Summary
NADPH-Oxidase ist die wichtigste Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Phagozyten. Aufgrund der Kurzlebigkeit von ROS, ist es schwierig zu messen und zu überwachen ROS Ebenen in lebenden Tieren. Ein minimal invasives Verfahren zur seriellen Quantifizierung von ROS in lebenden Mäusen beschrieben.
Abstract
NADPH-Oxidase ist ein kritischer Enzym, das antibakterielle und antimykotische Wirts vermittelt. Zusätzlich zu seiner Rolle in der antimikrobiellen Abwehrmechanismen hat NADPH-Oxidase kritischen Meldefunktionen, die die Entzündungsreaktion 1 modulieren. Somit ist die Entwicklung einer Methode, um in "real-time" die Kinetik der NADPH-Oxidase-derived ROS-Generation messen erwartet ein wertvolles Forschungsinstrument Mechanismen relevant Verteidigung, Entzündungen und Verletzungen Gastgeber verstehen.
Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung des NADPH-Oxidase durch schwere Infektionen und übermäßiger Entzündung aus. Aktivierung der Phagozyten NADPH-Oxidase erfordert Translokation seiner cytosolischen Untereinheiten (p47 phox, p67 phox und p40 phox) und Rac an einen membrangebundenen Flavocytochrom (bestehend aus einer gp91 phox und p22 phox Heterodimer). VerlustFunktionsverlust-Mutationen in einem dieser NADPH-Oxidase Komponenten ergeben CGD. Ähnlich wie bei Patienten mit CGD haben gp91 phox-defizienten Mäusen und p47 phox-defizienten Mäusen defekte Phagozyt NADPH-Oxidase-Aktivität und beeinträchtigter Wirtsabwehr 13, 14. Neben Phagozyten, die die NADPH-Oxidase oben beschriebenen Komponenten enthalten, exprimieren eine Vielzahl von anderen Zelltypen unterschiedliche Isoformen von NADPH-Oxidase.
Hier beschreiben wir eine Methode zur ROS-Produktion in lebenden Mäusen zu quantifizieren und den Beitrag der NADPH-Oxidase zu ROS-Generation in den Modellen von Entzündungen und Verletzungen abzugrenzen. Dieses Verfahren basiert auf ROS Umsetzung mit L-012 (ein Analogon von Luminol) zur Lumineszenz, die durch eine Charge-Coupled Device (CCD) aufgezeichnet wird basierend emittieren. In der ursprünglichen Beschreibung der L-012-Sonde wurde L-012-abhängigen Chemolumineszenz vollständig von Superoxiddismutase aufgehoben, was anzeigt, dass der Haupt-ROS in dieser Reaktion nachgewiesen war superOxidanion 15. Spätere Studien haben gezeigt, dass L-012 können andere freie Radikale, einschließlich reaktiven Stickstoffspezies 16, 17 zu detektieren. Kielland et al. 17 zeigte, dass die topische Anwendung von Phorbolmyristatacetat, ein potenter Aktivator der NADPH-Oxidase, führte zu Oxidase-abhängigen ROS Generation, die in Mäusen unter Verwendung des lumineszierenden Sonde L-012 detektiert werden könnte NADPH. In diesem Modell zeigten sie, dass L-012-abhängigen Lumineszenz in p47 phox-defizienten Mäusen wurde aufgehoben.
Wir verglichen ROS-Generation in Wildtyp-Mäusen und NADPH-Oxidase-Mangel p47 phox-/ - Mäusen 2 in den folgenden drei Modelle: 1) intratracheale Verabreichung von Zymosan, eine pro-inflammatorische Pilzzellwand abgeleiteten Produkt, das NADPH-Oxidase aktivieren kann, 2) cecal Ligatur und Punktion (CLP), ein Modell des intra-abdominalen Sepsis mit sekundärer akuter Lungenentzündung und Verletzungen, und 3) mündliche Tetrachlorkohlenstoff(CCl 4), ein Modell der ROS-abhängige Leberschädigung. Diese Modelle wurden speziell ausgewählt, um NADPH-Oxidase-abhängigen ROS-Generation im Rahmen der nicht-infektiösen Entzündungen, polymikrobiellen Sepsis und toxininduzierte Organverletzung auszuwerten sind. Vergleicht man Biolumineszenz in Wildtyp-Mäusen p47 phox-/ - Mäusen ermöglicht es uns, den spezifischen Beitrag von ROS durch p47 phox-haltigen NADPH-Oxidase der Biolumineszenz-Signal in diesen Modellen generiert abzugrenzen.
Biolumineszenz-Bildgebung Ergebnisse, die eine erhöhte ROS Ebenen in Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu p47 nachgewiesen phox-/ - Mäusen zeigten, dass NADPH-Oxidase die Hauptquelle der ROS-Generation ist in Reaktion auf entzündliche Reize. Diese Methode bietet eine minimal-invasive Ansatz für "real-time" Überwachung der ROS-Generation während der Entzündung in vivo.
Protocol
Ein. Tiermodelle
- Mäuse: Verwenden p47 phox-/ - Mäusen und Alter und Geschlecht abgestimmt C57BL6/DBA Mäusen. Holen Sie die Genehmigung für die Experimente von Institutional Animal Care und Use Committee.
- Anästhesie: Verwenden Sie eine kontinuierliche Isofluran Verwaltungssystem der Narkose zu induzieren. Der Verdampfer System (VetEquip) mit Isofluran (2-3%) gefüllt. Bestätigen Sie, dass Mäuse vollständig betäubt durch die Beobachtung der Atmung, Bewegung und Cornealreflex in Reaktion auf äußere Reize sind.
- Chirurgische Verfahren: Reiben Sie die OP-Bereich (Tischgerät) mit 70% Ethanol. Trage sterile Handschuhe und einen sauberen OP-Kittel und Maske. Bereiten Sie die Mäuse durch Clipping die Haare und Aufbringen betadine abwechselnd mit 70% igem Ethanol zu dem Bereich, wo der Schnitt gemacht werden soll. Durchführung von Operationen auf einer sterilen Oberfläche und mit sterilen Instrumenten. Monitor Mäusen post-operativ, bis wach und frei zu bewegen.
- Intratracheale Zymosan Verwaltung
- Verwalten Anästhesiewie in 1.2 beschrieben.
- Desinfizieren Operationsgebiet (Hals) mit Betadin und 70% Ethanol und setzen die Luftröhre durch chirurgische Dissektion.
- Pierce Trachea mit einer 27-Gauge-Nadel und injizieren Zymosan (St. Louis, MO) in einer Dosis von 1 pg / g unter Verwendung einer 0,5 ug / ul Lösung (Gesamtvolumen 50 pl für eine Maus von 25 g) in sterilem PBS aufgelöst.
- Schließen Mäusen Hals gewickelt mit 5-0 sterile Seidennähte unter aseptischen Bedingungen.
- Bild nach 4 Stunden und 24 Stunden.
- Blinddarm Ligatur und Punktion
- Verwalten Anästhesie in 1.2 beschrieben.
- Clip Haar in der OP-Bereich (Abdomen) und desinfizieren mit betadine und 70% Ethanol.
- Führen Sie eine Mittellinie Laparotomie und Identifizierung der Blinddarm.
- Ligieren das distale 50% der exponierten Caecum mit 4-0 Seidenfaden und Durchlöcherung Caecum distal zur Ligation mit einem Durchgang von einer 21-Gauge-Nadel.
- Schließen Sie den Schnitt mit 4-0 sterile Seidenfäden.
- Bild nach 4 h und24 Std.
- Oral Tetrachlorkohlenstoff (CCl 4) Verwaltung
- Verwalten Anästhesie in 1.2 beschrieben.
- Verwalten CCl 4 (2 pg / g, St. Louis, MO) in Maisöl durch orale Gabe aufgelöst. Das Verfahren der CCl4 Verwaltung sollte in einem bestimmten Bereich in Übereinstimmung mit IBC / EHS-Richtlinien durchgeführt werden.
- Bild nach 4 Stunden und 24 Stunden.
2. Der Erwerb einer Bioluminescent Bild
- Initialisieren Sie die IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, auf Lumineszenz-Modus und warten, bis die Charge-Coupled Device (CCD) Temperatur zu sperren.
- Wählen Belichtungszeit, Binning (mittel) und F / Stop (8) Einstellungen.
- Ort Mäusen in Rückenlage in der Bildgebung Kammer auf einem Heiztisch zur normalen Körpertemperatur aufrecht zu erhalten. Verwalten Anästhesie in 1,2 via Nasenkonus beschrieben, während Mäuse in der IVIS Bildgebung Kammer sind.
- Verwalten L-012 (20 g / g) in sterilem PBS (10 ug / ul) intravenös über retroorbitalen Einspritzung zu jedem Zeitpunkt zum Abbilden ausgewählt gelöst.
- Aufnehmen von Bildern beginnen bei 2 min nach L-012-Injektion. Wir verwenden in der Regel eine 40 sec Belichtung.
3. Data Analysis mit Region of Interest
- Analysieren von Daten mit Wohn Image Software v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Öffnen Sie ein Bild und wählen Sie Messung der Region of Interest-Tools.
- Wählen der Region of Interest Gestalt und Größe auf der Brust und / oder Bauch nach Überlagern eines Pseudo-farbigen digitalen Bild (repräsentiert Photonendetektion) über einem fotografischen Abbild der Maus.
- Quantifizierung Signalintensität (Photonenfluss) aus der Region of Interest.
4. Statistiken
- Statistische Analysen verwenden Softwarepaket Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni post-Tests durchführen zu einzelnen Zeitpunkten.
Zymosan ist eine proinflammatorische Hefezellwand Produkt und ein potenter Aktivator der NADPH-Oxidase-3. Wir haben bereits gezeigt, dass intratracheale Zymosan induziert eine robustere neutrophilen Lungenentzündung und pro-inflammatorische Zytokin-Produktion in p47 phox-/ - im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen 1. Hier war unser Ziel, ROS-Generation in den Lungen von Wildtyp-und p47 phox-/ compare - Mäusen nach Zymosan Herausforderung. Bei 4 Stunden nach Zymosan intratracheale Verabreichung, beobachteten wir eine deutliche Erhöhung der Photonenemission über der Brust in Wildtyp-Mäusen im Vergleich zur Basislinie sowie einer Erhöhung der Photonenemission in Wildtyp p47 phox gegenüber-/ - Mäusen bei 4 h und 24 h. Im Gegensatz dazu Biolumineszenz Signale in p47 phox-/ - blieben Mäuse Ausgangswert bei 4 Stunden nach Zymosan Behandlung (Abb.1 AB). Somit scheint NADPH-Oxidase zu be die Hauptquelle der ROS-Generation in der Lunge nach Zymosan Verwaltung.
Weiter untersuchten wir ROS-Produktion in der CLP-induzierten Sepsis-Modell. Sepsis ist eine lebensbedrohliche Syndrom mit end-Organverletzung verbunden sind, einschließlich akutem Lungenversagen (ALI) und akutes Atemnotsyndrom (ARDS) 4, 5. ROS-vermittelten Verletzungen wurde als ein wichtiger Faktor für Sepsis-induzierten Multi-Organ-Dysfunktion. Wir fanden, dass ROS signifikant wurden über der Brust (4 h) und über den Bauch (24 h) nach CLP in Wildtyp-Mäusen im Vergleich zum Ausgangswert erhöht. Allerdings ROS Ebenen in p47 phox-/ - waren Mäuse ähnlich den Ausgangswerten zu beiden Zeitpunkten (Abb.2 AC). Diese Ergebnisse zeigen, dass ROS Generation in der CLP-induzierten Sepsis Mausmodell NADPH-Oxidase-abhängig ist.
Schließlich haben wir Biolumineszenz Bildgebung ROS-Produktion in einer CCl 4-induzierten Leberschäden Modus erkennenl. CCl 4 bewirkt hepatozellulären Nekrose, und wurde verwendet, um sowohl akute Leberschädigung und Leberfibrose 6 modellieren. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Modelle von Entzündungen und Verletzungen, fanden wir, dass ROS-Produktion in den Bauch bescheiden war (etwa 35%) erhöht gegenüber dem Ausgangswert in p47 phox-/ - Mäusen bei 4 h nach CCl 4 Verwaltung. Jedoch war das Ausmaß der CCl 4-induzierten ROS signifikant größer in Wildtyp-Mäusen als in p47 phox-/ - Mäusen (Abb.3 AB). Diese Daten legen nahe, dass sowohl p47 phox-haltigen NADPH-Oxidase-abhängige und-unabhängige ROS Generation in akuten CCl 4-induzierten Leberschäden auftreten.
Abbildung 1. ROS-Produktion in der Lunge nach Zymosan Behandlung. A) Repräsentative bioluminescence Bildgebung von ROS-Produktion. Beachten Sie, dass zusätzlich zu der Brust, Lumineszenz detektierbar über den Bauch sowohl Wildtyp und p47 phox-/ ist - Mäusen und abdominalen Lumineszenz ist unverändert durch Zymosan Behandlung. B) Photonen von der Brust von Wildtyp-und p47 phox-/ - Mäusen nach einer einzigen intratracheale (IT) Injektion von Zymosan. Biolumineszenz-Bildgebung wurde an der Grundlinie, 4 h und 24 h durchgeführt. Die Lichtemission aus der Region von Interesse über die Brust wurde unter Verwendung des angezeigten Pseudo-Farbskala. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SE vorgestellt, n = 6-9 pro Gruppe, * = p <0,05. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung .
Abbildung 2. ROS Nachweis nach CLP. A) Repräsentative Biolumineszenz-Bildgebung der ROS-Produktion, B) Photonen aus der Brust, und C) Photonen aus dem Bauch von Wildtyp-und p47 phox-/ - Mäusen zu Studienbeginn, 4 h und 24 h nach CLP. Die Ergebnisse werden als Mittelwert dargestellt ± SE; n = 4-5 pro Gruppe, * = p <0,05. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung .
Abbildung 3. ROS-Produktion in Bauch nach CCl 4-induzierten Leberschäden. A) Repräsentative Biolumineszenz-Bildgebung der ROS-Produktion und B) Photonen aus dem Bauch von Wildtyp-und p47 phox-/ - Mäusen zu Studienbeginn, 4 Stunden und 24 Stunden nach der oralen CCl 4 Behandlung. . N = 4-5 pro Gruppe, * = p <0,05; Ergebnisse werden als Mittelwert ± SE präsentiert Klicken Sie hier für eine größere Zahl
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Discussion
"Real-time"-Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in lebenden Tieren kann durch Fluoreszenz-und Chemilumineszenz-Sonden erreicht werden. Während fluoreszierenden Sonden aus mit schwacher Signal-zu-Rausch-Verhältnisse 12 leiden, ist die beschriebene Aufnahmetechnik empfindlicher für die Detektion der Lichtemission im Anschluss an eine chemische Reaktion mit dem ROS Luminol-basierten Substrat L-012. Wie alle Biolumineszenz Bildgebung, wird diese Methodik durch wellenlängenabhängige Licht durch Absorption und Streuung von Organen und Geweben begrenzt. Mäuse - Diese Experimente wurden zur Schaffung richtigen experimentellen Bedingungen für die Messung von ROS in Wildtyp und p47 phox-/ fokussiert. Die Verwendung dieser genetisch modifizierten Mäusen ermöglicht uns zur Unterscheidung von p47 phox ROS enthaltenden NADPH-Oxidase aus ROS durch andere Wege erzeugt wird.
Obwohl funktionelle NADPH-Oxidase, die p47 phox isteine wichtige Quelle von ROS existieren andere NADPH-Oxidase-Isoformen und zusätzliche ROS-generierenden Systemen, einschließlich Xanthinoxidase und die mitochondriale Atmung, können ROS produzieren. NADPH-Oxidase und andere ROS-Erzeugung Wege können wichtige und interaktive Effekte auf antimikrobielle Wirts-und nachgelagerten Signalwege, die Entzündungen und Verletzungen 7-10 moduliert haben. Verwendung Biolumineszenz Bildgebung, konnten wir die Kinetik der ROS-Produktion in vivo zu messen und um den Beitrag der NADPH-Oxidase zu ROS Ebenen in verschiedenen entzündlichen Modellen abzugrenzen.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens betrifft Ortsauflösung von Biolumineszenz. Obwohl wir Lumineszenz innerhalb bestimmter anatomischer Abteile (zB., Thorax, Abdomen) messen kann, ist es schwierig zu lokalisieren anatomischen Ort der Lumineszenz bei der Orgel Ebene. In jedem unserer experimentellen Modellen wählten wir 3 Zeitpunkte für Biolumineszenz Messungen: baseline, 4 h und 24 h. Wir wissen nicht, ob Biolumineszenz Bildgebung kleine Unterschiede in der ROS-Generation über kürzere Intervalle der Analyse oder ob die Beziehung zwischen in vivo ROS Generierung und Biolumineszenz ist linear identifizieren können. Diese Fragen bedürfen weiterer Untersuchungen. Bei den Modellen für diese Studien verwendet, vermuten wir, dass Phagozyten, rekrutiert Neutrophilen und Makrophagen, sind in erster Linie verantwortlich für die ROS-Produktion über die Phagozyten NADPH-Oxidase-System. Zukünftige Studien, in denen spezifische Zelltypen erschöpft sind oder Knochen Chimären erzeugt werden könnten zusätzliche Erkenntnisse über die relative Ebenen der ROS-Generation aus verschiedenen Zellpopulationen liefern. Eine weitere mögliche Einschränkung der Studien mit L-012 ist, dass andere Reste (neben ROS) können mit diesem Lumineszenzsondenmarkierung reagieren, wodurch Spezifität für ROS-Erkennung unter bestimmten Umständen.
Nach Zymosan-Injektion, das Fehlen von ROS-Produktion in p47 phox-/ - Mäusen zeigt, dass NADPH Oxidasedie Hauptquelle von ROS in diesem Modell der Lungenentzündung. CLP ist eine der häufigsten Tiermodellen von Sepsis 11 und Biolumineszenz Bildgebung offenbarte erhöhte ROS-Signale sowohl in der Lunge und Bauch, die NADPH-Oxidase-abhängig waren. Im Gegensatz zu der Zymosan und CLP Modellen wurden ROS in das Abdomen von sowohl von Wildtyp-und p47 phox-/ erhöht - Mäusen im Vergleich zum Ausgangswert, aber in einem größeren Ausmaß in Wildtyp-Mäusen, die anzeigt, dass CCl 4 induziert ROS-Produktion von p47 phox - NADPH-Oxidase enthält, und andere Mechanismen.
Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass ein Luminol-basierten Biolumineszenz bildgebenden Verfahren zum Nachweis von ROS kann wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Regulation und Folgen von ROS-Produktion in vivo sein.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH RO1 AI079253 und Department of Veterans Affairs finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
