異なる動物モデルにおけるNADPHオキシダーゼ活性の生物発光イメージング

Summary

NADPHオキシダーゼは、食細胞内の活性酸素種の主要な供給源（ROS）です。なぜならROSのはかない性質のために、生きている動物のROSレベルを測定し、監視することは困難である。生きたマウスにおけるROSのシリアル定量化のための低侵襲的方法が記載されている。

Abstract

NADPHオキシダーゼは、抗菌剤および抗真菌宿主防御を仲介する重要な酵素である。抗菌宿主防御における役割に加えて、NADPHオキシダーゼは、炎症反応^を調節^する重要な¹シグナリング機能を持っています。したがって、NADPHオキシダーゼ由来のROS生成の "リアルタイム"の動態に測定する方法の開発が防衛、炎症やけがをホストするために関連するメカニズムを理解するための貴重な研究ツールであることが期待されています。

慢性肉芽腫症（CGD）は重篤な感染症や過度の炎症を特徴とNADPHオキシダーゼの遺伝性疾患です。食細胞NADPHオキシダーゼの活性化は、その細胞質サブユニット（P47 ^phoxの 、P67 ^phoxの 、およびp40 ^phoxの ）および膜結合flavocytochrome（gp91 ^phoxおよびP22 ^phoxのヘテロ二量体で構成される）へのRacの移行が必要。損失CGDでこれらのNADPHオキシダーゼコンポーネントの結果のいずれかの機能変異の。 CGDの患者と同様に、gp91 ^phoxの欠損マウスとP47 ^phoxの欠損マウスは、欠陥のある食細胞NADPHオキシダーゼ活性と障害ホスト防御^13、14を持っ^ています。上記のNADPHオキシダーゼ成分を含んでいて食細胞に加えて、他の種々の細胞型は、NADPHオキシダーゼの異なるアイソフォームを発現している。

ここで、我々は生きているマウスではROS産生を定量化すると炎症やけがのモデルでROS生成にNADPHオキシダーゼの貢献を線引きする方法を説明します。このメソッドは、電荷結合素子（CCD）によって記録される発光を発するように、L-012（ルミノールのアナログ）と反応し、ROSに基づいています。 L-012プローブの元の説明では、L-012-依存性化学発光は完全にこの反応で検出された主なROSはスーパーであったことを示す、スーパーオキシドジスムターゼにより廃止されましたオキシドアニオン^15。その後の研究では、L-012は、反応性窒素種^16、17を含む他のフリーラジカルを検出することができることが示されている。ヒェランら¹⁷ ホルボールミリスチン酸アセテート、NADPHオキシダーゼの強力な活性化因子、のその局所適用を示し、発光プローブのL-012を使用してマウスで検出することができオキシダーゼ依存ROS生成をNADPHに導いた。このモデルでは、彼らは、L-012-依存発光はP47 ^phoxの欠損マウスでは廃止されたことを示した。

我々は、野生型マウスとNADPHオキシダーゼ欠損P47 ^phoxの-/内ROS生成比較して^-次の3つのモデルのマウス^2：ザイモサン、NADPHオキシダーゼを活性化することができる壁由来製品プロ炎症性真菌細胞の1）気管内投与、2）盲腸結紮及び穿刺（CLP）、二次急性肺の炎症や損傷を伴う腹腔内敗血症のモデル、3）経口四塩化炭素（ _四塩化炭素）、ROS依存肝損傷のモデル。これらのモデルは、具体的にそれぞれ、非感染性の炎症、複数菌による敗血症、毒素誘発性臓器障害の文脈においてNADPHオキシダーゼ依存ROS生成を評価するために選択した。 P47に野生型マウスでは生物発光を比較^{phoxの-/ -}マウスたちは、これらのモデルにおける生物発光信号にP47 ^phoxの含有NADPHオキシダーゼによって生成ROSの具体的な貢献を線引きすることができます。

P47に比べて野生型マウスでは増加したROSレベルを示した生物発光イメージング結果^{phoxの-/ -}マウスでは、NADPHオキシダーゼは、炎症性刺激に応答して活性酸素の発生の主な原因であることが示された。この方法は、in vivoで炎症時ROS生成の"リアルタイム"モニタリングのための低侵襲なアプローチを提供します。

Protocol

1。動物モデル

1. マウス^{：P47-phoxの}使用^{/ -}マウスでは、年齢と性別をマッチC57BL6/DBAマウスを。インスティテューショナル·動物実験委員会の実験のための認可を受けなければならない。
2. 麻酔：麻酔を誘導するために、連続イソフルラン管理システムを使用してください。気化器システム（VetEquip）は（2-3％）イソフルランで満たされている。マウスが外部刺激に応答して、呼吸、動き、角膜反射を観察することによって、完全に麻酔されていることを確認。
3. 外科的処置：70％エタノールで手術領域（ベンチ）をスクラブ。滅菌手袋と清潔な手術衣とマスクを着用してください。髪をクリッピングし、切開が行われるエリアに、70％エタノールで交互ベタジンを適用することにより、マウスを準備します。無菌の表面に手術を行い、滅菌器を使用します。目を覚まして、自由に移動するまで、術後マウスを監視します。
4. 気管内ザイモサン管理
   1. 麻酔を投与1.2で説明したように。
   2. ベタジンと70％エタノールで手術領域（首）を消毒し、外科切開により気管を露出させる。
   3. 27ゲージの針で突き刺す気管および滅菌PBSに溶解した0.5μg/μLの溶液（25gのマウスの総体積50μl）を用いて1μg/ gの用量でザイモサン（セントルイス、MO）を注入。
   4. クローズマウスの首は無菌条件下で5から0無菌絹縫合糸で巻いた。
   5. 4時間及び24時間後の画像。
5. 盲腸結紮及び穿刺
   1. 1.2で説明したように麻酔を管理します。
   2. 手術部位（腹部）で髪をクリップしてベタジンと70％エタノールで消毒してください。
   3. 正中開腹術を行い、盲腸を識別します。
   4. 4から0絹縫合糸と、21ゲージの針を1パスで結紮に対して遠位穿刺盲腸で露光盲腸の先端50％をライゲーションする。
   5. 4から0無菌絹縫合糸で切開を閉じます。
   6. 4時間後の画像と（24時間）。
6. オーラル四塩化炭素（CCl _4）投与
   1. 1.2で説明したように麻酔を管理します。
   2. 経口胃管栄養法によりトウモロコシ油に溶解CCl _4の （2μg/ gで、セントルイス、ミズーリ州）を管理する。四塩化炭素投与の手順はIBC / EHS方針に従って、指定された領域で実行する必要があります。
   3. 4時間及び24時間後の画像。

2。生物発光画像を取得する

1. 発光モードに設定IVIS 200（Xenogenコーポレーション、アラメダ、カリフォルニア州）イメージングシステムを、初期化して、電荷結合素子（CCD）をロックするために、温度を待つ。
2. 露光時間、ビニング（媒体）とF /ストップ（8）の設定を選択します。
3. 正常な体温を維持するために加熱されたステージ上でのイメージングチャンバー内に仰臥位にマウスを置きます。ノーズコーンを介して、1.2で説明したようにマウスがIVISイメージング室にいる間麻酔を管理します。
4. L-012を投与する （20μg/ g）をイメージングのために選択された各時点における眼窩注射により静脈内（10μg/μLの）滅菌PBSに溶解した。
5. L-012注射後2分で始まる画像をキャプチャします。我々は通常、40秒露出を使用しています。

3。関心領域を使用してデータ解析

1. リビングImageソフトウェアV.4.2（Xenogenコーポレーション、アラメダ、CA）を使用してデータを分析します。
2. 画像を開いて、インタレスト·ツールの領域の測定を選択します。
3. 胸部および/または腹部の上にマウスの写真画像の上に擬似色のデジタル画像を（光子検出を表す）を重ね合わ後の利息の形状や大きさの領域を選択します。
4. 関心領域からの信号強度（光子束）を定量化する。

4。統計

1. 個々の時点でBonferroniの事後テストで2-way ANOVAを実行するための統計解析ソフトウェア·パッケージを使用しています。

TLE "> 5。代表的な結果

ザイモサンは、炎症誘発性酵母細胞壁製品とNADPHオキシダーゼ³の強力な活性化因子である。我々は以前にその気管ザイモサンを示し^phoxのP47-/で、より堅牢な好中球の肺の炎症と炎症性サイトカインの産生を誘導する^-マウス^{1、野生型}と比較した。ザイモサンチャレンジ後のマウス^-ここでは、私たちの目標は、野生型と^P47-phoxの/の肺におけるROS産生を比較することであった。 4時間および24時間後のマウス^-気管ザイモサン投与後4時間後に、我々は、ベースラインと同様に^P47-phoxの/に比べて野生で光子放出の増加と比較して、野生型マウスでは胸の上に光子放出の大幅な増加が観察された。これとは対照的に^{、P47-phoxの/}生物発光シグナル^-マウスはザイモサン処理（ 図1-B）後4時間でベースラインレベルにとどまっている。したがって、NADPHオキシダーゼはbに表示されます電子ザイモサン投与後の肺内のROS生成の主要な源。

次に、我々は、CLP誘発性敗血症モデルにおけるROS産生を評価した。敗血症、急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窮迫症候群^{（ARDS）4,5}を含む末端器官の損傷に関連する生命を脅かす症候群です。 ROS媒介損傷は敗血症誘発多臓器不全を駆動する重要な因子であると考えられている。私たちは、ROSが有意に胸（4時間）の上とベースラインと比較して野生型マウスでCLPに続く腹部（24時間）以上に増加したことが分かった。しかし^{、P47-phoxの/}のROSレベル^-マウスの時点（ 図2 AC）の両方でベースラインレベルと同様であった。これらの結果は、CLP誘発性敗血症のマウスモデルにおけるROSの生成はNADPHオキシダーゼ依存であることを示している。

最後に、我々はCCl ₄誘発肝傷害モードでROS産生を検出するために、生物発光イメージングを使用リットル。 _四塩化炭素_は、肝細胞の壊死を引き起こし、急性肝障害や肝線維症^6の両方をモデル化するために使用されています。炎症やけがの前述のモデルとは対照的に、我々は、腹部におけるROS産生は控えめに（約^{35％）P47-phoxの/}にベースラインと比較して増加していたことがわかった^- 4時間以下のCCl ₄投与のマウス。マウス（ 図3-B） ^-しかし、 _四塩化炭素誘発性のROS生成の大きさは^{、P47-phoxの/}よりも野生型マウスでは有意に大きかった。これらのデータは、両方P47 ^phoxの含有NADPHオキシダーゼ依存性および非依存性のROS産生が急性_四塩化炭素誘発肝傷害で起こることを示唆している。

ザイモサン処理後の肺の中の図1：ROS産生。 A）代表bioluminescenROS産生のCEイメージング。マウスや腹部の発光がザイモサン処理によって変更されていません^-胸に加えて、発光が野生型と^P47-phoxの/の両方で腹部上に検出可能であることに注意してください。野生型と^P47-phoxの/の胸からB）の光子数^-ザイモサンの（IT）の気管内単回注射後のマウス。生物発光イメージングは​​、ベースライン、4時間、および24時間で行った。胸上の関心領域からの発光は示さ擬似カラースケールを用いて同定した。結果は平均として提示されている±SE、nはグループあたり= 6-9、* = p <0.05で。 拡大図はこちらをクリックしてください 。

図2 ROSの検出は、以下のCLP。 ROSの産生、Bの）代表生物発光イメージング）胸から光子カウント、および野生型と^P47-phoxの/の腹部からC）の光子カウント^-ベースライン時にマウス、4時間、およびCLP後24時間。結果は平均として提示されている値±SE、群あたりn = 4-5、* = p <0.05で。 拡大図はこちらをクリックしてください 。

後腹部のCCl ₄誘発肝傷害における図3 ROS産生。経口CCl _4の治療後、ベースライン時のマウス、4時間、および24時間^- ROS産生と野生型と^P47-phoxの/の腹部からB）の光子数の）代表生物発光イメージング。のn = 4-5グループごと、* = p <0.05で、結果は平均±SEとして提示されているにはここをクリックして拡大図

Discussion

生きている動物での活性酸素種の "リアルタイム"測定（ROS）は、蛍光および化学発光プローブを使用することによって達成することができます。蛍光プローブは、弱い信号対雑音比^12を有する苦しむ一方で、説明イメージング技術は、ルミノールベース基板のL-012とROSの化学反応後の発光の検出に敏感である。すべての生物発光イメージング技術と同様に、この方法論は、臓器や組織から波長依存光吸収や散乱によって制限されます。マウス^-これらの実験は、野生型と^P47-phoxの/におけるROSの測定のための適切な実験条件を確立することに焦点を当てていた。これらの遺伝子改変マウスの使用は他の経路によって生成されたROSからP47 ^phoxの含有NADPHオキシダーゼによって生成されたROSを区別することを可能にする。

^phoxの P47 ^を含む機能性NADPHオキシダーゼはあるがROSの主な供給源は、他のNADPHオキシダーゼアイソフォームが存在し、キサンチンオキシダーゼおよびミトコンドリアの呼吸を含む追加のROS生成システムは、ROSを生成することができます。 NADPHオキシダーゼと他のROSを発生する経路は、抗菌宿主防御と炎症やけが^7-10を調節する下流のシグナル伝達経路上の重要かつインタラクティブな効果を持つことができます。生物発光イメージングを使用して、我々は、 生体内 ROS産生の動態を測定するために、さまざまな炎症モデルにおけるROSレベルにNADPHオキシダーゼの寄与を線引きすることができました。

この方法の限界は、生物発光の空間分解能に関する。我々は特定の解剖学的区画（ 例えば 。、胸部、腹部）内の発光を測定することができますが、それは臓器レベルでの発光の解剖学的部位を局所化することが困難である。ベースライン、4時間、および24時間後：私達の実験モデルの各々において、私たちは、生物発光測定のための3つの時点を選択しました。生物発光イメージング解析の短い間隔で、 または in vivo ROS生成と生物発光の間の関係が線形であるかどうかROS生成のわずかな違いを識別できるかどうかはわかりません。これらの問題は、さらなる研究が必要である。これらの研究のために使用されているモデルでは、食細胞、募集好中球やマクロファージは、食細胞NADPHオキシダーゼシステムを介してのROS産生のために主に責任があることを疑う。特定の種類の細胞が枯渇するか、骨キメラが生成される今後の研究では、異なる細胞集団からのROS生成の相対的なレベルについての付加的な知識を提供することができます。 L-012を用いた研究のもう一つの潜在的な制限は、他のラジカルはROS（他に）いくつかの状況では、ROSの検出に特異性を減らし、この発光プローブと反応するかもしれないということです。

ザイモサン注射後^{、P47-phoxの/}内ROS産生の欠如^-マウスはNADPHオキシダーゼがあることを示し肺の炎症のこのモデルにおけるROSの主要な源。 CLPは、NADPHオキシダーゼ依存していた肺と腹部の両方で増加した活性酸素シグナルを明らかにした敗血症¹¹および生物発光イメージングの最も一般的な動物モデルの一つです。ザイモサンおよびCLPモデルとは対照的に、ROSは野生型とP47 ^phoxの-/の両方の腹部に増加した^-マウスのベースラインと比較したが、野生型マウスでは大きい程度、 _四塩化炭素_は、P47 ^phoxのでROS産生を誘導することを示すに- NADPHオキシダーゼと他のメカニズムを含む。

要約すると、我々のデータは、ROSの検出のためのルミノールベースの生物発光イメージング法は、 生体内でのROS産生の調節と影響に関する研究のための貴重なツールとなりうることを示している。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
carbon tetrachloride	Sigma, St. Louis, MO	289116