Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bioluminescens Avbildning av NADPH-oxidas aktivitet i olika djurmodeller

Published: October 22, 2012 doi: 10.3791/3925

Summary

NADPH-oxidas är den huvudsakliga källan för reaktiva syrespecies (ROS) i fagocyter. På grund av den kortlivade karaktär ROS, är det svårt att mäta och övervaka ROS nivåer i levande djur. En minimalinvasiv metod för seriell kvantifiering av ROS i levande möss beskrivs.

Abstract

NADPH-oxidas är en kritisk enzym som medierar antibakteriella och svampdödande värdförsvar. Utöver sin roll i antimikrobiella värdförsvar har NADPH-oxidas kritiska signalfunktioner som modulerar den inflammatoriska responsen 1. Således är utvecklingen av en metod för att mäta i "realtid" kinetiken för NADPH-oxidas-derived ROS generation förväntas vara ett värdefullt forskningsverktyg för att förstå mekanismerna som är relevanta för värd försvar, inflammation och skador.

Kronisk granulomatös sjukdom (CGD) är en ärftlig sjukdom i NADPH-oxidas kännetecknas av svåra infektioner och överdriven inflammation. Aktivering av fagocyt NADPH-oxidas kräver translokation av dess cytosoliska subenheter (P47 phOx, P67 phOx, och p40 phOx) och Rac till en membranbunden flavocytochrome (bestående av en gp91 phOx och P22 phOx heterodimer). Förlustav funktion mutationer i någon av dessa NADPH-oxidas komponenter resulterar i CGD. Liknar patienter med CGD gp91 phOx-deficienta möss och P47 phOx-deficienta möss har defekt fagocyt aktivitet NADPH-oxidas och försämrad värdförsvar 13, 14. Förutom fagocyter, som innehåller NADPH-oxidas ovan beskrivna komponenterna, en mängd andra celltyper uttrycker olika isoformer av NADPH-oxidas.

Här beskriver vi en metod för att kvantifiera ROS-produktionen i levande möss och att beskriva bidraget av NADPH-oxidas till ROS generation modeller för inflammation och skada. Denna metod är baserad på ROS reagera med L-012 (en analog av luminol) att emittera luminescens som registreras av en laddningskopplad anordning (CCD). I den ursprungliga beskrivningen av L-012 sond, jag var-012-beroende kemiluminescens helt avskaffas genom superoxiddismutas, vilket indikerar att den huvudsakliga ROS detekteras i denna reaktion var superoxid anjon 15. Efterföljande studier har visat att L-012 kan detektera andra fria radikaler, inklusive reaktiva kväve arter 16, 17. Kielland et al. 17 visade att topisk applicering av forbolmyristatacetat, en potent aktivator av NADPH-oxidas, ledde till NADPH-oxidas-beroende ROS generation som kunde detekteras i möss med användning av luminescerande sond L-012. I denna modell visade de att L-012-beroende luminiscens avskaffades P47 phOx-brist möss.

Vi jämförde ROS generation i vildtyp möss och NADPH-oxidas-brist P47 phOx-/ - möss 2 i följande tre modeller: 1) intratrakeal administrering av zymosan, en pro-inflammatorisk svampens cellvägg som härrör produkt som kan aktivera NADPH-oxidas, 2) cecal ligering och punktering (CLP), en modell för intraabdominell sepsis med sekundär akut lunginflammation och skador, och 3) muntlig koltetraklorid(CCl 4), en modell av ROS-beroende leverskada. Dessa modeller var särskilt valts för att utvärdera NADPH-oxidas-beroende ROS generation i samband med icke-infektiös inflammation, polymikrobiella sepsis och toxin-inducerad organskada, respektive. Jämföra bioluminiscens i vildtyp möss P47 phOx-/ - möss kan vi beskriva specifika medverkan i ROS genereras av P47 phOx innehållande NADPH-oxidas till bioluminescent signalen i dessa modeller.

Bioluminescens imaging resultat som visade ökad ROS nivåer i vildtyp möss jämfört med P47 phOx-/ - möss indikerade att NADPH-oxidas är den huvudsakliga källan av ROS generering som svar på inflammatoriska stimuli. Denna metod ger en minimalinvasiv metod för "realtid" övervakning av ROS generation under inflammation in vivo.

Protocol

1. Djurmodeller

  1. Möss: Använd P47 phOx-/ - möss och ålder-och kön-matchade C57BL6/DBA möss. Erhålla godkännande för experiment från institutionella Animal Care och användning kommittén.
  2. Anestesi: Använd ett kontinuerligt isofluran administration för att inducera anestesi. Förångarens systemet (VetEquip) är fylld med isofluran (2-3%). Bekräfta att möss är helt bedövades genom att observera andning, rörelse, och kornealreflex som svar på yttre stimuli.
  3. Kirurgiska procedurer: Skrubba kirurgiska området (bänkskiva) med 70% etanol. Bär sterila handskar och en ren operationsrock och mask. Förbered mössen genom att klippa håret och tillämpa betadin omväxlande med 70% etanol till det område där snittet skall göras. Operera på en steril yta och använda sterila instrument. Övervaka möss postoperativt tills vaken och röra sig fritt.
  4. Intratrakeal zymosan administration
    1. Administrera anestesisom beskrivs i 1,2.
    2. Desinficera operationsområdet (nacken) med Betadine och 70% etanol och exponera luftstrupen genom kirurgisk dissektion.
    3. Pierce trakea med en 27-gauge nål och injicera zymosan (St. Louis, MO) vid en dos av 1 pg / g med användning av en 0,5 ug / ul lösning (total volym 50 pl för en 25 g mus) löst i steril PBS.
    4. Stäng möss hals lindad med 5-0 sterila silke suturer under aseptiska förhållanden.
    5. Bild efter 4 timmar och 24 timmar.
  5. Cecal ligering och punktering
    1. Administrera anestesi enligt 1,2.
    2. Clip hår i det kirurgiska området (buken) och desinficera med betadin och 70% etanol.
    3. Utför en mittlinje laparotomi och identifiera blindtarmen.
    4. Ligera distala 50% av exponerade blindtarmen med 4-0 silke sutur och punktering blindtarmen distalt ligeringen med en passage av en 21-nål.
    5. Stäng snittet med 4-0 sterila silke suturer.
    6. Bild efter 4 timmar och24 tim.
  6. Oral koltetraklorid (CCl 4) administrering
    1. Administrera anestesi enligt 1,2.
    2. Administrera CCl 4 (2 ug / g, St Louis, MO) upplöst i majsolja genom oral sondmatning. Förfarandet för CCI4 administrationen bör utföras i ett särskilt område i enlighet med IBC / EHS politik.
    3. Bild efter 4 timmar och 24 timmar.

2. Förvärva en Bioluminescent bild

  1. Initiera IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, inställd på luminiscens läge och vänta på charge-coupled device (CCD) temperatur för att låsa.
  2. Välj exponeringstid, binning (medium) och f / stop (8) inställningar.
  3. Placera möss i ryggläge i bildbehandling kammare på en uppvärmd scenen för att hålla normal kroppstemperatur. Administrera anestesi enligt 1,2 via noskon medan möss i IVIS avbildning kammare.
  4. Administrera L-012 (20 pg / g) löst i steril PBS (10 pg / pl) intravenöst via retroorbital injektion vid varje tidpunkt valts för avbildning.
  5. Ta bilder med början vid 2 min efter L-012 injektion. Vi använder vanligtvis en 40 sekunder exponering.

3. Dataanalys med regionen av intresse

  1. Analysera data med Living bildbehandlingsprogram v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
  2. Öppna en bild och välj mätning av regionen av intresse verktyg.
  3. Välj regionen av intresse form och storlek över bröstet och / eller buken efter överliggande en pseudo-färgad digital bild (representerande fotondetektering) över en fotografisk bild av musen.
  4. Kvantifiera signalstyrka (fotonflödet) från området av intresse.

4. Statistik

  1. Använda statistisk paket analysprogram för att utföra två-vägs ANOVA med Bonferroni efter testning vid enskilda tidpunkter.
TLE "> 5. Representativa resultat

Zymosan är en pro-inflammatorisk jästcellväggar produkt och en potent aktivator av NADPH-oxidas 3. Vi visade tidigare att intratrakeal zymosan inducerar en mer robust neutrofil lunginflammation och proinflammatorisk cytokinproduktion i P47 phOx-/ - jämfört med vildtyp möss 1. Här var vårt mål att jämföra ROS generation i lungorna hos vildtyp och P47 phOx-/ - möss efter zymosan utmaning. Vid 4 timmar efter intratrakeal zymosan administration observerade vi en betydande ökning av fotonemission över bröstet i vildtyp möss jämfört med utgångsvärdet samt en ökning av fotonemission i vildtyp jämfört med P47 phOx-/ - möss vid 4 h och 24 timmar. Däremot bioluminescens signaler i P47 phOx-/ - förblev möss på baslinjenivåer vid 4 timmar efter zymosan behandling (figur 1 AB). Således verkar NADPH-oxidas till be den största källan till ROS produktion i lungorna efter zymosan administration.

Därefter bedömde vi ROS produktion i CLP-inducerade sepsis modell. Sepsis är ett livshotande syndrom i samband med slut-organskada, inklusive akut lungskada (ALI) och akut andnödssyndrom (ARDS) 4, 5. ROS-medierad skada har ansetts vara en viktig faktor som driver sepsisinducerade flera organ dysfunktion. Vi fann att ROS signifikant ökade över bröstet (4 timmar) och över buken (24 timmar) efter CLP i vildtyp möss jämfört med baslinjen. Men ROS nivåer i P47 phOx-/ - var möss som liknar baslinjenivåer vid båda tidpunkterna (fig. 2 AC). Dessa resultat visar att ROS generation CLP-inducerade sepsis musmodell är NADPH-oxidas-beroende.

Slutligen använde vi bioluminiscent avbildning att upptäcka ROS produktion i en CCl 4-inducerad leverskada lägel.. CCl 4 orsakar hepatocellulär nekros, och har använts för att modellera både akut leverskada och leverfibros 6. I motsats till de tidigare beskrivna modeller av inflammation och skada, fann vi att ROS produktion i buken var blygsamt (cirka 35%) ökade under baslinjen i P47 phOx-/ - möss vid 4 timmar efter CCl 4 administrering. Emellertid var omfattningen av CCL 4-inducerad ROS generation signifikant större i vildtyp möss än i P47 phOx-/ - möss (Fig. 3 AB). Dessa data antyder att både P47 phOx-innehållande NADPH-oxidas-beroende och-oberoende ROS produktion förekommer i akut CCl 4-inducerad leverskada.

Figur 1
Figur 1. ROS produktion i lungorna efter zymosan behandling. A) representant bioluminescence avbildning av ROS-produktionen. Notera att förutom bröstet, är luminescens detekterbar över buken i både vildtyp och P47 phOx-/ - möss och buken luminescens är oförändrad genom zymosan behandling. B) fotonen räknas från bröstet vildtyp och P47 phOx-/ - möss efter en enda intratrakeal (IT) injektion av zymosan. Bioluminescens imaging utfördes vid baslinje, 4 timmar och 24 timmar. Ljusemission från regionen av intresse över bröstet identifierades användning av den angivna pseudo-färgskala. Resultaten presenteras som medelvärde ± SE, n = 6-9 per grupp, * = p <0,05. Klicka här för större figur .

Figur 2
Figur 2. ROS detektion efter CLP. A) Representativa bioluminescens avbildning av ROS-produktionen, B) Photon räknas från bröstet och C) fotonen räknar från buken av vildtyp och P47 phOx-/ - möss vid baslinjen, 4 timmar och 24 timmar efter CLP. Resultaten presenteras som medelvärde ± SE, n = 4-5 per grupp, * = p <0,05. Klicka här för större figur .

Figur 3
Figur 3. ROS-produktionen i buken efter CCl 4-inducerad leverskada. A) Representativa bioluminiscens avbildning av ROS produktion och B) fotonen räknas från buken av vildtyp och P47 phOx-/ - möss vid baslinjen, 4 timmar och 24 timmar efter oral CCl 4 behandling. Resultaten presenteras som medelvärde ± SE,. N = 4-5 per grupp, * = p <0,05 Klicka här för större bild

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

"Realtid" mätning av reaktiva syrespecies (ROS) i levande djur kan uppnås genom att använda fluorescerande och kemiluminescerande prober. Medan fluorescerande prober lider ha svaga signal-till-brusförhållanden 12, är bildteknik beskrivs mer känslig för detektion av ljusemission efter en kemisk reaktion av ROS med luminol-baserade substrat L-012. Liksom alla bioluminescerande avbildningstekniker, är denna metod begränsad av våglängdsberoende Ijusabsorption och spridning av organ och vävnader. Dessa experiment fokuserade på upprättande lämpliga experimentella förhållanden för mätning av ROS i vildtyp och P47 phOx-/ - möss. Användningen av dessa genetiskt modifierade möss kan vi skilja ROS genereras av P47 phOx-innehållande NADPH-oxidas från ROS genereras av andra vägar.

Även funktionell NADPH-oxidas innehållande P47 phOx ären stor källa av ROS, andra NADPH oxidase isoformer existerar, och ytterligare ROS-genererande system, inklusive xantinoxidas och mitokondriell andning, kan producera ROS. NADPH-oxidas och andra ROS-generering vägar kan ha viktiga och interaktiva effekter på antimikrobiell värdförsvar och nedströms signalvägar som modulerar inflammation och skada 7-10. Med hjälp av bioluminiscens avbildning, kunde vi mäta kinetiken för ROS produktion in vivo och att avgränsa bidrag NADPH oxidas till ROS nivåer i olika inflammatoriska modeller.

En begränsning av denna metod avser rumsliga upplösningen i bioluminescens. Även om vi kan mäta luminescens inom specifika anatomiska utrymmen (t ex., Bröstkorg, buk), är det svårt att lokalisera den anatomiska platsen för luminescens vid orgeln nivå. I alla våra experimentella modeller vi valde 3 tidpunkter för självlysande mätningar: baseline, 4 tim och 24 tim. Vi vet inte om bioluminescent avbildning kan identifiera små skillnader i ROS generation över kortare intervall för analys eller om förhållandet mellan in vivo-ROS generation och bioluminiscens är linjär. Dessa frågor kräver ytterligare studier. I de modeller som används för dessa studier, misstänker vi att fagocytiska celler, rekryterade neutrofiler och makrofager, är i första hand ansvariga för ROS produktion via fagocytsystemet NADPH-oxidas-system. Framtida studier i vilka specifika celltyper utarmade eller ben chimärer genereras kan ge ytterligare kunskaper om relativa ROS generation från olika cellpopulationer. En annan potentiell begränsning av studier som använder L-012 är att andra radikaler (förutom ROS) kan reagera med denna luminescerande sond, minskar specificitet för ROS detektion under vissa omständigheter.

Efter zymosan injektion, bristen på ROS-produktionen i P47 phOx-/ - möss indikerar att NADPH-oxidas ärden största källan av ROS i denna modell av lunginflammation. CLP är en av de vanligaste djurmodeller för sepsis 11 och bioluminescens avbildning avslöjade ökad ROS-signaler i både lungan och magen som var NADPH-oxidas-beroende. I motsats till zymosan och CLP-modeller, var ROS ökade i buken av både vildtyp och P47 phOx-/ - möss jämfört med utgångsvärdet, men i högre grad i vildtyp möss, vilket indikerar att CCU 4 inducerar ROS-produktionen av P47 phOx - innehåller NADPH-oxidas och andra mekanismer.

Sammanfattningsvis våra data visar att en luminol-baserad bioluminescens imaging metod för detektion av ROS kan vara värdefullt verktyg för forskning om regleringen och konsekvenserna av ROS produktion in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av NIH RO1 AI079253 och Department of Veterans Affairs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-012 Wako Chemicals USA, Inc. 120-04891
Zymosan Sigma, St. Louis, MO Z4250
carbon tetrachloride Sigma, St. Louis, MO 289116

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
  2. Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
  3. Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
  4. Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
  5. Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
  6. Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
  7. Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
  8. Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
  9. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
  10. Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
  11. Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
  12. Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
  13. Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
  14. Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
  15. Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
  16. Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).

Tags

Immunologi 68 molekylärbiologi NADPH-oxidas reaktiva syreradikaler bioluminescens imaging
Bioluminescens Avbildning av NADPH-oxidas aktivitet i olika djurmodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, W., Li, H., Segal, B. H.,More

Han, W., Li, H., Segal, B. H., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models. J. Vis. Exp. (68), e3925, doi:10.3791/3925 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter