büyük bir yüzdesi yol sinir hücrelerini progenitör bisiklet oluşur. Kadar moleküler mekanizmaları desen spinal kord hakkında bilinen ve nöronal farklılaşma ^{1, 2} ortaya çıkarmak olmasına rağmen, bu hücre davranış seviyesinde bu ilk etkinlik derin bir anlayış yoksundur. Onlar nörogenez geçerken, gerçek zamanlı olarak nöral progenitörlerin davranışlarını incelemek böylece önemlidir.

Erken embriyonik doku geçmişte, gerçek zamanlı görüntü hücre / doku kültüründe canlılığı gibi floresan görüntüleme fototoksik etkileri ile sınırlı kalmıştır. Burada yeni bir ex-vivo kesit kültürü protokolü ve geniş alan floresan mikroskobu (Şekil 1) kullanarak, uzun süreler için görüntüleme gibi doku için yeni bir test sunuyoruz. Bu yaklaşım civciv embriyonik s uzun vadeli time-lapse izleme ulaşıryüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip Pinal kablosu progenitör hücreler.

Bu testte geni faaliyeti için hücresel ve alt-hücresel davranışları, yeni bir gelişme ve çok hassas Muhabirlerin gözlem ek görüntü embriyonik dokular ^{3, 4,} bir dizi ile değiştirilebilir (örneğin, Çentik sinyalleşme ⁵⁾ Bu testte yapar sinyalizasyon nasıl anlamak için güçlü bir araç embriyonik gelişim sırasında hücre davranışı düzenler.

Protocol

1. Bulaşık Hazırlık

1. Kesit kültürü için kullanılan Yemekleri (WillCo yemekleri) (temel olarak bir coverslip ile) altı cam vardır. Bu cam taban temiz tutmak için 6 cm doku kültürü çanak lens dokusu yerleştirilir.
2. Deney bir gün önce, poli-L-lizin katı cam alt izin verecek şekilde, oda sıcaklığında 5dk süreyle cam dipli çanak ve inkübe 2 ml% 0.1 poli-L-lizin solüsyonu ilave edin.
3. Poli-L-lizin çözeltisi kaldırmak ve deiyonize su içinde üç kez durulama ve sonra bir defa% 70 etanol içinde.
4. Gece kurumaya bırakın. Yemekleri de yavaşça 30-45 saniye süreyle düşük güçte mikrodalga fırında ısıtılarak kurutulabilir.

2. Embriyo Elektroporasyon

1. 37 yumurta inkübe ° C Hamburger-Hamilton (HH) evre 10 (~ 36 saat) (veya diğer istenen sahne) için.
2. Başlayan cam iğneler (biz bir Flaming / Kahverengi modeli P87 microcapillary çektirmesi kullanın) hazırlamak ve needl den ucu koptu öncee bir mikroskop altında ince bir pens kullanarak. Bu DNA solüsyonu enjeksiyonu engelleyecek kadar dar olmamasına rağmen iğnenin ucunu embriyo delmek için yeterli keskinlikte olmalıdır.
3. Embriyonun iki tarafında Pencere yumurta ve yer elektrotlar (5mm)
4. Nöral tüp içine - DNA (hızlı yeşil küçük bir miktar ile boyanmaktadır deiyonize suda 0.5 mg / ml ~ 0.025) enjekte edilir.
5. Mevcut uygulama - darbeler arasında 950 ms 12-17 V üç kez, 50ms darbe uzunluğu.
6. Biz tek tek hücrelerin takip edebilirsiniz böylece mozaik ifade elde etmek için DNA düşük konsantrasyonlarda ve düşük elektroporasyon gerilim kullanın.
7. Cellotape ile yumurta kabuğu pencere Kapak ve mühürlü olduğundan emin olun.
8. Embriyoların 37 3-4 saat veya gece boyunca kurtarmak için izin ° C

3. Kollajen ve Dilim Kültür Orta Hazırlık

1. Dilimleme önce yaklaşık bir saat kollajen karışımı ve dilim kültür ortamı hazırlayın.
2. 300 ul tYPE 1 kollajen 100 ul% 0.1 asetik asit solüsyonu ve 100 ul 5 x L15, orta ekleyin. Her eklemeden sonra iyice vorteksleyin. Çözüm sarı açmalısınız.
3. Şimdi 15-20 ul% 7.5 sodyum bikarbonat ve iyice vorteks ekleyin. Çözeltisi hafif pembe olmalıdır, ve bunun için gerekli sodyum bikarbonat hacmi farklı olabilir. Buz üzerinde tutun ve her zaman taze oluşturuyor.
4. 10 ml neurobasal ortam, bir 1 x nihai konsantrasyona ve 10 ul gentamisin çözeltisine, B-27 takviyesi ve Glutamax eklemek.
5. 37 ° C inkübatör koyun orta% 5 CO ₂ ile tampon. Bu _CO2 ile dengelenmesi için izin vermek için kabın üst serbest bırakır.

4. Dilim Kültür

1. Yumurtadan embriyo çıkarın ve L15 ortamda yıkayın.
2. Bir altta sylgard tabakası ve gerildi böylece çevreleyen ekstra embriyonik zarlar yoluyla onları iğnelemek bir doku kültür kaplarına koyun.
3. Bir mikrofon kullanarakroknife, ilgi bölgesinden geçen dilim embriyonu olarak düz mümkün. Spinal kord için, kalın dilimler 1-2 Somitlerin arasında olmalıdır. Bunları kaybetmemeniz için diğer embriyolar dilim ise embriyo bağlı dilimleri bırakın.
4. Ucu ~ 1 mm kesmek ve bir p2 veya p10 bu takarak bir 200 ul mikropipet ucu hazırlayın. Bu ucu cam alt çanak omurilik dilimleri aktarmak için kullanılacaktır. A 10 ul ucu dilim almak için yeterince geniş değil.
5. Coat daha önceden hazırlanmış 1 ul kollajen karışımı pipetleme kollajen ile ucunun içinde. L15 orta ile yıkayın daha sonra 1-2 dakika bekletin ve. Bu ucu içine yapışmasını doku önleyecektir.
6. Bir microknife kullanarak embriyodan dilim ayırın ve 200 ul ucu ile donatılmış ve 1 ul ayarlanmış bir p2 veya p10 kullanarak çanak kaldırmak. Mümkün olduğu kadar az aracı olarak almaya çalışın.
7. Poli-L-Lizin kaplamalı çanak üzerindeki bu vorteks kollajen karışımı ve damla 5-8 ul.
8. Immedialarına ince forseps bir çift ile yerine kollajen ve pozisyona embriyo dilim koydu. Dilimler yansıması ile yan coverslip ile aynı hizada olacak şekilde yerleştirilmelidir. Doku coverslip üzerindeki poli-l-lizin kaplama uymalıdır.
9. Eğer coverslip birkaç dilim bulana kadar tekrarlayın. Biz genellikle bir çanak üzerine 6-9 dilim yerleştirebilirsiniz.
10. Tüm dilimler yerinde sonra, çanak kapağı ve kollajen 20 dakika ayarlamanızı sağlar. Erken yerleştirilen kollajen bazıları şimdiden kurumaya başlamış olabilir. Bu bu kapsayan önce L15 için küçük bir miktar eklemek önlemek için.
11. Bir kez, dikkatle ayarlanmış en az bir saat için 37 ° C'de% 5 CO ₂ dengelenmiş oldu 2ml dilim kültür ortamı ekleyin. Bakım coverslip gelen kollajen çıkarmak değil alınmalıdır.
12. 37 ° _/% 5 CO2 inkübatör Yeri ve dilimleri görüntüleme önce en az 3 saat kurtarmak için izin verir. Bir kutu zekâ hiç nem, yer çanak varsabir köşede nemli kağıt mendil ha biraz.

5.. Görüntüleme Embriyo Dilimleri

1. Biz görüntü dilimleri bir Weatherstation kazanı ile donatılmış bir DeltaVision Çekirdek geniş alan mikroskobu kullanın. Odacık sürekli% 5 _CO2 /% 95 hava azından mikroskop aşamasında sürdürmek için _bir CO2 perfüzyon aparatı ile 37 ° C'de muhafaza edilir.
2. Görüntüleme normalde 40 x / 1.30 NA immersiyon yağı lens kullanarak ve görüntüleri CCD kamera soğutmalı bir CoolSnap HQ2 ile yakalanan yapılmaktadır.
3. Z-bölümleri 45 mikron doku aracılığıyla her 1.5 mikron yakalanır. Pozlama süresi mümkün olduğu kadar düşük tutulmalıdır. Biz normalde her Z-bölüm için 5-50 ms için maruz. Görüntüler her 7 dakikada yakalanır ve en fazla 9 dilim fonksiyonu Ziyaret DeltaVision sistemin hassas noktası kullanarak ziyaret edilebilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bir omurilik progenitör hücre örneği time-lapse sırasıŞek. 2a ve tekabül eden film 1. Görüntüleme iki gün yaşlı (HH aşamada 12) embriyo bir omurilik dilim başlandı. Bu hücre GFP-αTubulin ifade eden bir yapı ile transfekte edildi. Bu erken aşamada, nöral progenitör hücrelerin ağırlıklı hücreleri iki tane daha bisiklet progenitör hücreler üretmek için bölmek sırasında progenitör-progenitör modu bölünmeler uğrarlar. Şekil. 2b ve tekabül eden film 2 hücre membran işaretleme, GFP-GPI (GPI GFP demirli) ile transfekte edilmiş bir hücre gösterir. Bu hücre bazal süreci ikiye böler ve eşit kızı hücreleri tarafından devralınan sırasında bir bölümü uğrar.

Şekil 1.. Time-lapse görüntüleme için Dilim kültür protokolü.

Şekil 2. Hücre bNormal omurilik gelişimi sırasında ehavior. Movie 1 (a) Seçilmiş kareleri. GFP-tubulin ifade Hücre bir kez daha (24 saat 23 dk ve 25 saat 54 dakika) bölen iki kızı üreten hücreleri, apikal yüzeye (2 saat 20 dakika) dik bir bölünme uçağı ile böler. (B) Film 2 Seçili karelerin. GFP-GPI ile transfekte Hücre bazal süreci bölünmüş (beyaz ok) ve eşit kızı hücreleri tarafından devralınan sırasında hücre bölünmesi uğrar.

Movie 1. filmi görmek için buraya tıklayın .

Film 2. filmi görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Biz tavuk embriyonik kesit kültürü hücre davranışlarını izlemek için buraya yeni bir time-lapse görüntüleme testi sunuyoruz. 24-48 saat arasında zaman kareleri yakalamak daha kolay olmasına rağmen Bu testte, 70 saate kadar canlı doku için yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Yüksek NA petrol objektif ve zaman noktaları arasında nispeten kısa aralıklarla kullanımı de bize genellikle hızlı gelişir hücre davranışlarını izlemek için izin olarak, yüksek çözünürlükte görüntü toplama sağlar, ve kolayca konfokal kullanarak geleneksel time-lapse görüntüleme sırasında atlanabilir mikroskopi.

Bu testin önemli avantajı uzun süreler boyunca görüntü hücrelere yeteneğidir. ⁷ mikroskobu konfokal lazer yerine geniş alan ⁶ kullanımı bunun için önemlidir. Konfokal mikroskop geleneksel optik kesitler alıp doğrudan odak bilgi dışarı ortadan kaldırmak için yeteneği de dahil, geniş alan mikroskopisi karşı çeşitli avantajlar sundu 8 ışık kaybına yol açmaktadır. Geniş alan mikroskopisi, diğer taraftan tam saha aydınlatma kullanan ve amacı ile, tüm geçen ışık dedektörü gönderilir. Bir yüksek kuantum verimliliği ile birleşince birleştiğinde cihaz (CCD) kamerası çok hızlı pozlama süreleri ile konfokal mikroskopi ^9, göre gürültü oranı yüksek bir sinyal ile görüntüleme sağlar soğutulur. Bizim uygulama, biz uzun süre, kayıt 3D yığınları ve sonuçta küçük yakın kırınım sınırlı yapıları çözmek için görüntü gerekir. Konfokal mikroskopi hiç dedektör ulaşmasını out-of-focus ışığı engeller ve böylece önemli ölçüde kalın, yoğun-etiketli örnekleri ^{7, 8} arka plan azaltmakla birlikte, sadece çok daha fazla ışık girişi ile kullanılabilir bir sinyal-gürültü oranı elde geniş alan mikroskopisi ^10. Çok ışığa duyarlı sparsel içinBizim electroporated omurilik dilimleri gibi y-etiketli örnekleri, bu nedenle, geniş alan mikroskopisi konfokal mikroskopi daha iyi yapar. Dekonvolüsyonun tarafından görüntü restorasyonu ile birlikte, hangi odak bilgi dışarı çıkarır ve geliştirir kontrast, geniş alan, küçük, loş nesnelerin ¹¹ tespiti için özellikle iyi o olduğunu. Her doku görüntüleme deney için uygun olmasa da, bu yaklaşım bizim canlı hücre görüntüleme uygulaması için çok etkili olmuştur.

Floresan protein seçimi hücre yaşamını etkileyebilen önemli bir faktördür. Biz iyi sonuçları bir belirteç olarak yeşil floresan protein (GFP) ¹² kullanımı yapıları elde görürüz. Şu anda etkin bir şekilde iki kanallı zaman ihmallerini GFP ile kombinasyon halinde de kullanılabilir kırmızı floresan proteinleri bir dizi değerlendirilmesi bulunmaktadır. ¹³ kullanılabilir Bu tür proteinleri bir dizi vardır. Birçok protein bir floresan protein füzyon olarak stabil olmasına rağmen, Bazı proteinler düşük hücre canlılığı ile sonuçlanan, füzyon ile kararsız kılınabilir. Bu gibi durumlarda, dahili bir ribozom giriş sitesi (IRES) içeren yapıları kullanımı flüoresan protein ilgili proteini ayırmak için yararlıdır.

Zaman görüntüleme spinal kord dilimleri, bakım floresan ışığına maruz kalma en aza indirmek için alınması gerekir. Mikroskop mercekleri dilimleri bulun ve pozisyona geçen ışık (aydınlık) ile kullanılabilir olmalıdır. Floresan resimler her zaman az pozlama süreleri kullanarak mikroskop yazılımı kullanılarak elde edilmelidir. Bunlar, 5-50 ms aralığında tutulması ve nötr yoğunluğu filtrelerin kullanımının deneyler edilmelidir. Uzun pozlama süreleri başlangıçta daha net görüntüler üretmek olsa da, floresan ışıkta fototoksik etkilerini hücre ölümüne yol açabilir. Bu bölgede sırasında zarar görmüş olabilen doku içerir coverslip en yakın olan doku ilk 5-10 mikron görüntülenmiştir edilmemelidirdilimleme.

Burada sunulan örnekler HH aşaması 10 ve daha sonra fazla görüntülü 6-7 saat electroporated embriyo olmakla birlikte, bu yöntem aşaması 18 HH embriyosu için kullanılabilmektedir. Daha sonraki aşamalarda, spinal kord doku çok daha büyük olduğu ve bu yüzden, elle dilim zordur. Bu durumlarda, düşük erime noktası agaroz içinde embriyo yerleştirilmesi ve bir vibratome ile kesit daha iyi sonuçlar verebilir. Biz gelişmekte olan omurilik görüntüleme hücreleri için bir yöntem olarak bu testte sunmak olsa da, bu yaklaşım aynı zamanda duyusal placodes ³ dahil olmak üzere görüntü diğer embriyonik dokular için modifiye edilmiştir.