Summary
Retrograd transport av fluorescerande färg märker en sub-population av nervceller baserat på anatomiska projektion. Märkta axoner kan visuellt inriktade
Abstract
Det övergripande målet med denna metod är att spela single-unit svar från en identifierad population av nervceller. In vivo elektrofysiologiska inspelningar från enskilda nervceller är avgörande för att förstå hur nervbanor fungerar under naturliga förhållanden. Traditionellt har dessa inspelningar gjorts "blinda", vilket innebär att identiteten av den inspelade cellen är okänd vid början av inspelningen. Cellular identitet kan därefter bestämmas genom intracellulär 1, juxtacellular 2 eller lös-lapp 3 iontophoresis färgämne, men dessa inspelningar kan inte i förväg riktade till specifika nervceller i regioner med funktionellt heterogena celltyper. Fluorescerande proteiner kan uttryckas i en cell typspecifika sätt som medger visuellt guidad encelliga elektrofysiologi 4-6. Men det finns många modellsystem för vilka dessa genetiska verktyg inte finns tillgängliga. Även i genetiskt tillgängliga modellsystem, den önskade PROmoter kan vara okänd eller genetiskt homogena nervceller kan ha varierande projektion mönster. På liknande sätt har virala vektorer använts för att märka specifika undergrupper av projektion nervceller 7, men användningen av denna metod begränsas av toxicitet och brist på trans-synaptisk specificitet. Således är ytterligare tekniker som erbjuder specifika pre-visualisering för att spela in från identifierade enskilda nervceller in vivo behövs. Pre-visualisering av målet neuron är särskilt användbar för utmanande inspelning förhållanden, för vilka klassiska encelliga inspelningar ofta oöverkomligt svåra 8-11. Den nya teknik som beskrivs i detta dokument använder retrograd transport av ett fluorescerande färgämne appliceras med volfram nålar för att snabbt och selektivt märka en specifik delmängd av celler i en viss hjärna region utifrån sina unika axonal prognoser, vilket ger en visuell att få riktade elektrofysiologiska inspelningar från identifierade nervceller i en intakt krets withina ryggradsdjur CNS.
Den mest betydelsefulla nya framsteg i vår metod är att använda fluorescerande märkning för att rikta specifika celltyper i en icke-genetiskt tillgängligt modellsystem. Svagt elektriska fiskar är en utmärkt modell för att studera neurala kretsar i vaken, beter djur 12. Vi utnyttjade denna teknik för att studera sensorisk bearbetning av "små celler" i den främre exterolateral kärnan (ELA) av svagt elektriskt mormyrid fisk. "Små celler" är en hypotes att vara dags komparator nervceller viktiga för detektering submillisecond skillnader i ankomsttider presynaptiska spikar 13. Dock har anatomiska funktioner såsom tät myelin, engulfing synapser, och små kroppar cell gjort det extremt svårt att spela in från dessa celler med traditionella metoder 11, 14. Här visar vi att vår nya metod selektivt märker dessa celler i 28% av preparat, vilket möjliggör pålitlig, robust inspelningar och characterization av svaren på electrosensory stimulering.
Protocol
Ett. Förbered Dye-belagda Needles
- Elektrolytiskt vässa en 160 ìm diameter 15 volfram tråd. Slutliga nål spetsdiametrar bör variera från 5 till 50 | im. Antalet behövs nålar beroende på regionens storlek märks. Vi förberedde 5 nålar för 3-5 injektioner i bakre exterolateral kärnan (ELP).
- Kvällen innan experimentet, placera en droppe (<0,25 l) av 2 mM dextran-konjugerad Alexa Fluor 10.000 MW färgämne på den distala 100 nm för varje nål.
- Låt nålar för att lufttorka vid rumstemperatur och lämnar koncentrerade färgämnet vid spetsen. Förvara nålar vid 4 ° C i en mörk behållare för att skydda dem från ljus.
2. Förbered djur för kirurgi
- Framkalla narkos genom att placera fisken i en lösning av 300 mg / L MS-222 i tank vatten.
- Väg fisken och mät gaffellängd (spets nos till gaffel av stjärtfenan) och kropp djup (maximal dorso-Ventral avståndet i det tvärgående planet). Dessa mätningar bör falla inom de intervall som anges i tabell 1 så att fisken passar inuti en inspelning kammare tillräckligt liten för att placera under vattens nedsänkning mikroskopobjektiv (Figur 1).
- Immobilisera och elektriskt tysta fisken genom att injicera 100 | il av 3 mg / ml flaxedil i den dorsala kroppen muskulatur.
- Fyll inspelningen kammare (Figur 1A) med tank vatten. Placera fisken ventrala nedåt på plattformen i mitten av kammaren (figur 1). Leverera en luftad lösning av 100 mg / L MS-222 med användning av en pipettspets placeras i fiskens mun (1-2 ml / min). Stabilisera fisken med stavar som fastställs i vax placeras på båda sidor av kroppen (Figur 1C). Övervaka fiskens hälsa genom att kontrollera för kontinuerligt blodflöde i de okulära kärl och en normal kropp färg.
- Rotera plattformen längs dess långa axel och sänk den bakre änden av PLATFORM så att ena sidan av den dorsala ytan av huvudet på fisken är exponerat ovanför vattnet medan resten av fiskens kropp förblir nedsänkt. En liten bit av Kimwipe bör placeras på en icke-nedsänkta delen av huden för att förhindra uttorkning.
Tre. Kirurgi (figur 2)
Den grundläggande kirurgisk procedur som beskrivs här är väl etablerat och tillförlitligt används för blinda in vivo inspelningar i mormyrids 16. För andra applikationer, exponera de önskade områdena för märkning och registrering. Regionen innehåller axonterminaler av cellerna av intresse skall kunna nås genom ett färgämne-belagda nålar. Regionen innehållande mer proximala segment av samma axoner ha tillräckligt med utrymme ovanför vävnaden att rymma arbetsavståndet av typen vatten-nedsänkning lins (2 mm i vårt fall).
- Applicera en 0,4% lösning av lidokain på den exponerade ytan av huvudet med hjälp av en tops.
- Använda ett skalpellblad, skär omkretsen av en rektangulär bit hud. Ta rektangeln med hjälp av en pincett. Storleken på rektangeln skalas med fiskens storlek, men bör vara ca 3 mm x 5 mm för en 6,2 cm fisk (Figur 2A). Den laterala kanten av rektangeln bör anpassa sig till mitten av ögat, bör den främre kanten av rektangeln vara precis posteriort om ögat, och den mediala kanten av rektangeln ska vara precis lateralt om fiskens mittlinjen.
- Expandera den exponerade skallen regionen anteromedially att exponera ytterligare 2,5 mm kvadratisk icke-överlappande området (Figur 2B).
- Helt klart och torka den exponerade ytan av skallen med skalpell blad för att skrapa bort överflödigt vävnad och Kimwipes och varmluft för att torka ytan (figur 2C).
- Limma en metall post till anteromedial exponerade skallen region med superlim. Vänta tills limmet är helt torrt (Figur 2D). Ta bort en rektangel av skallen, ca 2 mm x 4 mm för en 6,2 cm fisk. Använd en tandläkarborr med en ~ 0,5 mm i diameter kulkvarn hårdmetallskär att tunna omkretsen av rektangeln. Med användning av en skalpell och pincett, skär omkretsen av rektangeln och skala bort det för att exponera den underliggande hjärnan. Ytterligare borrning eller skärning med en liten sax kan vara nödvändigt för att till fullo exponera EL (Figur 2E). Om muskel blödning uppstår, kan en diatermi enhet användas.
- Skär bort både dura mater (pigmenterad) och Pia mater (klar) med Spring sax eller en nål och ta bort de avskurna delarna med en pincett. De främre och bakre delarna av exterolateral kärnan (EL) är nu synliga, ELA och ELP, respektive (figur 3A).
4. Retrograd Märkning av axoner av intresse
- Placera en manipulator med en dye-belagd nål (gjord i steg 1) över målet regionen innehåller axoner av intressantat, i vårt fall ELP.
- Snabbt in nålen ca 25 um i vävnaden. Vänta 15-30 sekunder, tills all färg har lossnat, och sedan dra in nålen.
- Upprepa med ytterligare friska barr som behövs, placera var och en i en annan plats så att färgen fördelas över hela målområdet. Vi använde 3-5 nålar per beredning.
- Skölj överskottsfärg från hålrummet med Hickman Ringer lösning.
- Vänta minst 2 timmar för färgämnesupptagning och transport.
Fem. Visualisering av axoner av intresse
- Placera inspelningen kammaren, tillsammans med fisken, under målet om en upprätt, fast-stadiet epifluorescensmikroskop. Eftersom kroppen av fisken täpper ljuspenetrering, måste både vita och fluorescerande ljuskällor kommer från ovan. Noggrann placering av en fiberoptisk ljuskälla ovanför skallen hålighet tillåter tillfredsställande brightfield bilder. För epifluorescens visning, fluorescens filterspecifikationer ska matcha absorptions / emissionsspektrum av färgämnet.
- Växla andning till frisk tank vatten och bibehålla samma flödeshastighet. Placera en jordkabel i exponerade hjärnan hålrum och ansluter till marken av inspelningen headstage (se 6.3).
- Placera ett par registreringselektroderna bredvid svansroten och ansluta till en differential förstärkare och inspelningsenhet (t.ex. audio monitor, oscilloskop, eller dator) för att övervaka den elektriska kommandot orgel urladdning (EODC). Efter fisken återhämtar sig från anestesi, kan EODC användas som en indikator på fiskens tillstånd.
- Förbered en skalad skiss av hjärnregion ses vid låg förstoring. Inkludera större blodkärl som landmärken (kan variera från fisk till fisk) för att identifiera den exakta platsen för märkta axoner synliga endast under hög förstoring (Figur 3D).
- Bekräfta färgämne placering. Först visa hela vävnad med ljusfält belysning för orientering (
- Använd de fartyg som landmärken för att hitta ELA under hög förstoring. Belys med fluorescerande ljus när han letade efter en märkt axon nära ytan. (Figur 4).
6. Spela in Extracellulär aktivitet
- Dra elektroder sug inspelning med 1 mm OD, 0,58 mm ID borosilikatglas kapillär glas med glödtråd. Ideal spetsstorlek beror på diametern av målet axoner, som i vårt fall är 0,1-0,2 um 17. För vår ansökan, var elektrod spetsdiametrar 1,5 ± 0,4 pm (intervall: 1,0-2,4 mikrometer) med en 5 mm lång, smal skaft för att närma märkta axoner utan att flytta den omgivande tätt packade vävnad.
- Fyll eltroder med filtrerad Hickmans Ringer-lösning. Sista tips motståndet är 45,2 ± 38,0 Mohm (intervall: 16-155 MQ).
- Placera elektroden i en elektrodhållare med ett tryck port och anslut den till en förstärkare headstage monterad på en manipulator. Kör en tryckledning från trycket hamnen till en T-korsning slutar i en manometer och en spruta för att övervaka och kontrollera tryck, respektive.
- Anslut headstage till en förstärkare och en analog-till-digital ackvisitionsanordningen.
- Med 30 mbar tryck utåt i elektroden linje, placera en elektrod intill en märkt axon. En låg ljusnivå kamera gränssnitt med imaging programvara används för att visualisera pipett placering. Börja nära vävnaden ytan och föra elektroden mot axonet. När du närmar dig axonet, bör den yttre trycket orsaka en liten, men märkbar rörelse axonet.
- Medan elektroden är bredvid axonet, (figur 4A, överst) registrera den potentaIAL vid elektroden samtidigt presentera testa stimuli (i vårt fall använde vi 100 ms monofasiska positiva och negativa tvärgående pulser vid en intensitet på 20 mV / cm; Figur 1A). Aktionspotentialer bör inte iakttas, även om en elektrisk artefakt bekräftar ordentlig inspelning / stimulering (Figur 4A, botten).
- Släpp utåtriktat tryck på elektroden och upprepa stimulans / inspelning. Aktionspotentialer bör ändå inte observeras (Figur 4B).
- Applicera lätt (125 ± 25 mbar) sug till elektroden och upprepa stimulans / inspelning. Aktionspotentialer bör nu observeras som svar på stimulering (Figur 4C). Spontan aktivitet kan också förekomma. Om aktionspotentialer inte följs, släpper sug, rensa elektroden med lätt tryck, flytta elektroden något, och försök sug igen. När aktionspotentialer är synliga, stäng tryckledningen.
- Stimulera och spela in somönskas.
7. Uppsägning och kassering
- När alla önskade inspelningar är klar, växla till andning med 100 mg / L MS-222 tills EODC har stoppats. Ingen EODC bör påvisas under minst 10 minuter.
- Avyttra fisken i enlighet med institutionella riktlinjer och godkända djur protokoll vård.
8. Representativa resultat
För vår särskild applikation, är vi intresserade av att studera stimulans kodning av centrala sensoriska neuroner. Lyckade inspelningar från märkta axoner tillåter analys av en enda enhet svar på sensorisk stimulering 18. Figur 5A visar representativa aktionspotentialer framkallas av tvärgående electrosensory stimulering med bipolära elektroder placerade på insidan av den vänstra och högra väggar inspelningen kammaren. Spike gånger kan presenteras som en spik raster plot (figur 5B). En 25 msek före stimulus inspelning vindow visar den låga nivån av spontan aktivitet. Denna speciella ELA "småcellig" är lång-pass avstämd till stimulus varaktighet vid en stimulusintensitet av 6 mV / cm, öka antalet spikar per upprepning som ökar stimulusduration (Figur 5C). Medelvärdet första spiken latens är 4,28 ± 0,16 ms, överensstämmer med den förväntade latens för små celler i ela 11.
Figur 1. Specifikationer för en inspelning kammare som kan passa under målet om ett fast steg epiflourescent mikroskop. (A) Till skala fyrkantig inspelning kammare gjorda av plexiglas visar toppen, sidan och tillbaka utsikt. Parade uppsättningar av stimulerande elektroder (asterisker) i periferin möjliggöra antingen tvärgående (röd-svart) eller longitudinell (blå-gul) stimulering. En extra bit plexiglas i hörnet, med en gummi-fodrad hål i mitten (orange),innehar ett sug pipett som upprätthåller en konstant vattennivå. Två vertikala rostfria inlägg skruvade i botten av kammaren (fast grön) ansluta till rostfria inlägg (grön kontur) fästa vid plattformar som hanterar fisken (ljusgrå, som beskrivs i C) via justerbara skiva klämmor. Ett fotografi av kammaren visas under till-skalenlig ritning. (B) Enskilda och sammansatta vyer av de cirkulära plastskiva klämmor används för att säkra plattformen till de vertikala stolparna. Varje skiva klämma har ett spår (grön) för en post och ett centrumhål för spännskruven. Disc klämmor är svängda så att spåren är vinkelräta mot varandra. Åtdragning av skruven (röd) klämmor stolparna på plats för att förhindra ytterligare vertikal och roterande rörelse av plattformen. (C) Främre och från sida till skala vyer av plexiglas plattform som används för att hålla fisken på plats. Plattformen är belagd med ett skikt av paraffin vax (blå) som rymmer trä Dowels (svarta staplar) på plats för att stödja fisk. Slangar för respirating fisken passerar genom ett hål i "headboard" av plattformen och slutar i en pipettspets placeras i fiskens mun. En rostfri huvud inlägget (grå stapel) ansluter till plattformen via en kulled möjliggör 360 graders rotation. Rostfria horisontella inlägg (grön) är inskruvade i vardera änden av plattformen. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Schematisk översikt av kirurgi tittar ner på den dorsala ytan av huvudet. (A) Gör fyra snitt, i angiven ordning, att ta bort en rektangulär bit hud (rött). (B) Förläng öppningen anteromedially att ta bort ytterligare en rektangulär bit av huden (grön). (C) Skrapa bort eventuella kvarvarande fett eller ligament frånflytta skalpell blad som indikeras av pilen och torka ytan helt med Kimwipes och forcerad luft. på skallen med superlim (D) Limma en rostfri post. Skala bar i A gäller AD. (E) Använd en Tandläkarborrmaskiner att göra fyra snitt, i angiven ordning, att ta bort en rektangulär bit ben (blått), utsätta den främre och bakre exterolateral kärnor (ELA och ELP, respektive) . Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Fluorescerande märkning i den bakre exterolateral kärnan 3 timmar efter injektion av dextran-konjugerad Alexa Fluor 568. (A) främre och bakre exterolateral kärnor (ELA och ELP, respektive) visualiserades med ljusa fältbelysningen ovanifrån. Anmärkningatt den omfattande myelination inom ELA ger det en relativt ljusa utseende som skiljer den från ELP. (B) Samma område visualiseras med epifluorescence betraktas genom ett TRITC filter. (C) En sammanfogad bild med blått för A (ljusfält) och rött för B (TRITC). (D) Exempel på en skalad ritning av ela och ELP inklusive större blodkärl (röda linjer) som kan användas som landmärken för att identifiera den exakta platsen för märkta axoner synliga endast under hög förstoring (den exakta platsen av blodkärl varierar från fisk till fisk). Streckade linjen visar gränsen mellan ela och ELP. (E) Exempel på bilder förvärvas med hjälp av en TRITC filter från fem olika preparat som illustrerar ett sortiment av framgångsrika märkning mönster av småcelliga axoner och SOMAS i ela.
Figur 4. Single-enhet extracellulära inspelningfrån en märkt axonet. (A) Inspelning elektrod (pilspets) under positivt tryck placeras intill en märkt småcellig axonet i ELA (överst) registrerar endast kant artefakt (pilhuvuden) som svar på en 100 ms 20 mV / cm monofasiska, kontralaterala-positiv, tvärgående fyrkantspuls (botten). (B) Släpper utåtriktat tryck från elektroden (pilspets) orsakar axonet flyttas en aning mot elektroden (överst), men det finns fortfarande inga svar på stimulus (botten). ( C) svagt undertryck drar axonet i elektroden (överst, pilspets) och potentialer åtgärder som svar på stimulans debut är nu synliga (botten, asterisk). Nedre delarna av alla tre paneler är överlagrade svar på 20 upprepningar av stimulus.
Figur 5. Representativa resultat som använder denna teknik. (A) 5 prov spårvisar aktionspotentialer framkallade av en 0,1 ms 6 mV / cm monofasiska, kontralateral-positiv, tvärgående fyrkantspuls stimulans. (B) Raster plot visar spik gånger under 20 upprepningar av en 75 ms inspelning fönster för samma enhet stimuleras vid tidpunkten 0 med 6 mV / cm stimuli på olika löptider som anges till höger. (C) Speltid stämningskurva kvantifiera svaren visas i rastret som spikar per stimulans upprepning.
| Massa (g) | Gaffel Längd (cm) | Body Djup (cm) | |
| Medelvärde | 2,42 | 6,20 | 1,14 |
| Standardavvikelse | 0,64 | 0,52 | 0,18 |
| Range | 1,2-4,0 | 5,5-8,4 | 0,9-1,6 |
Tabell 1. Optimalvikt, längd och kropp spänner djup för fisk. Optimal vikt, gaffellängd (tips på nos till gaffel av stjärtfenan) och kropp djup (maximal dorso-ventral avstånd i tvärgående planet) varierar tillåter fisken att passa in inspelningen kammaren illustreras i Figur 1. Fisk som är för liten kan vara mindre benägna att överleva operationen och kommer att ha en liten ELP, vilket färgämne placering utmanande. Fisk som är för stora kommer att ha en stor, över långtgående lillhjärnan som kommer att minska tillgången till ELA och ELP och kan förhindra sänkning av hög effekt, vatten-immersionsobjektivet tillräckligt nära för att fokusera på ela och ELP.
| Ansökan Site | Dye Typ | Fisk försökte | Etikett i ela | Tillverkare i ELP | Enheter försökte | Inspelningar |
| ELen | Alexa Fluor injektion | 32 | 26 (81,2%) | 19 (59,4%) | 50 | 4 (8,0%) |
| Ela | Alexa Fluor indränkt filterpapper | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ela | Di-I i DMSO | 8 | 6 (75.0%) | 0 | 0 | 0 |
| Ela | Di-O kristaller | 5 | 3 (60.0%) | 2 (40.0%) | 9 | 0 |
| ELP | Solid Alexa Fluor kristaller | 2 | 0 | 2 (100%) | 0 | 0 |
| ELP | Alexa Fluor belagda volfram trådar | 43 | | 41 (95,3%) | 119 | 26 (21,8%) | |
Tabell 2. Framgång priser för varje färgämne injektion metod. Framgång priser för varje färgämne injektion metod. Metoder är indelade baserat på injektionsstället och färgtyp. För varje metod försökte det totala antalet fiskar och den procentandel av dessa experiment som resulterade i framgångsrik märkning i ela och ELP visas. Observera att det riktade inspelningen området är motsatsen till applikationsstället (fetstilta lådor). För injektionsstället, var färgämnesupptagning vara framgångsrika med märkning av både SOMAS och axoner. Däremot på inspelningsplatsen, var bara beredningar märkta axoner räknas som framgångsrika märkning experiment. Det totala antalet försök enheter och andelen av dessa enheter som resulterade i framgångsrika inspelningar visas också.
| # Antal injektion sites | Genomsnittlig volym per injektion (pl) | Utbud av volymer per injektion (pl) | Genomsnittlig total injektion volym (il) | Utbud av kompletta injektionsvolymer (pl) | |
| Microinjector med Hamilton | 3 eller 4 | 0,144 | 0,091-0,91 | 0,516 | 0,378-0,669 |
| Nanoinjector med glaspipett | 2 - 4 för | 0,069 (fast) | Fast volym injiceras 1-6 gånger | 0,621 | 0,414-0,966 |
| Microinjector med glas pipett | 2 - 6 | 0,093 | 0,058-0,202 | 0,360 | 0,252 till 0,540 |
Tabell 3. Mängder av färgämne tillämpas för varje av de tre metoder som används för att injicera AlEXA Fluor in ela Mängder av färgämne som tillämpas för var och en av de tre metoder som används för att injicera Alexa Fluor in ela (första metoden från tabell 2). Dye injektion i ela utfördes med både en nanoinjector och en mikroinjektor användning av antingen en 33 gauge Hamilton-spruta nål eller en drog glaskapillär pipett. Vi varierade antalet injektionsställen, volymen per injektion och den totala volymen av färgämne injektion.
Discussion
När behärskar, kommer denna teknik tillåter en att rikta identifierade nervceller, inklusive enskilda axoner, för in vivo-inspelningar i många modellsystem. Dessutom tillåter denna teknik en att tillförlitligt registrera spik utsignal från nervceller med unika anatomiska egenskaper som gör traditionell in vivo inspelning metoder utmanande. Vi har använt denna teknik för att spela in från ela "små celler" i mormyrid svagt elektriska fiskar. Tidigare försök att studera tuning egenskaperna hos "små celler" misslyckades på grund av utmanande inspelningsförhållandena 11, 14. Liknande anatomiska funktioner skapar hinder för erhållande av singel-enhet inspelningar från flera olika ryggradsdjur auditiv och electrosensory nervceller 8-10. För att övervinna dessa utmaningar i vårt system, vi drog fördel av det faktum att "små celler" är de enda cellerna i ela det projektet till ELP. Således begränsar retrograd transport av färgämne placeras i ELP märkning ela till "småcell "SOMAS och axoner. Fluorescerande märkning av axoner tillåtna exakta elektrod placering bredvid märkta axoner, vilket gör singel-enhet inspelningar från identifierade celler möjligt trots otillgängliga SOMAS. Vi försökte somatiska inspelningar, men misslyckades, troligen beroende på de omgivande omvärvande synapser 11 , 17. Emellertid var somatisk märkningen klart synlig vilket tyder på att denna teknik skulle kunna användas för att målsöka somatiska inspelningar i andra celltyper och andra kretsar. Fluorescent märkning av neuroner genom retrograd transport in vivo har använts för att styra riktade inspelningar in vitro 19-21 . En liknande teknik användes för riktade in vivo inspelningar från motoriska nervceller i zebrafisk ryggmärgen 22. Vårt arbete representerar en ny utvidgning av detta synsätt, där både märkning och registrering görs in vivo i hjärnan. Vår metod visar att in vivo märkning av CNS-områden med en bakåtsträvande tracer kan utökas till studiet av andra intakta kretsar med liknande selektiva projektion nervceller. Till exempel i däggdjurs ljudbearbetning, tjänar sämre colliculus (IC) som ett viktigt relä center för ingångar från flera rhombencephalic strukturer 23. Dye injektion i IC skulle selektivt märka projektion celler från var och en av dessa kärnor. Den överlägsna colliculi (SC) tjänar en liknande funktion för Vision 24. Ryggmärgen preparat är särskilt väl lämpade för denna teknik, eftersom ryggmärgen är lätt att nå, kan färgämne injektion uppstå långt från inspelningsplatsen, och det kan kombineras med intracellulära inspelning och fyllning av utvalda nervceller att få mer detaljerad anatomisk information 25. Slutligen är tarmkanalen-tracing en väletablerad teknik som används i hela det centrala nervsystemet för att kartlägga komplexa kretsar 26. Vår metod kan användas för att lägga funktionell information till dessa studier som har gjorts wed kalcium-känsliga indikatorer i katten syncentrum 27.
Operationen, som är väl etablerad, pålitlig, och används regelbundet för blinda in vivo inspelningar 16, måste kompletteras med minimal blödning och ingen skada på ytan av hjärnan så att djuret och vävnaden för att överleva. Med lite övning kan operationen och färgämnet ansökan fyllas i 30-45 minuter. Vi märkt framgångsrikt "småcellig" axoner i 67% av preparaten. De flesta preparat har bara 1 eller 2 synliga märkta axoner, men en del har så många som 8. Av de märkta 119 försökte enheter, fick vi enda enhet inspelningar från 26 enheter fördelade över 12 preparat (tabell 2). Således samlades uppgifter in från 41% av beredningar märkta axoner för en total framgång på 28%.
Den kritiska aspekten av färgämne ansökan märkning djup. Kort införing av volframtråd resulterar i att färgämnet som tvättas away. Men om penetrationen är för djupt, kommer märkta axoner inte synlig för inriktning. Vidare måste någon mekanisk skada på cellen uppstå av färgämnet till adekvat tas upp 25, 28. Dock kommer för mycket skada döda cellerna. Vi försökte märkning med andra färgämnen och andra metoder (tabell 2), inbegripet anterograd märkning genom färgämne injektion i ela paras med inspelning från märkta axoner i ELP (tabell 3). Vår hypotes är att anterograd märkning var inte framgångsrik eftersom märkningen var begränsad till celler med somatiska skador, vilket gör dem svarar. Dessutom kan presynaptiska terminaler har störts. Däremot minimerar bakåtsträvande märkning båda dessa farhågor. Mängden och placeringen av färgämne ansökan kan modifieras enligt den speciella kretsen som studeras. Maximal märkning sker med största färgämneskoncentrationen, som vi uppnådde med belagda volfram trådar. Men för märkning axoner med deep projektioner, kan färgämnet lossna en volfram nål som det är avancerat. I dessa fall skulle trycksprutning vara mer lämpligt. Dye upptag och transport är snabb, med märkta axoner i våra förberedelser är synlig så tidigt som 2 timmar efter injektion och ytterligare märkta axoner uppträder så sent som 6 timmar efter injektion. Sålunda kan märkning och inspelning åstadkommas på en enda dag, avlägsna tekniska svårigheter som är förbundna med överlevnad kirurgi. Timing kommer att variera för varje applikation beroende på avståndet som krävs för dye transporter.
En annan viktig aspekt är elektrod placering. Det är viktigt att komma in i vävnaden nära platsen av den märkta axon att förhindra igensättning av spetsen. För tät vävnad såsom i ELA, minimerar en lång, tunn skaft på inspelningen elektroden överskjutande rörelse omgivande vävnad. Om en lyckad inspelning inte uppnås på första försöket, upprepa med färska elektroder tills en inspelning erhålls eller tissue är störd till den punkt vid vilken axonet inte längre är synlig. Det är emellertid också viktigt att snabbt ska elektroden intill axonet för att minimera mängden av fluorescerande exponering, som kan orsaka fototoxicitet, blekning och kan påverka fysiologiska egenskaper hos cellen 29-31.
När ett segment av axon framgångsrikt sugs in i inspelningen elektroden, kan inspelningar erhållas i flera timmar. Om enheterna är genomgående förlorat på mindre än 1 timme, överväga att göra mindre elektrod tips för att förhindra axonet från att glida ut. Å andra sidan kan en alltför liten av en spets resultera i igensättning, lågt signal-till-brus, eller skador på axonet. En stadig minskning av spik amplitud och "återvändande" för en enhet med extra sug är en indikation på att spetsen är för stor. För mycket sug kan orsaka irreparabla skador på axonet. En lösning är att tillåta en liten läcka i luftledningen så trycket långsamt återgår till noll. Snabbt utjämnande the tryck resulterar i en övergående relativ-utåt "push", som kan utvisa axonet.
Även om denna teknik innebär en stor fördel för att erhålla riktade inspelningar från identifierade projektion nervceller, kommer det inte vara användbart för att skilja lokala interneuronen, som färgämne skulle tas upp av alla celltyper vid injektionsstället. Teoretiskt kan användningen av multipla fluoroforer med separata injektionsställen så att metoden ska utökas. Till exempel kan jämföra enstaka kontra dubbel-märkningen används för att skilja interneuronen från projektion nervceller efter dubbla injektioner vid två punkter i kretsen 32. Likaså kan bakåtsträvande spårämnen kombineras med andra avancerade avbildningstekniker, såsom två-photon imaging, som skedde nyligen i zebra fink Hög Vocal centrum (HVC) 32. Dessutom är inspelningsområdena begränsade till de nära ytan vid användning epifluorescence mikroskop, som vi kunde bara lösa 1 &mu, m strukturer inom de första 30 nm i vävnad. Men, kan detta djup utökas genom användning av andra mikroskopitekniker, såsom två-photon mikroskopi 33 eller objektiv-kopplade plana belysning mikroskopi 34. Sammantaget innebär denna teknik en viktig framsteg i studiet av nervbanor in vivo eftersom det kan användas för att spela in från enskilda nervceller i många olika kretsar i olika modellsystem - inklusive sådana som är relativt otillgängliga.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansiering från National Science Foundation (IOS-1.050.701 till BAC), National Institutes of Health (NS54174 till SM och F30DC0111907 till AML-W.), Den Uehara Memorial Foundation och Japan Society för främjande av Science (G2205 till TK ). Vi tackar Julian Meeks för hans stöd och vägledning på temat extracellulära axonal inspelningar. Vi tackar Carl Hopkins för att åstadkomma en kammare prototyp inspelning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Gallamine Triethiodide | Sigma-Aldrich | G8134 | Flaxedil |
| Lidocaine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | |
| Hickman’s Ringer Solution | NA | NA | NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l) |
| Peristaltic Pump | Gilson or Rainin | Minipulse 3 Model 312; RP-1 | 10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter |
| Dissection Microscope | Nikon | SM2645 | |
| Super Glue | Super Glue Corporation | SGH2 | 2g tube |
| Omni Drill 35 | World Precision Instruments | 503-598 | |
| Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | 0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) |
| Low Temp Cautery Kit | World Precision Instruments | 500391 | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Dextran Conjugated Alexa Fluor 568 | Invitrogen | D-22912 | 2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings |
| Epifluorescent Microscope | Nikon | E600 FN | A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths |
| Low Power Objective | Nikon | 93182 | CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm |
| High Power Objective | Nikon | 93148 | CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm |
| White Light Source | Dolan-Jenner | Model 190 | Fiber Optic Illuminator |
| Fluorescent Light Source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | |
| Low-light Level Camera | Photometrics | CoolSnap ES | |
| Digital Manometer | Omega Engineering | HHP-201 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV-7B | Axon Instruments |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | Axon Instruments |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Axon Instruments |
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ’0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament |
| Pipette Glass | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) |
References
- Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus. J. Physiol. 566, 425-441 (2005).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).
- Margrie, T. W. Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo. Neuron. 39, 911-918 (2003).
- Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, e6099 (2009).
- Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons. J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).
- Lehman, M. N. Herpes simplex virus as a transneuronal tracer. Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).
- Joris, P. X. A dogged pursuit of coincidence. J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).
- Heiligenberg, W., Rose, G. Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia. J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).
- Morales, E. Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS. Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).
- Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish. J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).
- Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish. ILAR. J. 50, 361-372 (2009).
- Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish. J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).
- Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior. J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).
- Carlson, B. A. Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior. J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).
- Mugnaini, E., Maler, L. Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis. Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).
- Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection. J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).
- Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system. Brain Res. 486, 334-339 (1989).
- Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature. 310, 498-500 (1984).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457, 1133-1136 (2009).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. Dissecting the circuitry of the auditory system. Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).
- Wurtz, R. H., Albano, J. E. Visual-motor function of the primate superior colliculus. Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).
- O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques. Methods. 30, 49-63 (2003).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Gahtan, E., O'Malley, D. M. Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish. J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J. Physiol. 550, 159-167 (2003).
- Mennerick, S. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).
- Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons. J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).
- Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning. Nature. 463, 948-952 (2010).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
