Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Retrograde Fluorescent Merking Tillater målrettet Ekstracellulær Single-enhet Opptak fra Identifiserte Nerveceller doi: 10.3791/3921 Published: June 26, 2013

Summary

Retrograd transport av fluorescerende fargestoff betegner en sub-populasjon av nevroner basert på anatomisk projeksjon. Merket axoner kan visuelt målrettet

Abstract

Det overordnede målet med denne metoden er å spille inn singel-unit svar fra en identifisert populasjon av nerveceller. In vivo elektrofysiologiske opptak fra individuelle nerveceller er avgjørende for å forstå hvordan nevrale kretser fungere under naturlige forhold. Tradisjonelt har disse innspillingene er utført 'blind', som betyr identiteten til den innspilte celle er ukjent i starten av opptaket. Cellular identitet kan deretter bestemmes via intracellulære 1, juxtacellular to eller løs-patch 3 iontophoresis av fargestoff, men disse innspillingene kan ikke være pre-målrettet mot bestemte nerveceller i regioner med funksjonsmessig heterogene celletyper. Fluorescerende proteiner kan uttrykkes i en celle-type spesifikk måte tillater visuelt guidet encellede elektrofysiologi 4-6. Men det er mange modellsystemer som disse genetiske verktøy er ikke tilgjengelig. Selv i genetisk tilgjengelige modellsystemer, den ønskede promoter kan være ukjent eller genetisk homogene nevroner kan ha ulik projeksjon mønstre. Likeledes er det virale vektorer blitt brukt til å merke spesifikke undergrupper av projeksjon nevroner 7, men bruk av denne metoden er begrenset av toksisitet og mangel av trans-synaptiske spesifisitet. Dermed er flere teknikker som tilbyr spesifikke pre-visualisering å ta opp fra identifiserte enkelt nevroner i vivo nødvendig. Previsualisering av målet neuron er spesielt nyttig for utfordrende opptaksbetingelser, for der klassisk encellede opptak ofte er prohibitivt vanskelig 8-11. Romanen teknikken beskrevet i denne artikkelen bruker retrograd transport av et fluorescerende fargestoff påføres med tungsten nåler til å raskt og selektivt merke en bestemt undergruppe av celler innenfor et bestemt hjernen regionen basert på sine unike aksonale anslag, og dermed gi en visuell kø for å få målrettede elektrofysiologiske opptak fra identifiserte nevroner i en intakt krets withina virveldyr CNS.

Det vesentligste nye fremme av foreliggende fremgangsmåte er bruken av fluorescerende merking på spesifikke celletyper i en ikke-genetisk tilgjengelig modellsystem. Svakt elektrisk fisk er en utmerket modellsystem for å studere nevrale kretser i våken, oppfører dyr 12. Vi benyttet denne teknikken til å studere sensorisk prosessering av "små celler" i fremre exterolateral kjernen (ELA) for svakt elektrisk mormyrid fisk. "Små celler" er en hypotese å være tid sammenlignende nevroner viktige for å påvise submillisecond forskjeller i ankomst ganger av presynaptiske pigger 13. Imidlertid har anatomiske trekk som tett myelin, engulfing synapser, og små celle organer gjort det svært vanskelig å ta opp fra disse cellene ved hjelp av tradisjonelle metoder 11, 14. Her kan vi vise at vår ny metode selektivt betegner disse cellene i 28% av forberedelser, slik at for pålitelige og robuste innspillinger og pregetrization tiltak mot electrosensory stimulering.

Protocol

En. Forbered Dye-belagte Needles

  1. Elektrolytisk skjerpe en 160 mikrometer diameter Tungsten wire 15. Endelige nålespissen diameter bør ligge 5-50 mikrometer. Det antall nåler som trengs avhenger av størrelsen av det området som er merket. Vi utarbeidet fem nåler i 3-5 injeksjoner i bakre exterolateral nucleus (ELP).
  2. Natten før forsøket, plassere en dråpe (<0,25 mL) av 2 mM dekstran-konjugert Alexa Fluor 10.000 MW fargestoff på distale 100 mikrometer av hver pinne.
  3. Tillat nålene lufttørke ved romtemperatur, og etterlater konsentrert fargestoff på spissen. Oppbevar nålene ved 4 ° C i en mørk beholder for å beskytte dem mot lys.

2. Forbered Animal for kirurgi

  1. Indusere narkose ved å plassere fisken i en oppløsning av 300 mg / l MS-222 i tank vann.
  2. Veie fisken og måle gaffel lengde (spissen av snuten til gaffel av halefinnen) og kropp dybde (maksimal dorso-Ventral avstand i den tverrgående plan). Disse målingene bør falle innenfor de områder som er angitt i tabell 1, slik at fisken passer inne i et opptak kammer liten nok til å plassere under en vann-nedsenking mikroskopobjektiv (figur 1).
  3. Immobilisere og elektrisk slå av fisk ved å injisere 100 ul av 3 mg / ml flaxedil inn i dorsal muskulaturen.
  4. Fyll innspillingen kammer (figur 1A) med tank vann. Fisken legges ventral-siden ned på plattformen i sentrum av kammeret (fig. 1). Lever et oksygenert oppløsning av 100 mg / l MS-222 ved hjelp av en pipette plasseres i fiskens munn (1-2 ml / min.) Stabiliser fisken med stenger som er løst i voks plassert på begge sider av legemet (figur 1C). Overvåke fiskens helse ved å sjekke for kontinuerlig blodstrøm i de okulære fartøy og en normal kropp farge.
  5. Rotere plattformen langs den lange aksen og senke bakenden av PLATFOrm slik at den ene side av den dorsale overflate av fiskens hode er eksponert ovenfor vannet mens resten av fiskens kropp forblir neddykket. En liten del av Kimwipe bør plasseres på en hvilken som helst ikke-nedsenkede delen av huden for å hindre uttørking.

3. Kirurgi (Figur 2)

Den grunnleggende kirurgiske prosedyren som er beskrevet her er godt etablert og pålitelig brukes for blind in vivo opptak i mormyrids 16. For andre programmer, utsetter de ønskede områdene for merking og registrering. Regionen som inneholder axon terminaler i cellene av interesse må kunne nås av en fargestoff-belagt nål. Regionen som inneholder mer proksimale segmenter av de samme axoner må ha tilstrekkelig plass over vev for å imøtekomme den arbeidsavstand på den vann-nedsenking linse (2 mm i vårt tilfelle).

  1. Anvende en 0,4% oppløsning av lidokain til den eksponerte overflate av hodet ved hjelp av en Q-tips.
  2. Ved hjelp av et skalpellblad, kuttet omkretsen av et rektangulært stykke av huden. Fjern rektangel ved hjelp av en pinsett. Størrelsen på rektangelet skalerer med fiskens størrelse, men bør være omtrent 3 mm x 5 mm for en 6,2 cm fisk (figur 2A). Den laterale kant av rektangelet skal være på linje med midten av øyet, bør den fremre kant av rektangelet være like posterior for øyet, og den midtre kanten av rektangelet bør være like sideveis fra fiskens midtlinje.
  3. Utvid den eksponerte skallen regionen anteromedially å avsløre en ekstra 2,5 mm firkantet ikke-overlappende område (figur 2B).
  4. Helt klart og tørke den eksponerte overflaten av kraniet ved hjelp av skalpell blad for å skrape bort overflødig vev og Kimwipes og varmluft for å tørke overflaten (figur 2C).
  5. Lim en metall post til anteromedial utsatt skallen regionen ved hjelp av superlim. Vent til limet er helt tørt (figur 2D). Ta et rektangel av skallen, ca 2 mm X 4 mm for en 6,2 cm fisk. Bruk en dental drill med en ~ 0,5 mm diameter ball mill hardmetall å tynne omkretsen av rektangelet. Deretter bruker en skalpell og tang, skjære omkretsen av rektangelet og drar den bort for å avsløre underliggende hjernen. Ytterligere boring eller skjæring med liten saks kan være nødvendig å fullt avsløre EL (2E). Hvis muskel blødning oppstår, kan en electrocautery enhet brukes.
  6. Skjær bort både dura mater (pigmentert) og pia mater (klar) med våren saks eller en nål og fjern snitt deler med en pinsett. Fremre og bakre deler av exterolateral nucleus (EL) er nå synlige, Ela og ELP, henholdsvis (figur 3A).

4. Retrograd merking av Axoner av interesse

  1. Plasser en manipulator med en dye-belagt nål (laget i trinn 1) ovenfor målområdet inneholder axoner av interest, i vårt tilfelle ELP.
  2. Raskt sette nålen ca 25 mikrometer inn i vevet. Vent 15-30 sekunder, før alt fargestoffet har kommet av, og deretter trekke nålen.
  3. Gjenta med flere friske nåler som nødvendig, å plassere hver av dem på et annet sted, slik at fargen blir fordelt over hele målområdet. Vi brukte 3-5 nåler per forberedelse.
  4. Skyll overflødig fargestoff fra hulrommet med Hickman ringetonen løsning.
  5. Vent i minst 2 timer for fargestoff opptak og transport.

5. Visualisering av Axoner av interesse

  1. Plasser opptak kammeret, sammen med fisken, under hensynet til en oppreist, fast-fase epifluorescent mikroskop. Ettersom kroppen av fisk tetter lett penetrasjon, må både hvite og fluorescerende lyskilder kommer ovenfra. Forsiktig plassering av en fiberoptisk lyskilde over skallen hulrom tillater tilfredsstillende lysfeltobjektiver bilder. For epifluorescence visning, fluorescens filterspesifikasjonene skal samsvare med absorpsjon / utslipp spekteret av fargestoffet.
  2. Switch åndedrett til frisk tank vann og opprettholde den samme strømningshastighet. Plasser en jordledning i konkurranseutsatt hjernen hulrom og koble til bakken av opptaket headstage (se 6.3).
  3. Plasser et par opptak elektroder ved siden av haleroten og koble til en differensial forsterker og opptaker (f.eks lyd monitor, oscilloskop, eller datamaskin) for å overvåke elektrisk orgel utslipp kommando (EODC). Etter at fisken kommer seg fra anestesien, kan EODC bli brukt som en indikator på fiskens tilstand.
  4. Forbered en skalert skisse av hjernen regionen sett ved lav forstørrelse. Inkluder store blodårer som landemerker (kan variere fra fisk til fisk) for å identifisere den nøyaktige plasseringen av merket axoner synlig bare under høy forstørrelse (Figur 3D).
  5. Bekreft fargestoff plassering. Først se hele vev med lysfelt belysning for orientering ( (Figur 3B). ELP vil ha diffuse merking (figur 3B og 3C). Minimer fluorescenseksitasjon å begrense fotodynamisk og fototoksisk effekter av fargestoffet.
  6. Bruk skipene som landemerker for å finne ELA under høyt forstørrelse. Belyse med fluorescerende lys mens du søker etter en merket axon nær overflaten. (Figur 4).

6. Ta opp Ekstracellulær aktivitet

  1. Trekk sug opptak elektroder med 1 mm OD, 0,58 mm ID borosilikat kapillær glass med glødetråd. Ideelt dysestørrelse vil avhenge av diameteren av målet axoner, som i vårt tilfelle er 0,1-0,2 mikrometer 17.. For søknaden vår, var elektrodespissen diameter 1,5 ± 0,4 mikrometer (range: 1,0 til 2,4 mikrometer) med en 5 mm lange, smale skaft for å nærme merket axoner uten å flytte rundt tettpakket vev.
  2. Fyll electrodes med filtrert Hickman ringetonen løsning. Siste tips motstand er 45,2 ± 38,0 MΩ (område: 16-155 MΩ).
  3. Plasser elektroden i en elektrode holder med et trykk port og koble den til en forsterker headstage montert på en manipulator. Kjør en trykkledning fra trykkmåleren til et T-kryss slutter på et manometer, og en sprøyte for å overvåke og styre trykket, henholdsvis.
  4. Koble headstage til en forsterker og en analog-til-digital oppkjøp enhet.
  5. Med 30 mbar trykk utover i elektroden linje, plassere en elektrode ved siden av en merket axon. En lav-light level kamera tilkobles med bildebehandlingsprogrammer brukes til å visualisere pipette plassering. Starte i nærheten av vevsoverflaten og fremme elektroden mot axon. Når du nærmer deg axon, bør det ytre trykket føre til en liten, men merkbar bevegelse av axon.
  6. Mens elektroden er ved siden av axon, (Figur 4A, øverst) registrere potential ved elektroden mens presentere prøvestimuli (i dette eksempelet har vi brukt 100 msek monofasiske positive og negative tverrgående pulser med en intensitet på 20 mV / cm, figur 1A). Aksjonspotensialer bør ikke observert, men en elektrisk gjenstand bekrefter riktig opptak / stimulering (figur 4A, nederst).
  7. Slipp ytre press i elektroden og gjenta stimulering / opptak. Aksjonspotensialer bør likevel ikke være observert (Figur 4B).
  8. Trykk lett (125 ± 25 mbar) sug til elektroden og gjenta stimulering / opptak. Aksjonspotensialer bør nå observeres som svar på stimulering (figur 4C). Spontan aktivitet kan også forekomme. Hvis aksjonspotensialer ikke overholdes, slipper sug, fjerner elektroden med et lett trykk, flytt elektroden litt, og forsøk sug igjen. Når aksjonspotensialer er synlige, lukk press linje.
  9. Stimulere og spille inn somønsket.

7. Oppsigelse og avhending

  1. Når alle opptak er fullført, bytte til åndedrett med 100 mg / L MS-222 inntil EODC har stoppet. Ingen EODC skal påvises i minst 10 minutter.
  2. Kast fisken i henhold til institusjonelle retningslinjer og godkjente dyr omsorg protokoller.

8. Representant Resultater

For vår bestemt program, er vi interessert i å studere stimulans koding av sentrale sensoriske nerveceller. Vellykket opptak fra merket axoner tillate analyse av single-unit svar på sansestimulering 18. Figur 5A viser representative aksjonspotensialer fremkalt av tverrgående electrosensory stimulering ved hjelp av bipolare elektroder plassert på innsiden av venstre og høyre veggene i innspillingen kammer. Spike ganger kan bli presentert som en pigg raster plot (figur 5B). En 25 ms pre-stimulus opptak vindenow viser det lave nivå av spontan aktivitet. Denne spesielle Ela "small cell" er lang-pass innstilt til stimulans varighet på en stimulus intensitet på 6 mV / cm, øke antall pigger per repetisjon som stimulans varighet øker (figur 5C). Middelverdien første spike ventetid er 4,28 ± 0,16 ms, konsistent med forventet ventetid for små celler i ela 11.

Figur 1
Figur 1. Spesifikasjoner for et opptak kammer som kan passe under målsettingen om en fast scene epiflourescent mikroskop. (A) To-skala firkantet opptak kammer laget av plexiglass viser topp, side og rygg utsikt. Sammenkoblede sett av stimulerende elektroder (skjult) på periferien tillate enten tverrgående (rød-svart) eller langsgående (blå-gul) stimulering. En ekstra stykke plexiglass i hjørnet, med en gummi-lined hull i midten (oransje),har en suge-pipette som opprettholder et konstant vannivå. To vertikale rustfrie innlegg skrudd inn i bunnen av kammeret (grønt) kobles til rustfrie innlegg (grønn omriss) festet til plattformen støtter fisken (lys grå, beskrevet i C) via justerbare platen klemmer. Et fotografi av kammeret vises under to-skala tegning. (B) Individuelle og montert utsikt over de sirkulære plast plate klemmer brukes til å sikre plattformen til de vertikale innlegg. Hver plate klemmen har et spor (grønn) for et innlegg og et senterhull for strammeskruen. Platen klemmer er orientert slik i sporene står vinkelrett på hverandre. Stramme skruen (rød) klemmer innleggene på plass for å hindre ytterligere vertikal og roterende bevegelse av plattformen. (C) foran og side til omfattende utsikt over plexiglass plattformen som brukes til å holde fisken på plass. Plattformen er belagt med et lag av parafinvoks (blå) som holder tre dowels (svarte striper) på plass for å støtte fisken. Tubing for respirating fisken passerer gjennom et hull i den "hodegjerde 'av plattformen og ender i en pipettespiss plasseres i fiskens munn. Et rustfritt stål hode innlegg (grå linje) kobles til plattformen via en ball joint tillater 360 graders rotasjon. Rustfritt stål horisontale innlegg (grønn) er skrudd inn hver ende av plattformen. Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Skjematisk oversikt over operasjonen ser ned på framsiden av hodet. (A) Lag fire kutt, i angitt rekkefølge, for å fjerne et rektangulært stykke hud (rød). (B) Utvide åpningen anteromedially å fjerne en ekstra rektangulært stykke av huden (grønn). (C) Skrap av eventuelle gjenværende fett eller leddbånd etterflytte skalpell blad som pilen viser og tørk overflaten helt med Kimwipes og tvunget luft. (D) Lim en rustfritt stål post til skallen med superlim. Skalalinje i A gjelder for AD. (E) Bruk en dental drill å lage fire kutt, i angitt rekkefølge, for å fjerne et rektangulært stykke av bein (blå), utsette den fremre og bakre exterolateral kjerner (ELA og ELP, henholdsvis) . Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Fluorescerende merking i bakre exterolateral kjernen tre timer etter injeksjon av dekstran-konjugert Alexa Fluor 568. (A) Den fremre og bakre exterolateral kjerner (ELA og ELP, henholdsvis) visualisert med lyse felt belysning ovenfra. Noteat den omfattende myelination innen ELA gir den et relativt lyse utseende som skiller den fra ELP. (B) Den samme område visualisert ved hjelp epifluorescence sett gjennom en TRITC filter. (C) Et sammenslått bilde ved hjelp av blått for A (lysfelt) og rødt for B (TRITC). (D) Eksempel på en skalert tegning av ela og elp inkludert større blodkar (røde linjer) som kan brukes som landemerker til å identifisere den nøyaktige plassering av merket axoner synlig bare under høy forstørrelse (den nøyaktige plassering av blodkar varierer fra fisk til fisk). Stiplede linjen viser grensen mellom ELA og ELP. (E) Eksempelbilder anskaffet ved hjelp av en TRITC filter fra fem ulike preparater som illustrerer en rekke vellykkede merking mønstre av småcellet axoner og Somas i ELA.

Figur 4
Figur 4. Single-enhet ekstracellulære opptakfra en merket axon. (A) Opptak elektrode (pil hodet) under positivt press plassert ved siden av en merket småcellet axon i ELA (øverst) registrerer bare edge gjenstand (pil hoder) som svar på en 100 msek 20 mV / cm monophasic, kontralaterale-positive, tverrstilt firkantet puls (nederst). (B) Releasing utover press fra elektroden (pil hode) fører til at axon å bevege seg litt mot elektroden (øverst), men det er fortsatt ingen svar på den stimulans (nederst). ( C) Svakt undertrykk trekker axon inn i elektroden (topp, pil hode) og aksjonspotensialer i respons til stimulus utbruddet er nå synlige (nederst, stjerne). Bottom deler av alle tre paneler er kledde svar til 20 repetisjoner av stimulus.

Figur 5
Figur 5. Representative resultater ved å bruke denne teknikken. (A) 5 prøven sporviser aksjonspotensialer fremkalt av en 0,1 ms 6 mV / cm monophasic, kontralaterale-positive, tverrstilt firkantet puls stimulans. (B) Raster plott som viser pigg ganger i løpet av 20 repetisjoner av en 75 ms opptak vinduet for samme enhet stimulert ved tid 0 med 6 mV / cm stimuli på rekke varighet i listen til høyre. (C) Varighet tuning kurve kvantifisere svarene vises i raster som pigger per stimulus repetisjon.

Masse (g) Gaffel Lengde (cm) Body Dybde (cm)
Mener 2.42 6.20 1.14
Standardavvik 0,64 0,52 0,18
Range 1,2 til 4,0 05.05 til 08.04 0,9-1,6

Tabell 1. Optimalvekt, lengde og kropp Dybden varierer for fisk. Optimal vekt, gaffel lengde (spissen av snuten til gaffel av halefinnen) og kropp dybde (maksimal dorso-ventral distanse i tverrplan) varierer slik fisk til å passe i innspillingen kammer illustrert i Figur 1. Fisk som er for liten kan være mindre sannsynlighet for å overleve operasjonen, og vil ha en liten ELP, noe som gjør fargestoff plassering utfordrende. Fisk som er for store vil ha en stor, over omfattende lillehjernen som vil redusere tilgangen til Ela og ELP og kan hindre senking av høy effekt, vann-nedsenking objektiv nær nok til å fokusere på ela og ELP.

Søknad nettstedet Dye Type Fisk forsøkt Etikett i ela Etikett i ELP Enheter forsøkt Opptak
ELen Alexa Fluor injeksjon 32 26 (81.2%) 19 (59.4%) 50 4 (8,0%)
Ela Alexa Fluor gjennomvåt filter papir 1 0 0 0 0
Ela Di-I i DMSO 8 6 (75.0%) 0 0 0
Ela Di-O krystaller 5 3 (60,0%) 2 (40.0%) 9 0
ELP Solid Alexa Fluor krystaller 2 0 2 (100%) 0 0
ELP Alexa Fluor belagt tungsten ledninger 43 41 (95,3%) 119 26 (21,8%)

Tabell 2. Suksess for hver fargestoff injeksjon metode. Suksess priser for hver fargestoff injeksjon metode. Metoder er delt basert på injeksjonsstedet og dye type. For hver metode, forsøkt det totale antall fisk og andelen av disse eksperimentene som resulterte i vellykket merking i ELA og ELP vises. Merk at målrettet opptak området er det motsatte av søknaden hotellet (uthevet bokser). For injeksjonsstedet, ble fargestoff opptak som vellykket med merking av både Somas og aksoner. I kontrast til innspillingen området, ble det bare forberedelser med merket axoner regnes som vellykkede merking eksperimenter. Det totale antall forsøk enheter og andelen av disse enhetene som resulterte i vellykkede opptak er også vist.

# Injeksjon sites Gjennomsnittlig volum per injeksjon (ul) Utvalg av volum pr injeksjon (ul) Gjennomsnittlig total injeksjon volum (ul) Spekter av totalt injeksjonsvolumer (ul)
Microinjector med Hamilton 3 eller 4. 0.144 0,091 til 0,91 0,516 0,378 til 0,669
Nanoinjector med glass pipette 2-4 0.069 (fast) Fast volum injisert 1-6 ganger 0,621 0,414 til 0,966
Microinjector med glass pipette 2-6 0.093 0,058 til 0,202 0.360 0,252 til 0,540

Tabell 3. Mengder fargestoff gjelder for hver av de tre metodene som brukes til å injisere Alov Fluor inn ela mengder fargestoff som brukes for hver av de tre metodene som brukes til å injisere Alexa Fluor inn ELA (første metoden fra tabell 2). Dye injeksjon i ela ble utført med både nanoinjector og en microinjector ved hjelp av enten en 33 sporvidde Hamilton sprøyte nål eller en trakk glass kapillær pipette. Vi varierte antall injeksjonssteder, volum per injeksjon og det totale volumet av fargestoff injeksjon.

Discussion

Når mestret, vil denne teknikken tillater en å målrette identifiserte nevroner, inkludert individuelle axoner, for in vivo-innspillinger i mange modellsystemer. I tillegg gir denne teknikken en å pålitelig spille pigg utgang fra nevroner med unike anatomiske egenskaper som gjør tradisjonell in vivo opptak metoder utfordrende. Vi har brukt denne teknikken for å ta opp fra ELA "små celler" i mormyrid svakt elektrisk fisk. Tidligere forsøk på å studere tuning egenskapene til "små celler" var mislykket på grunn av utfordrende opptaksforhold 11, 14. Lignende anatomiske trekk skape hindringer for å skaffe enkelt enhet opptak fra mange forskjellige virveldyr auditive og electrosensory nevroner 8-10. For å overvinne disse utfordringene i vårt system, vi tok fordel av det faktum at "små celler" er de eneste cellene i ELA at prosjektet til ELP. Dermed begrenser retrograd transport av fargestoff plassert i ELP merking i ELA til "smallcelle "Somas og aksoner. Fluorescent merking av axoner tillatt presis plassering av elektrodene ved siden av merket axoner, noe som gjør enkelt enhet opptak fra identifiserte celler mulige tross utilgjengelige Somas. Vi forsøkte somatiske innspillinger, men var mislykket, trolig på grunn av de omkringliggende Engulfing synapser 11 , 17.. Imidlertid var somatisk merking klart synlig som tyder på at denne teknikken kan brukes til å målrette somatiske opptak i andre celletyper og andre kretser. fluorescerende merking av nevroner gjennom retrograd transport in vivo har vært brukt for å styre målrettede opptak in vitro 19-21 . En lignende teknikk ble brukt for målrettet in vivo opptak fra motoriske nerveceller i sebrafisk ryggmargen 22. Vårt arbeid representerer en ny utvidelse av denne tilnærmingen, der både merking og opptak er gjort i vivo i hjernen. Vår metode viser at in vivo merking av CNS-områder med en retrograd tracer kan utvides til studiet av andre intakte kretser med samme selektive projeksjon nevroner. For eksempel, i pattedyr auditiv prosessering, serverer dårligere colliculus (IC) som en viktig stafett senter for innspill fra flere rhombencephalic strukturer 23. Dye injeksjon i IC ville selektivt merke projeksjon celler fra hver av disse kjerner. Den overlegne colliculus (SC) serverer en lignende funksjon for visjonen 24. Ryggmargen preparater er spesielt godt egnet for denne teknikken, som ryggmargen er lett tilgjengelig, kan fargestoff injeksjon oppstå langt fra innspillingen området, og det kan kombineres med intracellulære opptak og fylling av utvalgte nerveceller til å skaffe mer detaljert anatomisk informasjon 25. Endelig er tarmkanalen-tracing en veletablert teknikk som brukes gjennom hele det sentrale nervesystemet å kartlegge kompleks krets 26.. Vår fremgangsmåte kan benyttes til å legge funksjonell informasjon til disse studier som har blitt utført wed kalsium-sensitive indikatorer i cat visuell cortex 27.

Operasjonen, som er godt etablert og pålitelig, og blir brukt til blind in vivo opptak 16, må være utført med minimal blødning og ingen skade på overflaten av hjernen for å tillate dyret og vev å overleve. Med praksis, kan operasjonen og dye-programmet være ferdig i 30-45 minutter. Vi lykkes merket "småcellet" axoner i 67% av forberedelsene. De fleste preparatene har bare en eller to synlige merket axoner, men noen har så mange som åtte. Av de 119 merkede enheter forsøkt, fikk vi enkelt enhet innspillinger fra 26 enheter fordelt på 12 preparater (tabell 2). Dermed ble data samlet inn fra 41% av preparater med merket axoner for en samlet suksessrate på 28%.

Den kritiske aspektet av fargestoff søknaden merking dybde. Grunt innsetting av wolfram ledning vil resultere i fargebad blir vasket away. Imidlertid, hvis inntrengning er for dypt, vil merket axoner ikke være synlig for målretting. Videre må noen mekanisk skade på cellen forekommer for fargestoffet for å være tilstrekkelig tatt opp 25, 28. Imidlertid vil for mye skade drepe cellene. Vi forsøkte merking med andre fargestoffer og andre metoder (tabell 2), inkludert anterograde merking gjennom fargestoff injeksjon i ELA sammen med opptak fra merket axoner i ELP (Tabell 3). Vi hypotese at anterograde merking ikke var vellykket fordi merking var begrenset til celler med somatisk skade, noe som gjør dem svarer. Dessuten kan pre-synaptiske terminaler har blitt forstyrret. I motsetning til dette, reduserer retrograd merking begge disse bekymringer. Mengden og plassering av fargestoff søknad kan endres i henhold til den spesielle krets som studeres. Maximal merking skjer med størst fargestoff konsentrasjon, som vi oppnådd ved hjelp av belagte tungsten ledninger. Imidlertid for merking med de axonerep anslag, kan dye kommet av en tungsten nål som det er avansert. I disse tilfellene, ville press injeksjon være mer hensiktsmessig. Dye opptak og transport er rask, med merket axoner i vår forberedelse blir synlig så tidlig som to timer etter injeksjon og ytterligere merket aksoner vises så sent som seks timer etter injeksjon. Således kan merking og opptak oppnås på en enkelt dag, eliminerer tekniske vanskeligheter forbundet med å overleve operasjonen. Timing vil variere for hvert program avhengig av avstanden kreves for dye transport.

Et annet viktig aspekt er elektrodeplasseringen. Det er viktig å gå inn i vev i nærheten av det området av den merkede axon for å hindre tilstopping av tuppen. For tett vev som i ELA, minimerer en lang, tynn skaft på innspillingen elektroden overflødig bevegelse av omkringliggende vev. Hvis en vellykket opptak ikke er oppnådd på første forsøk, gjenta med ferske elektroder til et opptak er oppnådd eller tissue er forstyrret til det punkt hvor axon ikke lenger er synlig. Imidlertid er det også viktig å raskt plasseres elektroden ved siden av axon å minimere mengden av fluorescerende eksponering, noe som kan føre til fototoksisitet, bleking og kan påvirke fysiologiske egenskaper av cellen 29-31.

Når et segment av axon er vellykket suges inn i opptaket elektrode, kan opptak fås i flere timer. Hvis enhetene er gjennomgående tapt på mindre enn en time, bør du vurdere å gjøre mindre elektrodespissene å hindre axon sklir ut. På den annen side kan for liten til en dyse resultere i tilstopping og lav signal-til-støy, eller skade på axon. En jevn nedgang i pigg amplitude og "avkastningen" av en enhet med ekstra sug er en indikasjon på at spissen er for stor. For mye suging kan forårsake uopprettelig skade på aksonet. En løsning er å tillate at en liten lekkasje i luftledningen slik at trykket langsomt går tilbake til null. Raskt utjevne the press vil føre til en forbigående relativ-utover "push" som kan utvise axon.

Selv om denne teknikken representerer en stor fordel for oppnåelse av målrettet opptak fra identifiserte projeksjon nevroner, vil det ikke være nyttig for å skille lokale interneuroner, som fargestoff ville bli tatt opp av alle celletyper ved injeksjonsstedet. Teoretisk kan bruk av flere fluorophores med separate injeksjonssteder tillate denne metoden til å bli utvidet. For eksempel kan sammenligningen av enkelt-versus dobbel merking brukes til å skille interneuroner fra projeksjon nevroner etter dobbel injeksjoner ved to punkter i kretsen 32.. På samme måte kan retrograd sporstoff kombineres med andre avanserte imaging teknikker, for eksempel to-foton bildebehandling, som ble gjort nylig i Sebrafink Høy Vocal sentrum (HVC) 32. Dessuten er opptak regioner begrenset til de nær overflaten ved bruk epifluorescence mikroskoper, som vi var bare i stand til å løse en &mu; moh strukturer innenfor de første 30 mikrometer vev. Imidlertid kan denne dybde utvides gjennom bruk av andre mikroskopi-teknikker, for eksempel to-foton mikroskopi 33 eller objektiv-koblet plane belysning mikroskopi 34.. Samlet sett representerer denne teknikken et viktig fremskritt i studiet av nevrale kretser i vivo fordi det kan brukes til å ta opp fra én nevroner i mange ulike kretser i en rekke modellsystemer - inkludert de som er relativt utilgjengelig.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Finansiering levert av National Science Foundation (IOS-1050701 til BAC), National Institutes of Health (NS54174 til SM og F30DC0111907 til AML-W.), Den Uehara Memorial Foundation og Japan Society for Promotion of Science (G2205 til TK ). Vi takker Julian Meeks for hans støtte og veiledning på temaet ekstracellulære aksonale innspillinger. Vi takker Carl Hopkins for å gi en prototype opptak kammer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine Methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 MS-222
Gallamine Triethiodide Sigma-Aldrich G8134 Flaxedil
Lidocaine Hydrochloride Sigma-Aldrich L5647  
Hickman’s Ringer Solution NA NA NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)
Peristaltic Pump Gilson or Rainin Minipulse 3 Model 312; RP-1 10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter
Dissection Microscope Nikon SM2645  
Super Glue Super Glue Corporation SGH2 2g tube
Omni Drill 35 World Precision Instruments 503-598  
Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4 World Precision Instruments 501860 0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm)
Low Temp Cautery Kit World Precision Instruments 500391  
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R  
Dextran Conjugated Alexa Fluor 568 Invitrogen D-22912 2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings
Epifluorescent Microscope Nikon E600 FN A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths
Low Power Objective Nikon 93182 CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm
High Power Objective Nikon 93148 CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm
White Light Source Dolan-Jenner Model 190 Fiber Optic Illuminator
Fluorescent Light Source Lumen Dynamics X-Cite 120Q  
Low-light Level Camera Photometrics CoolSnap ES  
Digital Manometer Omega Engineering HHP-201  
Motorized Micromanipulator Sutter Instruments MP-285  
Headstage Molecular Devices CV-7B Axon Instruments
Amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B Axon Instruments
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1322A Axon Instruments
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100  
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ’0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament
Pipette Glass World Precision Instruments 1B100F-4 Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus. J. Physiol. 566, 425-441 (2005).
  2. Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).
  3. Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).
  4. Margrie, T. W. Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo. Neuron. 39, 911-918 (2003).
  5. Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, e6099 (2009).
  6. Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons. J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).
  7. Lehman, M. N. Herpes simplex virus as a transneuronal tracer. Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).
  8. Joris, P. X. A dogged pursuit of coincidence. J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).
  9. Heiligenberg, W., Rose, G. Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia. J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).
  10. Morales, E. Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS. Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).
  11. Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish. J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).
  12. Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish. ILAR. J. 50, 361-372 (2009).
  13. Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish. J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).
  14. Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior. J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).
  15. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).
  16. Carlson, B. A. Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior. J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).
  17. Mugnaini, E., Maler, L. Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis. Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).
  18. Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection. J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).
  19. Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system. Brain Res. 486, 334-339 (1989).
  20. Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature. 310, 498-500 (1984).
  21. Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457, 1133-1136 (2009).
  22. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
  23. Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. Dissecting the circuitry of the auditory system. Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).
  24. Wurtz, R. H., Albano, J. E. Visual-motor function of the primate superior colliculus. Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).
  25. O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques. Methods. 30, 49-63 (2003).
  26. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  27. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  28. Gahtan, E., O'Malley, D. M. Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish. J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).
  29. Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J. Physiol. 550, 159-167 (2003).
  30. Mennerick, S. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).
  31. Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons. J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).
  32. Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning. Nature. 463, 948-952 (2010).
  33. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
  34. Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
Retrograde Fluorescent Merking Tillater målrettet Ekstracellulær Single-enhet Opptak fra Identifiserte Nerveceller<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lyons-Warren, A. M., Kohashi, T., Mennerick, S., Carlson, B. A. Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo. J. Vis. Exp. (76), e3921, doi:10.3791/3921 (2013).More

Lyons-Warren, A. M., Kohashi, T., Mennerick, S., Carlson, B. A. Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo. J. Vis. Exp. (76), e3921, doi:10.3791/3921 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter