Summary
아가로 오스 겔 전기 영동을 이용한 DNA 조각의 분리를위한 기본적인 프로토콜이 설명되어 있습니다.
Abstract
아가로 오스 겔 전기 영동은 100 BP의 25킬로바이트 1에 이르는 다양한 크기의 DNA 조각을 분리하는 가장 효과적인 방법입니다. 아가로 오스는 해초 장군 Gelidium 및 Gracilaria으로부터 격리하고, 반복 agarobiose (L-및 D-갈락토 오스) subunits이 구성되어 있습니다. 겔화 동안 아가로 오스의 폴리머가 아닌 covalently 연결 및 기공 크기 겔의 분자 체질 속성을 결정하는 번들의 네트워크를 형성합니다. 아가로 오스 겔 전기 영동의 사용은 DNA의 분리를 혁명. 아가로 오스 젤의 채택 이전에 DNA가 주로에만 크기의 근사치를 제공 자당 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 분리되었다. 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 DNA를 분리하기 위해 DNA가 젤과 현재 응용의 프리 캐스트 우물에로드됩니다. DNA를 (그리고 RNA) 분자의 인산 백본은 부정적인 전기장에 배치하면 따라서 부과되는 유전자 조각 p로 마이 그 레이션됩니다ositively 양극 부과. DNA가 균일한 질량 / 전하 비를 가지고 있기 때문에, DNA 분자가 여행한 거리는 분자량 3 로그에 반비례한다는 그러한 패턴에 아가로 오스 겔 내에서 크기로 구분됩니다. 아가로 오스 겔을 통해 DNA의 움직임을 위해 선도적인 모델은 최첨단 앞으로 이동과 4를 따라 분자의 나머지를 가져옵니다 의하여 "reptation을 편견"입니다. 2) 아가로 오스 농도, 3) DNA의 형태 5; 4) ethidium 브로마이드 6의 전압을 적용, 5)의 존재) 종류의 DNA 분자의 1) 크기 : 겔을 통해 DNA 분자의 마이 그 레이션 율에 따라 결정됩니다 아가로 오스와 7) 전기 영동 버퍼의. 분리 후의 DNA 분자는 적당한 색소를 더럽히는 것 후에는 자외선 아래에서 시각 될 수 있습니다. 이 프로토콜에 따라, 학생들은 수 있어야합니다 :
- 디엔에이 조각 겔 매트릭스 내에 구분하는 메커니즘을 이해
- 의 형태 방법을 이해DNA 분자는 겔 매트릭스를 통해 이동성을 결정합니다
- 그들의 요구에 적절한 농도의 아가로 오스 솔루션을 식별
- DNA 샘플의 전기 영동을위한 아가로 오스 겔 준비
- 겔 전기 영동 장치 및 전원 공급 장치를 설정
- 의 DNA 조각의 분리에 적합한 전압을 선택
- ethidium의 브로마이드가 DNA 밴드의 시각화을 허용하는 메커니즘을 이해
- 분리된 DNA 조각의 크기를 결정
Protocol
1. 젤의 작성
- Erlenmeyer 플라스크에 아가로 오스의 적절한 질량을 무게. 아가로 오스의 젤은 아 / V 비율 솔루션을 사용 준비가되어 있습니다. 겔의 아가로 오스의 농도는 -2 % 0.5 % 사이에 이르는 대부분의 젤과 함께 분리되는 DNA 조각의 크기에 따라 달라집니다. 버퍼의 볼륨 플라스크의 용량의 1 / 3보다 클 수 없습니다.
- 아가로 오스 함유 플라스크에 버퍼를 실행하고 추가합니다. 혼합할 수있는 소용돌이. 버퍼를 실행하는 가장 일반적인 겔은 태 (40 MM 트리스 - 아세테이트, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))와 TBE (45 MM 트리스-borate, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))입니다.
- 아가로 오스 / 버퍼 혼합 용융. 이것은 가장 일반적으로 전자 레인지에서 가열에 의해 이루어집니다, 또한 분젠 불꽃을 통해 할 수 있습니다. 30의 간격으로, 술병과 소용돌이 내용이 잘 섞어 제거합니다. 아가로 오스가 완전히 해소 때까지 반복합니다.
- 0.5 μg / ML의 농도에 ethidium 브로마이드 (EtBr)를 추가합니다. 또는 젤도 전기 이후 물들일 수있다시간의 동일한 길이 버퍼를 실행에 destaining 다음 15-30 분를 위해 0.5 μg / ML의 EtBr이 포함된 버퍼를 실행에 phoresis.
참고 : EtBr이 의심되는 발암 물질이며 올바르게 기관 규제 당 폐기되어야합니다. EtBr이 포함된 젤을 다룰 때 장갑은 항상 착용한다. DNA의 염색법의 대체 염료를 사용할 수 있습니다 있으나 EtBr은 감성과 비용으로 인해 가장 인기가 남아있다.
- 아가로 오스는 65 ° C의 물을 욕조에 benchtop이나 배양에 의한 중 냉각하도록 허용합니다. 이렇게하지 않으면 겔 트레이를 워프합니다.
- 주조 장치로 겔 트레이를 놓습니다. 또한, 하나는 금형을 만드는 젤 트레이의 열린 가장자리를 찍어 수도 있습니다. 우물을 만들 겔 주형에 적절한 장식을 배치합니다.
- 겔 금형에 용융 아가로 오스 하거라. 아가로 오스는 상온에서 설정하도록 허용합니다. 빗를 제거하고 겔 상자에서 젤 놓습니다. 또는 g엘 또한 플라스틱 포장에 싸여과 4에 저장할 수 ° C에서 사용 (그림 1)까지.
2. 젤 장치와 DNA 조각의 분리 설정
- (그림 2) 분리되는 DNA 샘플에 염료를 로드할 추가합니다. 젤 로딩 염료는 일반적으로 6X 농도 (0.25 % bromphenol 파랑, 0.25 %의 크실렌의 cyanol, 30 % 글리세롤)에서 이루어집니다. 로딩 염료가 DNA 샘플이 날아 왔습니다 얼마나 멀리 추적할 수 있도록, 또한 예제 젤 밑으로 가라앉을 수 있습니다.
- 원하는 전압으로 프로그램 전원 공급 장치 (전극 사이 1-5V/cm).
- 겔 표면을 충당하기 위해 충분히 실행 버퍼에 추가합니다. 그것은 젤을 준비하는 데 사용되는 것과 동일한 실행 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다.
- 전원 공급 장치로 겔 상자의 리드를 연결합니다. 전원 공급 장치의 전원을 켜고 젤 상자와 전원 공급 장치가 모두 작동하는지 확인합니다.
- 뚜껑을 제거합니다. 천천히그리고 신중하게 (그림 3) 젤로 DNA 샘플 (들)을로드합니다. 적절한 DNA 사이즈 마커는 항상 실험 샘플과 함께로드되어야합니다.
- 겔 상자에 뚜껑을 교체합니다. 음극 (검정색 리드)는 가까이 양극 (적색 리드)보다 우물이어야합니다. 전극이 전원 공급 장치에 올바른 슬롯에 꽂혀 있는지 확인 연속.
- 전원을 켭니다. 염료는 적절한 거리로 마이 그 레이션 때까지 젤을 실행합니다.
3. 분리된 DNA 조각을 관찰
- 전기 영동이 완료되면 전원을 끄고 겔 상자의 뚜껑을 제거합니다.
- 겔 상자에서 젤을 제거합니다. 겔의 표면으로부터 여분의 버퍼를 오프 드레인. 별도의 실행 버퍼를 흡수하기 위해 종이 타월에 젤 트레이를 놓습니다.
- 겔 트레이에서 젤을 제거하고 자외선에 젤을 쉽게받을 수 있습니다. 이것은 가장 일반적으로 겔 문서 시스템 (그림 4)를 사용하여 수행됩니다. DNA 밴드가 표시됩니다최대 오렌지색 형광 밴드 등. 겔의 그림 (그림 5) 가져가라.
- 적절히 겔과 기관 규제 당 실행 버퍼 처분.
4. 대표 결과
그림 5는 PCR 제품의 아가로 오스 겔 전기 영동 후 전형 결과를 나타냅니다. 분리 후, 결과의 DNA 조각은 명확하게 정의된 밴드로서 볼 수 있습니다. DNA를 표준 또는 사다리는 샘플 밴드의 규모에 유용한 결정을 허용 정도로 구분해야합니다. 예제 그림에서는 765 BP, 880 BP와 1022 BP의 DNA 조각은 2 로그의 DNA 사다리와 함께 1.5 % 아가로 오스 겔에 구분됩니다.
빗의 제거 후 그림 1. 경화 아가로 오스 겔.
그림 2. 학생은 그녀의 DNA 샘플을 로딩 염료를 추가.
그림 3. 겔에서 잘으로 DNA 샘플을로드하는 학생.
그림 4. 겔 문서 시스템의 예.
그림 5. 겔 포스트 전기 영동의 이미지입니다. EtBr은 1 시간 동안 100 V에서 분리 다음에 0.5 μg / ML의 최종 농도에 전기 영동 전에 겔에 추가되었습니다. 겔은 자외선과 겔 문서 시스템과 함께 찍은 사진을 접했습니다.
Discussion
아가로 오스 겔 전기 영동은 핵산을 분리의 효율적이고 효과적인 방법으로 입증되었습니다. 아가로 오스의 높은 겔 강도는 큰 DNA 조각들의 분리를위한 낮은 비율 젤의 취급을 허용합니다. 분자 체질은 겔 매트릭스의 아가로 오스 7 번들에 의해 생성된 모공의 크기에 의해 결정됩니다. 일반적으로 아가로 오스, 작은 기공 크기의 높은 농도. 전통의 아가로 오스 젤 100 BP와 25킬로바이트 사이의 DNA 조각의 분리에 가장 효과적입니다. 25킬로바이트보다 큰 DNA 조각을 분리하려면, 하나는 두 가지 다른 방향에서 교류 전류의 적용과 관련된 펄스 필드 겔 전기 영동 6, 사용해야합니다. 이렇게 큰 크기의 DNA 조각들은 현재 방향의 변화에 스스로 방향 속도로 구분됩니다. 100 BP보다 작은 DNA 조각이보다 효과적으로 polyacrylamide 겔 전기 영동을 사용하여 구분됩니다. 달리아가로 오스 젤은 polyacrylamide 겔 매트릭스는 자유 라디칼 중심의 화학 반응을 통해 형성됩니다. 이러한 얇은 젤은 높은 농도가 수직으로 실행하고 더 나은 해결책이 있습니다. 모세관 전기 영동을 시퀀싱 현대의 DNA를 사용하는에 의하여 모세관 튜브는 겔 매트릭스로 채워진다. 모세관 튜브를 사용함으로써 신속하게 DNA 조각의 분리 (와 DNA 순서의 결정) 활성화, 고전압의 적용을 허용합니다.
아가로 오스는 hydroxyethylation 통해 낮은 용융 아가로 오스를 만들 수정할 수 있습니다. 낮은 용융 아가로 오스는 일반적으로 분리된 DNA 조각의 분리가 원하는 때 사용됩니다. Hydroxyethylation 효과적으로 그들의 기공 크기 8을 감소 아가로 오스 번들의 포장 밀도를 줄여줍니다. 이것은 동일한 크기의 DNA 조각들이 같은 표준 아가로 오스 겔에 반대 낮은 용융 아가로 오스 겔을 통해 이동하는 시간이 오래 걸릴 것을 의미합니다. 번들은 서로 연관시킬 때문에그것이 설정된 후 비 공유 결합 상호 작용 9까지, 그것은 다시 녹아 아가로 오스 겔 수 있습니다.
EtBr은 아가로 오스 젤 10 DNA를 착색하는 데 사용되는 가장 일반적인 시약이다. 자외선에 노출되면 ethidium 분자의 방향족 고리의 전자가 활성화되며, 이는 그라운드 상태로 전자가 리턴과 같은 에너지 (빛)의 출시로 연결. EtBr은 농도 의존적으로 DNA 분자에 자신을 intercalating으로 작동합니다. 이것은 강도를 토대로 특정의 DNA 밴드의 DNA의 양을 추정을 허용합니다. 워낙 긍정적인 요금 때문에 EtBr의 사용은 15 %의 DNA 마이 그 레이션 속도를 줄여줍니다. EtBr은 mutagen 용의자와 발암 물질이며, 따라서 그것을 포함하는 아가로 오스의 젤을 다룰 때 한주의 운동을해야합니다. 또한, EtBr은 유해 폐기물로 간주되어 적절하게 폐기해야합니다. 아가로 오스의 젤의 DNA에 대한 대체 얼룩 SYBR 골드, SYBR 녹색, 크리스탈 바이올렛과 메틸 블루를 포함합니다. 이 중,메틸 블루와 크리스탈 바이올렛 젤의 DNA 조각의 복구가 필요한 경우에는이를 돌연변이의 가능성을 줄이고, DNA 밴드의 시각화를위한 자외선에 젤의 노출을 요구하지 않습니다. 그러나, 그들의 감성은 EtBr보다 낮은 있습니다. SYBR 금, SYBR 녹색 EtBr보다 낮은 독성으로 모두 매우 민감한, UV 염료에 의존하지만, 그들은 상당히 더 비쌉니다. 또한, 대체 염료의 모든 수 없습니다 하나 또는 겔에 직접 추가할 때 잘 작동하지 않으므로 겔은 전기 영동 후 게시물 스테인드 있어야합니다. 때문에 비용, 사용의 용이성, 그리고 감성, EtBr 아직도 많은 연구자에 대한 선택의 염료 남아 있습니다. 그러나 이러한 유해 폐기물 처리가 어렵거나 할 때 어린 학생 때 등 특정 상황에서 실험을 수행하고, 덜 독성 염료가 선호 수 있습니다.
겔 전기 영동에 사용되는 로딩 염료 세 가지 주요 목적. 먼저 그들은 샘플에 밀도를 추가그게 젤 밑으로 가라앉을 수 있도록했습니다. 둘째, 염료는 색상을 제공하고 로딩 프로세스를 단순화합니다. 마지막으로, 염료는 DNA 조각들이 마이 그 레이션되었는지 거리의 추정 수있게 겔을 통해 표준 속도로 이동합니다.
분리된 DNA 조각의 정확한 크기는 각 밴드에 의해 여행 거리에 대한 DNA 검사 표준의 각 밴드에 대한 분자량의 로그를하려 의해 결정됩니다. 유전자 표준은 미지의 유전자 샘플을 비교하실 수 있습니다 미리 정해진 크기의 DNA 조각의 혼합되어 있습니다. 그것은 DNA의 다양한 형태가 다른 속도로 젤을 통해 이동합니다 것이 중요합니다. Supercoiled 플라스미드 DNA는 워낙 컴팩트한 형태 중에 가장 느린 여행 오픈 둥근 형태와 같은 크기의 선형의 DNA 조각, 다음, 빠른 젤로 이동합니다.
결론적으로 DNA의 분리를위한 1970 년대의 아가로 오스 젤의 채택 이후, 지금까지생물 과학 연구에서 가장 유용하고 다재 다능한 기술 중 한 명이라고 증명.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne Incorporated | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. , 3rd, (2001).
- Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
- Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
- Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
- Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
- Devor, E. J. IDT tutorial: gel electrophoresis. , Available from: http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf (2010).
- Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
- Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
- Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).
