Summary
En grunnleggende protokollen for separasjon av DNA-fragmenter med agarose gel elektroforese er beskrevet.
Abstract
Agarose gel elektroforese er den mest effektive måten å skille DNA-fragmenter av varierende størrelser fra 100 bp til 25 kb 1. Agarose er isolert fra tang slektene Gelidium og Gracilaria, og består av gjentatte agarobiose (L-og D-galaktose) subenheter 2. Under gelation, agarose polymerer knytte ikke-kovalent og danne et nettverk av bunter som porestørrelser fastslå en gel er molekylære sikting egenskaper. Bruken av agarose gel elektroforese revolusjonert separasjon av DNA. Før vedtakelsen av agarose gels, ble DNA primært skilt ved sukrose tettshetsgradient sentrifugering, som bare ga en tilnærming av størrelse. For å skille DNA ved hjelp av agarose gel elektroforese, er DNA lastet inn pre-cast brønner i gel og en gjeldende anvendt. Den fosfat ryggraden i DNA (og RNA)-molekylet er negativt ladet, derfor når den plasseres i et elektrisk felt, vil DNA-fragmentene vandrer til positively ladet anode. Fordi DNA har en jevn masse / belaste forholdet, er DNA-molekyler skilles etter størrelse innenfor en agarose gel i et mønster slik at avstanden er omvendt proporsjonal til loggen sin molekylvekt tre. Den ledende modellen for DNA bevegelse gjennom en agarose gel er "forutinntatt reptation", der ledende beveger seg frem og trekker resten av molekylet langs fire. Satsen for migrering av et DNA-molekyl gjennom en gel bestemmes av følgende: 1) Størrelsen på DNA-molekylet, 2) agarose konsentrasjon, 3) DNA konformasjon 5, 4) spenning, 5) tilstedeværelse av etidiumbromid, 6) skriver av agarose og 7) elektroforese buffer. Etter separasjon, kan DNA-molekyler bli visualisert under UV lys etter farging med en passende farge. Ved å følge denne protokollen, skal studentene kunne:
- Forstå mekanismen som DNA-fragmentene er separert i en gel matrise
- Forstå hvordan konformasjon avDNA-molekylet vil avgjøre sin mobilitet gjennom en gel matrise
- Identifisere en agarose løsning av passende konsentrasjon for deres behov
- Forbered en agarose gel for elektroforese av DNA-prøver
- Sett opp gelelektroforese apparater og strømforsyning
- Velg en passende spenning for separasjon av DNA fragmenter
- Forstå mekanismen som etidiumbromid tillater visualisering av DNA band
- Bestem størrelsen på skilt DNA fragmenter
Protocol
1. Klargjøring av Gel
- Vei ut riktig massen av agarose i en erlenmeyerkolbe. Agarose gels er utarbeidet etter v / v prosent løsning. Konsentrasjonen av agarose i en gel, vil avhenge av størrelsen på DNA-fragmenter som skal skilles, med de fleste geler varierer mellom 0,5% -2%. Volumet av buffer bør ikke være større enn 1/3 av kapasiteten i kolben.
- Legg kjører buffer til agarose-holdig kolbe. Swirl å blande. Den vanligste gel kjører buffere er TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mm EDTA) og TBE (45 mM Tris-borat, 1 mm EDTA).
- Smelt agarose / buffer blanding. Dette er oftest gjøres ved oppvarming i mikrobølgeovn, men kan også gjøres over en bunsenbrenner. På 30 s intervaller, fjerne kolben og swirl innholdet for å blande godt. Gjenta dette til agarose er helt oppløst.
- Legg etidiumbromid (EtBr) til en konsentrasjon på 0,5 mikrogram / ml. Alternativt kan gelen også være misfarget etter elektrophoresis i å kjøre buffer som inneholder 0,5 mikrogram / ml EtBr for 15-30 min, etterfulgt av destaining i å kjøre buffer for en like lang tid.
Merk: EtBr er en mulig karsinogen og må plasseres forsvarlig per institusjon forskrifter. Hansker bør alltid brukes ved håndtering gels som inneholder EtBr. Alternative fargestoffer for farging av DNA er tilgjengelig, men EtBr fortsatt den mest populære på grunn av sin sensitivitet og kostnader.
- La agarose å kjøle enten på Borstemmaskin eller ved inkubasjon i en 65 ° C vannbad. Unnlatelse av å gjøre dette vil deformere gelen skuffen.
- Plasser gelen skuffen inn i casting apparatet. Alternativt kan man også tape de åpne kantene på en gel brett for å lage en støpeform. Plasser en passende kam inn i gel mold å skape brønnene.
- Hell den smeltede agarose inn i gel mold. La agarose å stille ved romtemperatur. Fjern kammen og sett gelen i gel-boksen. Alternativt gel kan også pakkes i plastfolie og lagret ved 4 º C til bruk (Fig. 1).
2. Sette opp Gel Apparatus og separering av DNA-fragmenter
- Legg lasting fargestoff til DNA-prøver for å bli separert (Fig. 2). Gel loading dye er vanligvis gjort på 6X konsentrasjon (0,25% bromphenol blå, 0,25% xylen cyanol, 30% glyserol). Laster fargestoff bidrar til å spore hvor langt DNA-prøve har reist, og også lar prøven å synke inn i gel.
- Program strømforsyningen til ønsket spenning (1-5V/cm mellom elektroder).
- Legg nok kjøre buffer til å dekke overflaten av gel. Det er viktig å bruke samme kjører buffer som det som ble brukt til å forberede gel.
- Fest ledningene til gel-boksen til strømforsyningen. Slå på strømmen og verifisere at både gel boksen og strømforsyning fungerer.
- Fjern lokket. Sakteog nøye laste DNA-prøven (e) inn i gel (Fig. 3). En passende DNA størrelse markør bør alltid være lastet med eksperimentelle prøver.
- Sett på lokket til gel-boksen. Katoden (svarte ledninger) skal være nærmere brønnene enn anoden (røde leads). Dobbeltsjekk at elektrodene er koblet til de riktige sporene i strømforsyningen.
- Slå på strømmen. Kjør gel før fargestoffet har migrert til en passende avstand.
3. Observasjon Separerte DNA-fragmentene
- Når elektroforese er ferdig, slå av strømmen og fjerne lokket på gel boksen.
- Fjern gel fra gelen boksen. Tapp av overflødig buffer fra overflaten av gel. Plasser gelen skuffen på papirhåndklær til å absorbere ekstra kjører buffer.
- Fjern gel fra gelen skuffen og utsett gel mot UV-lys. Dette er oftest gjort ved hjelp av en gel dokumentasjonssystem (Fig. 4). DNA band skal viseopp som oransje fluoriserende band. Ta et bilde av gel (Fig. 5).
- Kast gel og kjører buffer per institusjon forskrifter.
4. Representative Resultater
Figur 5 viser et typisk resultat etter agarose gel elektroforese av PCR produktene. Etter separasjon, de resulterende DNA-fragmentene er synlige som klart definerte band. DNA standard eller stige bør skilles i en grad som gjør det mulig for den nyttige fastsettelse av størrelsen på prøven band. I det viste eksemplet blir DNA fragmenter av 765 bp, 880 bp og 1022 bp skilt på en 1,5% agarose gel sammen med en 2-log DNA stige.
Figur 1. En befestet agarose gel etter fjerning av kammen.
Figur 2. En student legge lasting fargestoff til hennes DNA-prøver.
Figur 3. En student lasting DNA-prøven i en brønn i gelen.
Figur 4. Et eksempel på en gel dokumentasjonssystem.
Figur 5. Et bilde av en gel innlegg elektroforese. EtBr ble lagt til gel før elektroforese til en endelig konsentrasjon på 0,5 mikrogram / ml, etterfulgt av separasjon på 100 V i 1 time. Gelen ble utsatt for UV-lys og bildet tatt med en gel dokumentasjonssystem.
Discussion
Agarose gel elektroforese har vist seg å være en effektiv måte å skille nukleinsyrer. Agarose høye gel styrke åpner for håndtering av lav prosentandel gels for separasjon av store DNA-fragmenter. Molekylær sikting bestemmes av størrelsen på porene genereres av bunter av agarose 7 i gel matrix. Generelt, jo høyere konsentrasjon av agarose, jo mindre porestørrelse. Tradisjonelle agarose gels er mest effektive ved separasjon av DNA-fragmenter mellom 100 bp og 25 kb. For å skille DNA-fragmenter større enn 25 kb, vil man trenger å bruke puls felt gel elektroforese 6, som omfatter bruk av vekselstrøm fra to forskjellige retninger. På denne måten større størrelse DNA-fragmentene er separert med den hastigheten som de reorientere seg med endringer i gjeldende retning. DNA-fragmentene mindre enn 100 bp er mer effektivt separert ved hjelp av polyakrylamid gel elektroforese. I motsetning tilagarose gels er polyakrylamid gel matrix dannet gjennom en fri radikal drevet kjemisk reaksjon. Disse tynnere gels er av høyere konsentrasjon, kjøres vertikalt og har bedre oppløsning. I moderne DNA-sekvensering kapillær elektroforese blir brukt, hvor kapillærrør er fylt med en gel matrise. Bruk av kapillærrør tillater bruk av høye spenninger, og dermed muliggjør separasjon av DNA fragmenter (og bestemmelse av DNA sekvens) raskt.
Agarose kan endres for å skape lavt smeltepunkt agarose gjennom hydroxyethylation. Lav smelting agarose brukes vanligvis når isolering av enslige DNA-fragmentene er ønsket. Hydroxyethylation reduserer pakketetthet av agarose bunter, effektivt redusere sin porestørrelse 8. Dette betyr at en DNA fragment av samme størrelse vil ta lengre tid å gå gjennom en lav smeltepunkt agarose gel i motsetning til en standard agarose gel. Fordi buntene forbinder med hverandregjennom ikke-kovalente interaksjoner 9, er det mulig å re-smelte en agarose gel etter at det har satt.
EtBr er den vanligste reagens brukes til å farge DNA i agarose gels 10. Når de utsettes for UV-lys, blir elektroner i den aromatiske ringen på etidium molekylet aktivert, fører som til frigjøring av energi (lys) som elektroner tilbake til grunntilstanden. EtBr fungerer ved intercalating seg i DNA-molekylet i en konsentrasjon avhengig måte. Dette åpner for en estimering av mengden DNA i en bestemt DNA band basert på dens intensitet. På grunn av sin positiv ladning, reduserer bruken av EtBr DNA migrasjonsrate med 15%. EtBr er mistenkte mutagen og karsinogen, derfor må man utvise forsiktighet ved håndtering av agarose gels som inneholder det. I tillegg er EtBr ansett som en farlig avfall og må håndteres deretter. Alternative flekker for DNA i agarose gels inkluderer SYBR Gold, SYBR grønn, krystallfiolett og Methyl Blue. Av disse,Metyl Blå og krystallfiolett ikke krever eksponering av gel for UV-lys for visualisering av DNA band, og dermed redusere sannsynligheten for mutasjon dersom utvinning av DNA fragment fra gelen er ønsket. Men, deres følsomhet er lavere enn EtBr. SYBR gull og SYBR grønt er begge svært sensitive, UV avhengige fargestoffer med lavere toksisitet enn EtBr, men de er betraktelig dyrere. Dessuten, alle de alternative fargestoffer enten ikke kan være eller ikke fungerer godt når de legges direkte til gel, derfor gelen må være innlegg beiset etter elektroforese. På grunn av kostnader, brukervennlighet, og følsomhet, forblir EtBr fortsatt fargestoff for mange forskere. Men i visse situasjoner, for eksempel når farlig avfall er vanskelig eller når unge studenter utfører et eksperiment, kan en mindre giftig fargestoff bli foretrukket.
Laster fargestoffer som brukes i gelelektroforese tjene tre store formål. Først de legger tetthet til prøven, Slik at det å synke inn i gel. For det andre fargestoffer gi farge og forenkle lasting prosessen. Endelig fargestoffer flytte på standardsatser gjennom gel, noe som åpner for estimering av avstanden som DNA-fragmenter har migrert.
De eksakte størrelser av skilt DNA fragmenter kan bestemmes ved å plotte log av molekylære vekten for de forskjellige band i en DNA standard mot distanse av hvert band. DNA-standarden inneholder en blanding av DNA fragmenter av forhåndsbestemte størrelser som kan sammenlignes mot de ukjente DNA-prøver. Det er viktig å merke seg at ulike former for DNA bevege seg gjennom gel på ulike priser. Supercoil plasmid DNA, på grunn av sin kompakte konformasjon, beveger seg gjennom gelen raskeste, etterfulgt av en lineær DNA fragment av samme størrelse, med den åpne sirkulære formen reiser den tregeste.
I konklusjonen, siden vedtakelsen av agarose gels i 1970 for separasjon av DNA, har detvist seg å være en av de mest nyttige og allsidige teknikker i biologi forskning.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne Incorporated | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. , 3rd, (2001).
- Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
- Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
- Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
- Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
- Devor, E. J. IDT tutorial: gel electrophoresis. , Available from: http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf (2010).
- Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
- Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
- Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).
