Summary
Retrograd transport af fluorescerende farvestof mærker en sub-population af neuroner baseret på anatomiske projektion. Mærkede axoner kan visuelt målrettes
Abstract
Det overordnede mål med denne metode er at optage single-unit svar fra en identificeret population af neuroner. In vivo elektrofysiologiske optagelser fra de enkelte neuroner er afgørende for at forstå, hvordan neurale kredsløb fungerer under naturlige forhold. Traditionelt har disse optagelser udført i blinde ", hvilket betyder, at identiteten af den konstaterede celle er ukendt ved begyndelsen af optagelsen. Cellular identitet kan efterfølgende bestemmes via intracellulære 1 juxtacellular 2 eller løs-patch 3 iontophoresis farvestof, men disse optagelser kan ikke på forhånd rettet mod bestemte neuroner i regioner med funktionelt heterogene celletyper. Fluorescerende proteiner kan udtrykkes i en celle-typespecifik måde tillader visuelt guidet encellede elektrofysiologi 4-6. Men der er mange modelsystemer som disse genetiske værktøjer ikke er tilgængelige. Selv i genetisk tilgængelige modelsystemer, det ønskede promoter kan være ukendt eller genetisk homogene neuroner kan have varierende projektion mønstre. Tilsvarende er virale vektorer blevet anvendt til at mærke specifikke undergrupper af projektion neuroner 7, men brugen af denne metode er begrænset af toksicitet og mangel på trans-synaptisk specificitet. Således er yderligere teknikker, der tilbyder særlige pre-visualisering til at optage fra identificerede enkeltstoffer neuroner in vivo nødvendig. Pre-visualisering af målet neuron er særlig anvendelig til udfordrende optageforholdene, hvor klassiske encellede optagelser ofte uoverkommeligt vanskelig 8-11. Den nye teknik beskrevet i denne meddelelse anvender retrograd transport af et fluorescerende farvestof anvendes ved hjælp wolfram nåle til hurtigt og selektivt mærke en specifik undergruppe af celler inden for en bestemt område af hjernen baseret på deres unikke aksonal fremspring, hvorved der tilvejebringes en visuel at opnå målrettede elektrofysiologiske optagelser fra identificerede neuroner i en intakt kredsløb withina hvirveldyr CNS.
Den mest markante roman udvikling af vores metode er brugen af fluorescerende mærkning til at målrette specifikke celletyper i en ikke-genetisk tilgængelig modelsystem. Svagt elektrisk fisk er en fremragende model system til at studere neurale kredsløb i vågen tilstand, opfører dyr 12.. Vi udnyttet denne teknik til at studere sensorisk behandling med "små celler" i den forreste exterolateral kerne (ELA), i svagt elektrisk mormyrid fisk. "Små celler" er en hypotese at være tid komparator neuroner vigtige til påvisning submillisecond forskelle i ankomsttider for præsynaptiske pigge 13.. Imidlertid har anatomiske træk såsom tæt myelin, opsluger synapser, og små cellelegemer gjort det yderst vanskeligt at optage fra disse celler ved hjælp af traditionelle metoder 11, 14. Her viser vi, at vores ny metode selektivt mærker disse celler i 28% af præparater, der giver mulighed for pålidelige, robuste optagelser og charactefinitioner, godkendelse af svar til electrosensory stimulation.
Protocol
1.. Forbered Dye-coatede Needles
- Elektrolytisk skærpe en 160 um diameter wolfram tråd 15.. Afsluttende nål diametre bør ligge 5-50 um. Antallet af nødvendige nåle afhænger af størrelsen af regionen blive mærket. Vi forberedte 5 nåle i 3-5 injektioner i bageste exterolateral nucleus (ELP).
- Natten før forsøget, placere en dråbe (<0,25 ul) på 2 mM dextran-konjugeret Alexa Fluor 10.000 MW farvestof på distale 100 um hver nål.
- Lad nåle til at lufttørre ved stuetemperatur, hvorefter koncentreret farvestof på spidsen. Opbevar nåle ved 4 ° C i en mørk beholder for at beskytte dem mod lys.
2.. Forbered Animal for Kirurgi
- Inducere generel anæstesi ved at anbringe fisk i en opløsning af 300 mg / L MS-222 i tank vand.
- Vejes fisk og måle Gaffellængde (spidsen af snude til gaffel halefinnen) og krop dybde (maksimal dorso-Ventral afstand i det tværgående plan). Disse målinger skal falde inden for de intervaller, der er angivet i tabel 1, således at fisken passer inde en optagelse kammer lille nok til at placere under en vand-nedsænkning mikroskop mål (figur 1).
- Immobilisere og elektrisk tavshed fisken ved at injicere 100 pi 3 mg / ml flaxedil i den dorsale kropsmuskulaturen.
- Fyld optagelsen kammer (figur 1A) med tank vand. Læg fisken ventrale side nedad på platformen i midten af kammeret (figur 1). Levere en beluftet opløsning af 100 mg / l MS-222 ved hjælp af en pipettespids placeret i fiskens mund (1-2 ml / min). Stabilisere fisk med stænger fastsat i voks placeret på begge sider af kroppen (figur 1C). Overvåg fiskens helbred ved at kontrollere for kontinuerlig blodgennemstrømning i okulære skibe og en normal kropsfarve.
- Rotere platformen langs sin længdeakse og sænk den bagerste ende af PLATFOrm således at den ene side af den dorsale overflade af fiskens hoved er udsat over vandet, mens resten af fiskens krop forbliver neddykket. Et lille stykke af Kimwipe bør placeres på en ikke-nedsænket del af huden for at forhindre udtørring.
3.. Kirurgi (figur 2)
Den grundlæggende kirurgiske procedure er beskrevet her er veletableret og pålideligt brugt til blinde in vivo optagelser i mormyrids 16. For andre anvendelser, udsætter de ønskede områder til mærkning og registrering. Regionen indeholder Axon terminaler cellerne af interesse skal være tilgængelig med et farvestof-coated nål. Den region, der indeholder mere proximale segmenter af de samme axoner skal have tilstrækkelig plads over vævet til at rumme distancen af vand-immersionslinse (2 mm i vores tilfælde).
- Påfør en 0,4% opløsning af lidocain til den eksponerede overflade af hovedet med en Q-tip.
- Ved hjælp af en skalpel, skæres omkredsen af et rektangulært stykke hud. Fjern rektangel med en pincet. Størrelsen af rektanglet skalerer med fiskenes størrelse, men skal være ca 3 mm x 5 mm for en 6,2 cm fisk (figur 2A). Den laterale kant af rektanglet skal flugte med midten af øjet, bør den forreste kant af rektanglet være lige posteriort for øjet, og den mediale kant af rektanglet skal være lige lateral af fiskens midterlinjen.
- Udvide udsatte skalleparti anteromedially at eksponere yderligere 2,5 mm kvadratisk ikke-overlappende område (fig. 2B).
- Helt klart og tør den blottede overflade af kraniet ved skalpelbladets at skrabe overskydende væv og Kimwipes og varmluft til at tørre overfladen (figur 2C).
- Lim en metal post til anteromediale udsatte skalleparti hjælp Super Glue. Vent, indtil limen er helt tør (Figur 2D). Fjern et rektangel af kranium, ca 2 mm x 4 mm for en 6,2 cm fisk. Brug et tandlægebor med en ~ 0,5 mm i diameter kuglemølle hårdmetalskær at fortynde omkredsen af rektanglet. Så ved hjælp af en skalpel og pincet skære omkredsen af rektanglet og skræl den væk for at afdække den underliggende hjernen. Yderligere boring eller skæring med en lille saks kan være nødvendigt for fuldt ud at eksponere EL (Figur 2E). Hvis musklen opstår blødning kan en elektrokauterisation enhed skal bruges.
- Skær både dura mater (pigmenteret) og pia mater (klar) ved hjælp af foråret saks eller en nål og fjern de afskårne dele med et par pincet. De forreste og bageste dele af exterolateral kerne (EL) er nu synlig, ELA og ELP, henholdsvis (figur 3A).
4.. Retrograd mærkning af Axoner interessepunkter
- Placer en manipulator med et farvestof-belagt nål (fremstillet i trin 1) ovenfor målområdet indeholder axoner of interest, i vores tilfælde ELP.
- Hurtigt indsætte nålen cirka 25 um i vævet. Vent 15-30 sekunder, indtil al farvestoffet er kommet ud, og derefter trække nålen.
- Gentag med yderligere friske nåle efter behov, placerer hver enkelt i en anden placering, så farvestoffet er fordelt over hele målområdet. Vi brugte 3-5 nåle pr forberedelse.
- Skyl overskydende farvestof fra hulrummet med Hickman s Ringer løsning.
- Vent mindst 2 timer for farvestofoptagelse og transport.
5.. Visualisering af Axoner interessepunkter
- Placer optagelsen kammeret sammen med fisken, under målet om en opretstående, fast-trins epifluorescerende mikroskop. Da kroppen af fisken okkluderer lysgennemtrængning, skal begge hvide og fluorescerende lyskilder kommer ovenfra. Omhyggelig placering af en fiberoptisk lyskilde over kraniet hulrum tillader tilfredsstillende lysfelt billeder. For epifluorescens visning, fluorescens filterspecifikationer bør matche absorptionen / emissionsspektret af farvestoffet.
- Skift respiration til frisk tank vand og opretholde den samme flow. Placer en jordledning i udsatte hjernens hulrum og oprette forbindelse til jorden af optagelsen hovedtrin (se 6.3).
- Placer et par af optagelse elektroder ved siden af haleroden og oprette forbindelse til en differential forstærker og optage enhed (f.eks audio monitor, oscilloskop, eller computer) til at overvåge elektrisk orgel udledning kommando (EODC). Efter fisken genindvinder fra anæstesi, kan EODC bruges som en indikator for fiskens tilstand.
- Forbered en skaleret skitse af hjernen regionen ses ved lav forstørrelse. Medtag store blodkar som landemærker (kan variere fra fisk til fisk) for at identificere den nøjagtige placering af mærket axoner synlige kun under høj forstørrelse (figur 3D).
- Bekræft farvestof placering. Først se hele væv med lysfelt belysning til orientering (
- Brug skibe som vartegn for at lokalisere Ela under stor forstørrelse. Belyse med fluorescerende lys, mens du søger efter en mærket Axon nær overfladen. (Figur 4).
6.. Optag Ekstracellulært Activity
- Træk suge registreringselektroderne hjælp 1 mm OD, 0,58 mm ID borsilikat kapillar glas med glødetråd. Ideel tip størrelse vil afhænge af diameteren af de målrettede axoner, som i vores tilfælde er 0,1-0,2 um 17.. For vores ansøgning, var elektrode tip diametre 1.5 ± 0.4 um (interval: 1,0 til 2,4 um) med en 5 mm lang, smal skaft for at nærme mærkede axoner uden at flytte det omgivende tætpakkede væv.
- Fyld elekelektroder med filtreret Hickman s Ringer-opløsning. Sidste tip modstand er 45,2 ± 38,0 MOhm (interval: 16-155 MOhm).
- Anbring elektroden i en elektrode holder med et tryk, og slut den til en forstærker hovedtrin monteret på en manipulator. Kør en trykledning fra trykporten til et T-kryds slutter i et manometer og en sprøjte til overvågning og styring af tryk, hhv.
- Slut hovedtrin til en forstærker og en analog-til-digital erhvervelse enhed.
- Med 30 mbar udadrettet tryk på elektroden linje, placere en elektrode siden af en mærket Axon. Et lavt-lysniveauet kamera interface med imaging software bruges til at visualisere pipette placering. Start nær vævsoverfladen og fremføre elektroden mod Axon. Når du nærmer dig Axon, bør udadrettet tryk forårsage en let, men mærkbar bevægelse af Axon.
- Mens elektroden ved siden af Axon, (figur 4A, top) registrere den potenteial ved elektroden samtidig præsentere test stimuli (i vores tilfælde har vi brugt 100 msek monofasiske positive og negative tværgående impulser ved en intensitet på 20 mV / cm, figur 1A). Virkningspotentialer bør ikke overholdes, selvom en elektrisk artefakt bekræfter korrekt optagelse / stimulering (figur 4A, nederst).
- Slip udadgående tryk i elektroden og gentag stimulation / optagelse. Virkningspotentialer bør alligevel ikke observeret (figur 4B).
- Anvend let (125 ± 25 mbar) sugning til elektroden og gentag stimulering / optagelse. Virkningspotentialer bør nu observeres som respons på stimulering (figur 4C). Spontan aktivitet kan også forekomme. Hvis handling potentialer ikke overholdes, slippes sugning, rydde elektrode med et let tryk, flyt elektroden lidt, og forsøg suge igen. Når handling potentialer er synlige, skal du lukke trykledningen.
- Stimulere og optage somønsket.
7.. Opsigelse og bortskaffelse
- Når alle ønskede optagelser er færdige, skifte til respiration med 100 mg / L MS-222, indtil EODC er stoppet. Ingen EODC bør detekteres i mindst 10 minutter.
- Disponere over fiskene i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og godkendte dyrepleje protokoller.
8.. Repræsentative resultater
For vores bestemt program, er vi interesserede i at studere stimulus kodning af centrale sensoriske neuroner. Succesfulde optagelser fra mærkede axoner tillader analyse af enkelt enhed reaktioner på sensorisk stimulation 18.. 5A viser repræsentative virkningspotentialer fremkaldt af tværgående electrosensory stimulation ved hjælp bipolære elektroder placeret på indersiden af venstre og højre vægge optagelsen kammeret. Spike gange kan præsenteres som et pig raster plot (fig. 5B). En 25 msek præ-stimulus optagelse vindow viser det lave niveau af spontan aktivitet. Denne særlige ela "småcellet" er lang-pass tunet til stimulus varighed på en stimulus intensitet på 6 mV / cm, øge antallet af pigge pr gentagelse som stimulus varighed stiger (figur 5C). Den gennemsnitlige første spike latenstid er 4,28 ± 0,16 msek i overensstemmelse med den forventede ventetid for små celler i ela 11..
Figur 1. Specifikationer for en optagelse kammer, der kan passe ind under målet om en fast scene epiflourescent mikroskop. (A) To-skalaen firkantet optagelse kammer lavet af plexiglas viser top-, side og ryg synspunkter. Forbundne sæt stimulerende elektroder (skjult) i periferien tillade enten tværgående (rød-sort) eller langskibs (blå-gul) stimulation. En yderligere stykke plexiglas i hjørnet, med en gummi-foret hul i midten (orange),besidder en suge pipette, der opretholder et konstant vandstand. To lodrette rustfrit stål indlæg skruet i bunden af kammeret (grønt) forbindelse til rustfrit stål indlæg (grønt omrids) er knyttet til den platform understøtter fisk (lysegrå, beskrevet i C) via justerbare disc klemmer. Et fotografi af kammeret vises under til-målskitse. (B) Individuelle og samlede visninger af de cirkulære plast disk klemmer bruges til at sikre den platform til de lodrette stolper. Hver disk klemme har en rille (grøn) til et indlæg og et midterhul til spændeskruen. Disc klemmer er roteret så rillerne er vinkelret på hinanden. Stramme skruen (rød) klemmer stillingerne i stedet for at forhindre yderligere lodrette og roterende bevægelse af platformen. (C) Front og side til-skala udsigt over plexiglas platform, der anvendes til at holde fisk i stedet. Platformen er belagt med et lag af paraffin (blå), som holder træ Dowels (sorte søjler) i stedet for at støtte fisken. Rør til respirating fisken passerer gennem et hul i »Hovedgavl« af platformen og ender i en pipettespids placeret i fiskens mund. En rustfri stål hoved indlæg (grå bjælke) forbinder til platformen via et kugleled tillader 360 graders rotation. Rustfrit stål vandrette stillinger (grøn) skrues ind hver ende af platformen. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Skematisk oversigt over kirurgi kigger ned på ryg overfladen af hovedet. (A) Lav fire snit, i den angivne rækkefølge, for at fjerne et rektangulært stykke hud (rød). (B) Udvide åbningen anteromedially at fjerne en ekstra stykke rektangulært hud (grøn). (C) Skrab eventuelle resterende fedt eller ledbånd vedflytte skalpelbladets som angivet ved pilen og tørre overfladen fuldstændigt med Kimwipes og tvungen luft. (D) Lim en rustfri stål post til kraniet ved Super Glue. Målestokken i A gælder for AD. (E) Brug en tandlægebor at lave fire nedskæringer i den angivne rækkefølge, for at fjerne et rektangulært stykke knogle (blå), og udsætter den forreste og bageste exterolateral kerner (ELA og ELP, henholdsvis) . Klik her for at se større figur .
Figur 3. Fluorescensmærkning i den bageste exterolateral kerne 3 timer efter injektion af dextran-konjugeret Alexa Fluor 568. (A) forreste og bageste exterolateral kerner (ELA og ELP, henholdsvis) visualiseret med lysfelt belysning fra oven. Bemærkat den omfattende myelination inden ELA giver det en relativt lyst udseende, der adskiller den fra ELP. (B) Samme område visualiseret ved hjælp epifluorescens ses gennem et TRITC filter. (C) Et flettede billede ved hjælp af blå for A (lysfelt) og rød for B (TRITC). (D) Eksempel på en skaleret tegning af ela og ELP herunder større blodkar (røde linjer), der kan bruges som pejlemærker at identificere den præcise placering af mærkede axoner synlige kun under høj forstørrelse (den nøjagtige placering af blodkar varierer fra fisk til fisk). Stiplede linje angiver grænsen mellem ela og ELP. (E) Sample billeder erhvervet ved hjælp af en TRITC filter fra 5 forskellige præparater, der illustrerer en række vellykkede mærkning mønstre af småcellet axoner og SOMA i ela.
Figur 4.. Single-unit ekstracellulære optagelsefra en mærket Axon. (A) Optagelse elektrode (pilespids) under positivt pres, der lægges op til et mærket småcellet axon i ela (øverst) registrerer kun kant artefakt (pilespidser) som reaktion på en 100 msek 20 mV / cm monofasiske, kontralaterale-positiv, tværgående firkantet puls (nederst). (B) Frigivelse udadrettet tryk fra elektroden (pilehoved) får Axon at bevæge sig en anelse mod elektroden (øverst), men der er stadig ingen reaktioner på stimulus (nederst). ( C) let undertryk trækker Axon ind elektroden (øverst, pil hoved) og handling potentialer som reaktion på stimulus debut er nu synlige (nederst, asterisk). Underdelene af alle tre paneler er overlejret svar på 20 gentagelser af stimulus.
Figur 5. Repræsentative resultater med denne teknik. (A) 5 prøve sporviser virkningspotentialer fremkaldt af en 0,1 msek 6 mV / cm monofasiske, kontralateral-positive, tværgående firkantet puls stimulus. (B) Raster plot viser spike gange i løbet af 20 gentagelser af en 75 msek optagelse vinduet for samme enhed stimuleret til tiden 0 med 6 mV / cm stimuli på den række af varigheder, der er anført til højre. (C) Varighed tuning kurve kvantificerer svarene vises i raster som pigge pr stimulus gentagelse.
| Masse (g) | Gaffellængde (cm) | Husdybde (cm) | |
| Mean | 2,42 | 6,20 | 1.14 |
| Standardafvigelse | 0,64 | 0,52 | 0.18 |
| Range | 1,2-4,0 | 5,5-8,4 | 0,9-1,6 |
Tabel 1. Optimalvægt, længde og Husdybde intervaller for fiskene. Optimal vægt, gaffellængde (spidsen af snude til gaffel halefinnen) og krop dybde (maksimal dorso-ventral afstand i det tværgående plan) varierer tillader fisk at passe i optagelsen kammer illustreret i Figur 1. Fisk, der er for små, kan være mindre tilbøjelige til at overleve operationen og vil have en lille ELP, gør farvestof placering udfordrende. Fisk, der er for store, vil have en stor over-rækkende lillehjernen, der vil reducere adgangen til ela og ELP og kan forhindre sænkning af høj effekt, vand-immersionsobjektivet tæt nok til at fokusere på ela og ELP.
| Ansøgning site | Dye Type | Fisk forsøgt | Label i ela | Label i ELP | Enheder forsøgt | Optagelser |
| ELa | Alexa Fluor injektion | 32 | 26 (81,2%) | 19 (59,4%) | 50 | 4 (8,0%) |
| Ela | Alexa Fluor gennemvædet filtrerpapir | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ela | Di-I i DMSO | 8 | 6 (75,0%) | 0 | 0 | 0 |
| Ela | Di-O-krystaller | 5 | 3 (60,0%) | 2 (40,0%) | 9 | 0 |
| ELP | Solid Alexa Fluor krystaller | 2 | 0 | 2 (100%) | 0 | 0 |
| ELP | Alexa Fluor overtrukne wolfram ledninger | 43 | | 41 (95,3%) | 119 | 26 (21,8%) | |
Tabel 2. Succes rater for hvert farvestof injektion metode. Succes satser for hver farvestof injektion metode. Metoder er opdelt baseret på injektionsstedet og farvestof type. For hver metode, forsøgte det samlede antal fisk og procentdelen af disse eksperimenter, der resulterede i en vellykket mærkning i ela og ELP vises. Bemærk, at den tilsigtede optagelse område er det modsatte af påføringsstedet (fed skrift bokse). For injektionsstedet blev farvestofoptagelse betragtet som en succes med mærkning af både SOMA og axoner. I modsætning hertil, ved optagelsen stedet blev der kun præparater med mærkede axoner tælles som vellykkede mærkning eksperimenter. Det samlede antal forsøg enheder og procentdelen af disse enheder, der resulterede i vellykkede optagelser er også vist.
| # Af injektion sites | Gennemsnitlige mængde pr injektion (ul) | Vifte af volumener pr injektion (ul) | Gennemsnitlige samlede injektionsvolumen (ul) | Vifte af den samlede injektionsvolumener (ul) | |
| Microinjector med Hamilton | 3 eller 4 | 0.144 | 0,091-0,91 | 0.516 | 0,378-0,669 |
| Nanoinjector med glaspipette | 2 - 4 | 0,069 (fast) | Fast volumen injiceres 1-6 gange | 0,621 | 0,414-0,966 |
| Microinjector med glaspipette | 2-6 | 0.093 | 0,058-0,202 | 0.360 | 0,252 til 0,540 |
Tabel 3. Mængder af farvestof for hver af de tre metoder anvendes til at injicere AlEXA Fluor i ela mængder farvestof anvendt for hver af de tre metoder, der anvendes til at injicere Alexa Fluor i ela (første metode fra tabel 2). Dye injektion i ela blev udført med både en nanoinjector og en microinjector hjælp af enten en 33 gauge Hamilton kanyle eller trukket glas kapillar pipette. Vi varierede antallet af injektionssteder, mængden per injektion og det samlede volume af farvestof injektion.
Discussion
Når mestrer, vil denne teknik tillader en at målrette identificerede neuroner, herunder individuelle axoner, til in vivo optagelser i mange modelsystemer. Desuden giver denne teknik ét til pålideligt optage spike output fra neuroner med unikke anatomiske karakteristika, der gør traditionelle in vivo indspilningsmetoder udfordrende. Vi har udnyttet denne teknik til at optage fra ela "små celler" i mormyrid svagt elektrisk fisk. Tidligere forsøg på at studerer tuning egenskaber af "små celler" var mislykkedes på grund af udfordrende optageforhold 11, 14. Lignende anatomiske træk skabe hindringer for opnåelse af single-unit optagelser fra mange forskellige hvirveldyr auditive og electrosensory neuroner 8-10. For at overvinde disse udfordringer i vores system, vi tog fordel af det faktum, at "små celler" er de eneste celler i ela at projekt til ELP. Således retrograd transport af farvestof placeret i ELP begrænser mærkning ela til "smallcelle "SOMA og axoner. Fluorescerende mærkning af axoner tilladt præcis elektrodeplacering siden mærkede axoner, hvilket gør single-unit optagelser fra identificerede celler muligt til trods utilgængelige SOMA. Vi har forsøgt somatiske optagelser, men forgæves, sandsynligvis på grund af de omgivende altopslugende synapser 11 , 17.. var imidlertid somatisk mærkning tydeligt antyder, at denne teknik kan anvendes til at målrette somatiske optagelser i andre celletyper og andre kredsløb. Fluorescerende mærkning af neuroner gennem retrograd transport i vivo er blevet anvendt til at styre målrettede optagelser in vitro 19-21 . En lignende teknik blev brugt til målrettet in vivo optagelser fra motoriske neuroner i zebrafisk rygmarven 22.. Vores arbejde repræsenterer en ny udvidelse af denne tilgang, hvor både mærkning og registrering er færdig in vivo i hjernen. Vores metode viser, at in vivo mærkning af CNS områder med en retrograd tracer kan udvides til undersøgelse af andre intakte kredsløb med tilsvarende selektive projektion neuroner. For eksempel, i pattedyr auditive behandling inferior colliculus (IC) tjener som en vigtig relæ center for input fra flere rhombencephalic strukturer 23. Farvestof injektion i IC selektivt ville mærke de projektion celler fra hver af disse kerner. Den overlegne colliculus (SC) serverer en lignende funktion for visioner 24.. Rygmarv præparater er særligt velegnet til denne teknik, da rygmarven nemt tilgås, kan farvestof injektion forekomme langt fra optagelsen site, og det kan kombineres med intracellulær optagelse og fyldning af udvalgte neuroner at erhverve mere detaljerede anatomiske oplysninger 25.. Endelig tarmkanalen-sporing er en veletableret teknik, der anvendes i hele det centrale nervesystem til at kortlægge komplekse kredsløb 26. Vores metode kan anvendes til at tilføje funktionel information til disse undersøgelser, som er blevet gjort wed calcium-sensitive indikatorer i cat visuelle cortex 27..
Operationen, som er veletableret, pålidelig, og anvendes regelmæssigt til blinde in vivo optagelser 16, skal udfyldes med minimal blødning og ingen skader på overfladen af hjernen for at tillade dyret og væv til at overleve. Med praksis, kan kirurgi og farvestoffet ansøgning være afsluttet i 30-45 minutter. Vi har med held mærket "småcellet" axoner i 67% af forberedelserne. De fleste præparater har kun 1 eller 2 synlige mærkede axoner, men nogle har så mange som 8. Af de 119 mærket forsøgt enheder opnåede vi single-unit optagelser fra 26 enheder fordelt over 12 præparater (tabel 2). Således blev der indsamlet data fra 41% af præparater med mærket axoner til en samlet succesrate på 28%.
Den kritiske aspekt af farvestof ansøgning mærkning dybde. Lavvandet indsættelse af wolfram ledning vil resultere i farvestoffet bliver vasket away. Men hvis indtrængningen er for dybt, vil mærket axoner ikke være synlig for målretning. Endvidere må nogle mekaniske skader på cellen forekomme farvestoffet til at blive tilstrækkeligt taget op 25, 28. Imidlertid vil for meget skade dræbe cellerne. Vi forsøgte mærkning med andre farvestoffer og andre metoder (tabel 2), herunder anterograd mærkning gennem farvestof injektion i ela parret med optagelse fra mærkede axoner i ELP (tabel 3). Vi hypotesen, at anterograd mærkningen ikke var en succes, fordi mærkning var begrænset til celler med somatiske skader, hvilket gør dem reagerer. Derudover kan præsynaptiske terminaler være blevet forstyrret. Derimod minimerer retrograd mærkning begge disse bekymringer. Mængden og placeringen af farvestof ansøgning kan ændres i henhold til den særlige kredsløb blive undersøgt. Maksimal mærkning sker med den største farvestofkoncentrationen, som vi opnåede ved hjælp af belagte wolfram ledninger. Men for mærkning axoner med deep fremskrivninger kan farvestof kommet fra en tungsten nål, som det er avanceret. I disse tilfælde vil trykindsprøjtning være mere passende. Farvestofoptagelse og transport er hurtig, med mærkede axoner i vores forberedelse bliver synlig så tidligt som 2 timer efter injektion og yderligere mærket axoner optræder så sent som 6 timer efter injektion. Således kan mærkning og registrering ske på en enkelt dag, fjerne tekniske vanskeligheder forbundet med overlevelse kirurgi. Timing vil variere for hver applikation afhængigt af afstanden kræves for farvestof transport.
Et andet kritisk aspekt er elektrodeplacering. Det er vigtigt at indtaste væv tæt på webstedet af det mærkede axon at forhindre tilstopning af spidsen. For tæt væv, såsom i Ela minimerer en lang, tynd skaft på optagelsen elektroden overskydende bevægelse af omgivende væv. Hvis det lykkes optagelse ikke opnås ved første forsøg, gentag med friske elektroderne, indtil en optagelse er opnået, eller Tissue er forstyrret til det punkt, hvor Axon ikke længere er synlig. Men det er også vigtigt hurtigt at placere elektroden ved siden Axon at minimere mængden af fluorescerende eksponering, hvilket kan forårsage fototoksicitet, blegning og kan påvirke fysiologiske egenskaber af cellen 29-31.
Når et segment af Axon succesfuldt suges ind i elektrode, kan optagelser opnås i flere timer. Hvis enhederne konsekvent tabt i mindre end 1 time, overveje at gøre mindre elektrode tips til at forhindre Axon glide ud. På den anden side kan en for lille spids resultere i tilstopning, lavt signal-til-støj, eller skade på Axon. En støt fald i spike amplitude og "tilbagevenden 'af en enhed med ekstra sug er en indikation af, at spidsen er for stor. For meget sugning kan forårsage uoprettelig skade på Axon. En løsning er at tillade en lille læk i luftledningen så trykket langsomt vender tilbage til nul. Hurtigt udligne the tryk vil resultere i en forbigående relativ-passiv "push", som kan udvise Axon.
Selv om denne teknik er en stor fordel for at opnå målrettede optagelser fra identificerede projektion neuroner, vil det ikke være nyttigt for at skelne lokale interneuroner, som farvestof vil blive taget op af alle celletyper på injektionsstedet. Teoretisk kan brug af flere fluorophores med separate injektionssteder tillade denne metode, der skal udvides. For eksempel kunne sammenligning af enkelt-versus dobbelt-mærkning anvendes til at skelne interneuroner fra projektion neuroner efter dobbelt injektioner på to punkter i kredsløbet 32.. Tilsvarende kan retrograd sporstoffer kombineres med andre avancerede billeddiagnostiske teknikker, såsom to-foton billedbehandling, som det skete for nylig i zebra finke High Vocal center (HVC) 32. Også, du optager områder begrænset til dem nær overfladen, når du bruger epifluorescens mikroskoper, som vi var kun i stand til at løse 1 &mu, m strukturer inden for de første 30 um af væv. Imidlertid kunne denne dybde udvides ved brug af andre mikroskopi teknikker, såsom to-foton mikroskopi 33 eller objektiv koblede plane belysning mikroskopi 34.. Samlet denne teknik er et vigtigt fremskridt i studiet af neurale kredsløb in vivo, fordi det kan bruges til at optage fra enkelte neuroner i mange forskellige kredsløb i en række modelsystemer - herunder dem, der er relativt utilgængelige.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Finansiering fra National Science Foundation (IOS-1.050.701 til BAC), National Institutes of Health (NS54174 til SM og F30DC0111907 til AML-W.), Er Uehara Memorial Foundation og Japan Society for fremme af Science (G2205 til TK ). Vi takker Julian Meeks for hans støtte og vejledning om emnet ekstracellulære axonale optagelser. Vi takker Carl Hopkins til tilvejebringelse af en prototype optagelse kammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Gallamine Triethiodide | Sigma-Aldrich | G8134 | Flaxedil |
| Lidocaine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | |
| Hickman’s Ringer Solution | NA | NA | NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l) |
| Peristaltic Pump | Gilson or Rainin | Minipulse 3 Model 312; RP-1 | 10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter |
| Dissection Microscope | Nikon | SM2645 | |
| Super Glue | Super Glue Corporation | SGH2 | 2g tube |
| Omni Drill 35 | World Precision Instruments | 503-598 | |
| Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | 0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) |
| Low Temp Cautery Kit | World Precision Instruments | 500391 | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Dextran Conjugated Alexa Fluor 568 | Invitrogen | D-22912 | 2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings |
| Epifluorescent Microscope | Nikon | E600 FN | A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths |
| Low Power Objective | Nikon | 93182 | CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm |
| High Power Objective | Nikon | 93148 | CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm |
| White Light Source | Dolan-Jenner | Model 190 | Fiber Optic Illuminator |
| Fluorescent Light Source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | |
| Low-light Level Camera | Photometrics | CoolSnap ES | |
| Digital Manometer | Omega Engineering | HHP-201 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV-7B | Axon Instruments |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | Axon Instruments |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Axon Instruments |
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ’0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament |
| Pipette Glass | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) |
References
- Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus. J. Physiol. 566, 425-441 (2005).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).
- Margrie, T. W. Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo. Neuron. 39, 911-918 (2003).
- Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, e6099 (2009).
- Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons. J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).
- Lehman, M. N. Herpes simplex virus as a transneuronal tracer. Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).
- Joris, P. X. A dogged pursuit of coincidence. J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).
- Heiligenberg, W., Rose, G. Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia. J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).
- Morales, E. Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS. Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).
- Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish. J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).
- Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish. ILAR. J. 50, 361-372 (2009).
- Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish. J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).
- Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior. J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).
- Carlson, B. A. Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior. J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).
- Mugnaini, E., Maler, L. Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis. Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).
- Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection. J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).
- Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system. Brain Res. 486, 334-339 (1989).
- Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature. 310, 498-500 (1984).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457, 1133-1136 (2009).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. Dissecting the circuitry of the auditory system. Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).
- Wurtz, R. H., Albano, J. E. Visual-motor function of the primate superior colliculus. Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).
- O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques. Methods. 30, 49-63 (2003).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Gahtan, E., O'Malley, D. M. Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish. J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J. Physiol. 550, 159-167 (2003).
- Mennerick, S. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).
- Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons. J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).
- Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning. Nature. 463, 948-952 (2010).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
