Summary
La NADPH oxidasa es la mayor fuente de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los fagocitos. Debido a la naturaleza efímera de ROS, es difícil de medir y controlar los niveles de ROS en los animales vivos. Un procedimiento mínimamente invasivo para la cuantificación de serie de ROS en ratones vivos se describe.
Abstract
La NADPH oxidasa es una enzima crítica que media la defensa del huésped antibacteriana y antifúngica. Además de su papel en la defensa del huésped antimicrobiana, la NADPH oxidasa tiene funciones críticas de señalización que modulan la respuesta inflamatoria 1. Por lo tanto, el desarrollo de un método para medir en "tiempo real" la cinética de la NADPH oxidasa derivada de la generación de ROS se espera que sea una valiosa herramienta de investigación para comprender los mecanismos pertinentes para la defensa del huésped, la inflamación y lesiones.
La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es un trastorno hereditario de la NADPH oxidasa se caracteriza por infecciones graves y la inflamación excesiva. La activación de la NADPH oxidasa de los fagocitos requiere la translocación de sus subunidades citosólicas (p47 phox, p67 phox y p40 phox) y RAC a un flavocitocromo unida a la membrana (compuesto de una gp91 phox y p22 phox heterodímero). Pérdidade mutaciones de función en cualquiera de estos componentes de la NADPH oxidasa resultado en la EGC. Similar a los pacientes con EGC, gp91 phox los ratones deficientes en p47 y los ratones deficientes tienen phox-defectuoso actividad de la NADPH oxidasa de los fagocitos y deterioro de la defensa de acogida 13, 14. Además de los fagocitos, que contienen los componentes de la NADPH oxidasa descritos anteriormente, una variedad de otros tipos de células expresan diferentes isoformas de la NADPH oxidasa.
Aquí se describe un método para cuantificar la producción de ROS en ratones vivos y para delinear la contribución de NADPH oxidasa para la generación de ROS en modelos de inflamación y lesiones. Este método se basa en el ROS reaccionar con L-012 (un análogo de luminol) para emitir luminiscencia que se registra mediante un dispositivo de carga acoplada (CCD). En la descripción original de la sonda L-012, L-012-dependiente quimioluminiscencia fue completamente abolida por la superóxido dismutasa, que indica que el principal ROS detectado en esta reacción fue superóxido de anión 15. Estudios posteriores han demostrado que la L-012 puede detectar otros radicales libres, incluyendo especies reactivas de nitrógeno 16, 17. Kielland et al. 17 mostraron que la aplicación tópica de acetato de forbol miristato, un potente activador de la NADPH oxidasa, llevado a NADPH oxidasa dependiente de la generación de ROS que podría ser detectado en ratones utilizando la sonda luminiscente L-012. En este modelo, se mostró que la luminiscencia L-012-dependiente fue abolida en p47 phox de ratones deficientes.
Hemos comparado la generación de ROS en ratones de tipo salvaje y NADPH oxidasa deficiente en p47 phox-/ - ratones 2 en los tres modelos siguientes: 1) la administración intratraqueal de zymosan, una célula fúngica pro-inflamatoria pared producto derivado que puede activar la NADPH oxidasa; 2) ligadura cecal y punción (CLP), un modelo de sepsis intraabdominal con la inflamación pulmonar aguda secundaria y lesiones, y 3) el tetracloruro de carbono orales(CCl 4), un modelo de lesión hepática dependiente de ROS. Estos modelos se seleccionaron específicamente para evaluar la NADPH oxidasa dependiente de la generación de ROS en el contexto de la inflamación no infecciosa, sepsis polimicrobiana y lesión inducida por la toxina del órgano, respectivamente. Comparación de bioluminiscencia en los ratones de tipo salvaje p47 phox a-/ - ratones nos permite delinear la contribución específica de ROS generados por p47 phox de la NADPH oxidasa que contiene a la señal bioluminiscente en estos modelos.
Resultados de bioluminiscencia de formación de imágenes que demostraron el aumento de los niveles de ROS en ratones de tipo salvaje en comparación con p47 phox-/ - ratones indicó que la NADPH oxidasa es la fuente principal de la generación de ROS en respuesta a estímulos inflamatorios. Este método proporciona un método mínimamente invasivo para el "tiempo real" monitoreo de la generación de ROS durante la inflamación in vivo.
Protocol
1. Modelos Animales
- Ratones: Use p47 phox-/ - ratones y la edad y el sexo combinado-ratones C57BL6/DBA. Obtener la aprobación para los experimentos de Cuidado de Animales institucional y el empleo.
- Anestesia: Utilice un sistema de administración continua para inducir la anestesia con isoflurano. El sistema vaporizador (VetEquip) se llena con isoflurano (2-3%). Confirmar que los ratones son completamente anestesiado mediante la observación de la respiración, el movimiento y reflejo corneal en respuesta a estímulos externos.
- Los procedimientos quirúrgicos: Frote el área quirúrgica (de sobremesa) con 70% de etanol. Use guantes estériles y una bata quirúrgica limpia y la máscara. Preparar los ratones por cortar el pelo y aplicar betadine alternando con 70% de etanol a la zona donde se realizará la incisión. Realizar la cirugía en una superficie estéril y utilizar instrumentos estériles. Monitor de ratones después de la operación hasta que despierto y moverse libremente.
- Administración intratraqueal zymosan
- Administrar anestesiacomo se describe en 1,2.
- Desinfectar área quirúrgica (cuello) con betadine y 70% de etanol y exponer la tráquea por disección quirúrgica.
- Pierce tráquea con una aguja de calibre 27-e inyectar zymosan (St. Louis, MO) a una dosis de 1 mg / g usando un g 0,5 / l solución (volumen total de 50 l para un ratón de 25 g) disuelto en PBS estéril.
- Cuello ratones Cerrar la herida con suturas de seda 5-0 estériles en condiciones asépticas.
- Imagen después de 4 horas y 24 horas.
- Ligadura cecal y punción
- Administrar anestesia como se describe en 1.2.
- Clip de pelo en el área quirúrgica (abdomen) y desinfectar con betadine y un 70% de etanol.
- Lleve a cabo una laparotomía media e identificar el ciego.
- Se liga el distal 50% de ciego expuesta con sutura de seda 4-0 y el ciego punción distal a la ligadura con una pasada de una aguja de calibre 21-.
- Cierre la incisión con suturas de seda 4-0 estériles.
- Imagen después de 4 horas y24 hr.
- Oral en tetracloruro de carbono (CCl 4) Administración
- Administrar anestesia como se describe en 1.2.
- Administrar CCl 4 (2 mg / g, St. Louis, MO) disuelto en aceite de maíz por alimentación forzada oral. El procedimiento de administración de CCl4 se debe realizar en un área designada de acuerdo con IBC / EHS políticas.
- Imagen después de 4 horas y 24 horas.
2. La adquisición de una imagen de Bioluminescent
- Inicialice el IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, en modo luminiscencia, y esperar a que el dispositivo de carga acoplada (CCD) temperatura de bloqueo.
- Seleccione el tiempo de exposición, hurgar en la basura (medio) y F / Stop ajustes (8).
- Ratones coloque en posición supina en la cámara de formación de imágenes en una etapa calentada para mantener la temperatura corporal normal. Administrar anestesia como se describe en 1,2 a través de cono de la nariz mientras que los ratones se encuentran en la cámara de formación de imágenes IVIS.
- Administrar L-012 (20 mg / g) disuelto en PBS estéril (10 g / l) por vía intravenosa a través de retro-orbital de inyección en cada punto de tiempo seleccionado para la formación de imágenes.
- Capturar imágenes que comienzan en 2 min después de la inyección L-012. Nos típicamente utilizan una exposición de 40 segundos.
3. Análisis de datos utilizando región de interés
- Analizar datos usando software Image Living V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Abra una imagen y seleccionar la medición de la Región de herramientas de Interés.
- Seleccione la Región de Interés forma y tamaño sobre el pecho o / y el abdomen después de la superposición de una imagen digital pseudo-color (que representa la detección de fotones) en una imagen fotográfica del ratón.
- Cuantificar la intensidad de la señal (flujo de fotones) de la región de interés.
4. Estadística
- Utilice el paquete de software estadístico para llevar a cabo análisis ANOVA de dos vías con Bonferroni post-pruebas en puntos de tiempo individuales.
Zimosán es un pro-inflamatoria célula de levadura producto de la pared y un potente activador de la NADPH oxidasa 3. Anteriormente puso de manifiesto que zymosan intratraqueal induce una inflamación neutrofílica de pulmón más robusto y pro-inflamatorios en la producción de citoquinas p47 phox-/ - en comparación con ratones de tipo salvaje 1. En este sentido, nuestro objetivo fue comparar la generación de ROS en los pulmones de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones después de la exposición zymosan. A las 4 horas después de la administración intratraqueal zymosan, se observó un aumento significativo de la emisión de fotones sobre el pecho en ratones de tipo salvaje en comparación con el valor basal, así como un aumento en la emisión de fotones en comparación con el tipo salvaje p47 phox-/ - ratones en 4 h y 24 h. En contraste, las señales de bioluminiscencia en p47 phox-/ - ratones se mantuvieron en niveles de línea de base en 4 horas después del tratamiento zymosan (Fig.1 AB). Por lo tanto, la NADPH oxidasa parece be la fuente principal de la generación de ROS en los pulmones después de la administración zymosan.
A continuación, se evaluó la producción de ROS en el modelo de sepsis inducida por CLP. La sepsis es un síndrome potencialmente mortal asociada con lesión de órganos diana, incluyendo la lesión pulmonar aguda (LPA) y síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA) 4, 5. ROS mediada por lesión ha sido considerado como un factor importante en la sepsis inducida por disfunción multiorgánica. Se encontró que ROS se incrementaron significativamente en el pecho (4 hr) y sobre el abdomen (24 hr) después de CLP en ratones de tipo salvaje en comparación con el valor basal. Sin embargo, los niveles de ROS en p47 phox-/ - ratones fueron similares a los niveles basales en ambos puntos de tiempo (figura 2 AC). Estos resultados muestran que la generación de ROS en el modelo de sepsis inducida por CLP ratón es NADPH oxidasa dependiente.
Finalmente, se utilizaron imágenes de bioluminiscencia para detectar la producción de ROS en un CCl 4-inducida por daño hepático modol. CCl 4 causa la necrosis hepatocelular, y se ha utilizado para modelar tanto daño hepático agudo y fibrosis hepática 6. En contraste con los modelos descritos anteriormente de la inflamación y la lesión, se encontró que la producción de ROS en el abdomen fue modestamente (aproximadamente 35%) se incrementó sobre la línea base en p47 phox-/ - ratones en 4 h después de la administración de CCl 4. Sin embargo, la magnitud de CCl 4-inducida por la generación de ROS fue significativamente mayor en los ratones de tipo salvaje que en p47 phox-/ - ratones (Fig. 3 AB). Estos datos sugieren que tanto la generación de ROS p47 phox que contiene NADPH oxidasa dependiente e independiente-ocurren en aguda CCl 4-inducida por la lesión hepática.
Figura 1. ROS producción en los pulmones después del tratamiento zymosan. A) Representante bioluminescence imágenes de la producción de ROS. Tenga en cuenta que además del pecho, la luminiscencia es detectable sobre el abdomen en tanto de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones y luminiscencia abdominal no se modifica por el tratamiento zymosan. B) fotones conteos del pecho de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones después de una sola inyección intratraqueal (IT) de zymosan. Imágenes de bioluminiscencia se realizó al inicio, 4 h, y 24 h. La emisión de luz desde la región de interés sobre el pecho se identificó utilizando la indicada pseudo-color escala. Los resultados se presentan como media ± SE, n = 6-9 por grupo, * = p <0,05. Haga clic aquí para agrandar la figura .
Figura 2. Detección de ROS tras CLP. A) Representante imágenes de bioluminiscencia de producción de ROS, BFotones) cuenta desde el pecho y C) los recuentos de fotones desde el abdomen de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones al inicio del estudio, 4 h, y 24 h después de CLP. Los resultados se presentan como media ± SE, n = 4-5 por grupo, * = p <0,05. Haga clic aquí para agrandar la figura .
Figura 3. Producción de ROS en el abdomen después de CCl 4-inducida por la lesión hepática. Una imagen) bioluminiscencia Representante de la producción de ROS y B) cuenta fotones del abdomen de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones al inicio del estudio, 4 horas, y 24 horas después de la CCL 4 tratamiento bucal. Los resultados se presentan como media ± SE;. N = 4-5 por grupo, * = p <0,05 Haga clic aquí para agrandar la figura
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Discussion
"Tiempo real" medición de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en los animales vivos se puede lograr mediante el uso de sondas fluorescentes y quimioluminiscentes. Mientras que las sondas fluorescentes sufren de tener débiles señal-a-ruido 12, se describe la técnica de imagen es más sensible para la detección de la emisión de luz después de una reacción química de ROS con el sustrato luminol basado en L-012. Como todas las técnicas de formación de imágenes bioluminiscentes, esta metodología está limitada por la absorción de luz de longitud de onda dependiente y dispersión de órganos y tejidos. Estos experimentos se centraron en el establecimiento de unas condiciones adecuadas experimentales para la medición de ROS en tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones. El uso de estos ratones modificados genéticamente nos permite diferenciar ROS generados por p47 phox de la NADPH oxidasa que contiene de ROS generados por otras vías.
Aunque la NADPH oxidasa funcional que contiene p47 phox esuna fuente importante de ROS, otras isoformas de la NADPH oxidasa existe, y otros sistemas de generación de ROS, incluyendo la xantina oxidasa y la respiración mitocondrial, puede producir ROS. NADPH oxidasa y otras vías de generación de ROS-pueden tener efectos importantes e interactiva en la defensa del huésped antimicrobiana y vías de señalización posteriores que modulan la inflamación y lesión 7-10. Uso de imágenes de bioluminiscencia, hemos sido capaces de medir la cinética de la producción de ROS en vivo y para delinear la contribución de la NADPH oxidasa de los niveles de ROS en diferentes modelos inflamatorios.
Una limitación de este método se refiere a la resolución espacial de la bioluminiscencia. Aunque se puede medir la luminiscencia dentro de determinados compartimentos anatómicos (por ejemplo., Tórax, abdomen), es difícil de localizar el sitio anatómico de la luminiscencia en el nivel del órgano. En cada uno de nuestros modelos experimentales elegimos tres puntos en el tiempo para las mediciones de referencia, bioluminiscentes: 4 horas y 24 hr. No sabemos si bioluminiscente de imágenes puede identificar pequeñas diferencias en la generación de ROS durante intervalos más cortos de análisis o si la relación entre la generación de ROS en vivo y bioluminiscencia es lineal. Estas cuestiones requieren más estudios. En los modelos utilizados para estos estudios, se sospecha que las células fagocíticas, los neutrófilos reclutados y macrófagos, son principalmente responsables de la producción de ROS mediante el sistema de NADPH oxidasa fagocítica. Los estudios futuros en los que tipos específicos de células se agotan o quimeras de hueso generado se podría proporcionar un conocimiento adicional acerca de los niveles relativos de la generación de ROS de diferentes poblaciones de células. Otra limitación potencial de los estudios que utilizan L-012 es que los radicales de otros (además ROS) puede reaccionar con esta sonda luminiscente, la reducción de la especificidad para la detección de ROS en algunas circunstancias.
Después de la inyección zymosan, la falta de producción de ROS en p47 phox-/ - ratones indica que la NADPH oxidasa esla principal fuente de ROS en este modelo de inflamación pulmonar. CLP es uno de los modelos animales más comunes de la sepsis y 11 imágenes de bioluminiscencia reveló aumento de señales de ROS tanto en el pulmón y el abdomen que eran NADPH oxidasa dependiente. En contraste con el zymosan y modelos CLP, ROS se incrementaron en el abdomen de tanto de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones en comparación con el valor inicial, pero en un grado mayor en los ratones de tipo silvestre, lo que indica que CCl 4 induce la producción de ROS por p47 phox - que contiene la NADPH oxidasa y otros mecanismos.
En resumen, nuestros datos muestran que un método basado en luminol bioluminiscencia de imágenes para la detección de ROS puede ser una herramienta valiosa para la investigación sobre la regulación y las consecuencias de la producción de ROS en vivo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el NIH RO1 AI079253 y el Departamento de Asuntos de Veteranos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
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