Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

שימוש במודל של בעלי חיים אלח דם להערכת טיפולים צמחים רומן

Published: April 11, 2012 doi: 10.3791/3926

Summary

אלח דם מתייחס תסמונת תגובה דלקתית מערכתית עקב זיהום מיקרוביאלי, והוא יכול להיות מדומה על ידי טכניקה כירורגית כינה קשירת לנקב cecal ו (CLP). כאן אנו מתארים שיטה להשתמש CLP-Induced מודל החיה למסך צמחי מרפא עבור סוכני טיפולית.

Abstract

אלח דם מתייחס תסמונת תגובה דלקתית מערכתית עקב זיהום מיקרוביאלי. זה היה מדומה שגרתי אצל בעלי חיים על ידי טכניקות שונות, כולל עירוי של הרעלן החיידקי אקסוגני (endotoxemia) או חיידקים (בקטרמיה), כמו גם ניקוב כירורגי של cecum ידי קשירת cecal ו לנקב (CLP) 1-3. CLP מאפשר שפיכה חיידקים וזיהום צואתי של חלל הצפק, מחקה את המחלה הקלינית של דלקת התוספתן האנושי דיברטיקוליטיס או מחורר. חומרת אלח דם, כפי שהיא משתקפת שיעורי התמותה הסופי, ניתן לשלוט בניתוח על ידי שינוי גודל של המחט משמש לנקב cecal 2. אצל בעלי חיים, CLP גורם hemodynamic דומה, biphasic התגובות לב, חילוף חומרים, ואת מערכת החיסון כפי שנצפה במהלך קליני של אלח דם האדם 3. לכן, המודל CLP נחשב אחד הדגמים הכי רלוונטיות קלינית של אלח דם ניסיוני 1-3. </ P>

במודלים של בעלי חיים שונים שימשו להבהיר את המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס הפתוגנזה של אלח דם ניסיונית. התוצאה הקטלנית של אלח דם נובע בין השאר הצטברות יתר של ציטוקינים הראשונים (כגון TNF, IL-1 ו-IFN-γ) 4-6 ו מתווכים מעודדי דלקת מאוחר (למשל, HMGB1) 7. לעומת ציטוקינים מעודדי דלקת מוקדם, מאוחר טווח מתווכים יש חלון טיפולי רחב יותר עבור יישומים קליניים. למשל, הממשל עיכוב של HMGB1-נוגדנים מנטרלים החל 24 שעות לאחר CLP, עדיין להציל עכברים מן הקטלניות 8,9, הקמת HMGB1 כמתווך מאוחר של אלח דם קטלני. גילוי HMGB1 כמתווך מאוחר טווח יזמה תחום חדש של חקירה לפיתוח טיפולים אלח דם באמצעות מסורתית בצמחי מרפא סיניים. במאמר זה נתאר תהליך של אלח דם CLP-Induced, ואת השימוש בו בהקרנת צמחי מרפא עבור HMGB1 במיקוד טיפולים.

Protocol

1. הקמת מודל החיה של אלח דם

  1. בעכברים מורדמים עם קטמין (75 מ"ג / ק"ג, תוך שרירית, IM) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג, IM), והניח במצב שכיבה.
  2. תקן את הרגליים של העכבר עם קלטת כדי להבטיח עמדה יציבה.
  3. לנקות את הבטן עם 3 סקראבס מתחלפים של בבטאדין או חיטוי העור באלכוהול אחרים. ואז, לעשות חתך קו האמצע 15 מ"מ לחשוף cecum.
  4. ולקשור cecum עם תפר משי 4-0 מ"מ על כ 5.0 מקצה cecal ולאחר מכן לנקב את הגדם cecal ligated פעם עם מחט 22-מד לאפשר שיחול על שרפרף.
  5. Cecum מוחלף מיד בחזרה למצב נורמלי התוך בטני שלו.
  6. לסגור את האתר חתך בשתי שכבות, קודם כל לסגור את שרירי הבטן עם התפרים נספגים, ואז לסגור את העור עם קליפים הפצע או התפרים nonabsorbable.
  7. להחיות העכבר פתרון 0.5 מ"ל תמיסת מלח נורמלית אחת לעשותSE של imipenem (0.5 מ"ג / העכבר, תת עורי) מיד לאחר סיום ההליך הכירורגי.
  8. להחזיר את העכבר חזרה לכלוב נקי עם גישה חופשית למזון ומים.
  9. ב CLP נקודות שונות זמן ההודעה, תמצית צמחים או רכיב מנוהל intraperitoneally.
  10. הישרדות בעלי חיים מנוטרת במשך יותר משבועיים. בעלי חיים הגוססת המציגים קשיים הניצבים, נשימה האגונאלית, ניוון שרירים קשה ודימומים בלתי מבוקרת צריך להרדים משאיפת פחמן דו חמצני מנת יתר.
  11. חשוב לציין כי במחזור רמות ציטוקינים הם פרמטרים חשובים במחקרים אלה. משככי כאבים שונים הוכחו להשפיע על שחרור ציטוקין ופעילויות, ולכן היה למנוע בכוונה בטיפול לאחר הניתוח.

2. הכנת תמצית צמחית

  1. תמצית צמחי מרפא במים חמים (85 מעלות צלזיוס) במשך 1-4 שעות (1 שעה על עלים, ו 4 שעות של השורשים).
  2. בצנטריפוגה מים כךחלק luble (3300 גרם, 20 דק ', 4 ° C) להסיר חלקיקים מסיסים.
  3. תסנין חלק supernatant דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.
  4. חלק ברור מסיסים במים תסנין הוא אז מופרדים על ידי ultrafiltration באמצעות Centriprep YM-10 מסנן צנטריפוגלי (מס. 4305, Millipore).
  5. כתוצאה נמוכות (פחות מ 10 KDA) גבוהה (> 10 KDA) שברים בעלי משקל מולקולרי (MWF) מוקרנים על HMGB1 עיכוב פעילות באמצעות תרבויות מקרופאג.
  6. הממשל Intraperitoneal של HMGB1 עיכוב תמצית או רכיבים צמחיים לאחר 24 שעות הודעה CLP להערכת היעילות הטיפולית שלהם.

3. מקרופאג הצפק בידוד

  1. Thioglycollate מרק (4%, 2.0 מ"ל) מנוהל intraperitoneally לעכברים רגילים.
  2. מקרופאגים הצפק ראשיים נקצרים לאחר 3 ימים כפי שתואר קודם 10.
  3. מקרופאגים הם מראש בתרבית DMEM בינוני (Gibco BRL, גרנד איילנד, ניו יורק) בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS), 2 mmol / L גלוטמין, ו 1% פניצילין.
  4. מקרופאגים חסיד נשטפים בעדינות, ולא בתרבית, סרום ללא OPTI-MEM אני בינונית שעתיים לפני גירוי עם רעלן פנימי חיידקי (lipopolysaccharide, תקליטים, החיידק 0111: B4, Sigma-Aldrich).
  5. לאחר 16 שעות לאחר גירוי LPS, רמות HMGB1 במדיום תרבות נקבעים על ידי ניתוח סופג המערבי 11.
  6. עוצמת הלהקה יחסית היה לכמת באמצעות תמונה NIH 1.59 התוכנה כדי לקבוע HMGB1 רמות תוך התייחסות עקומות סטנדרטיות שנוצר עם מטוהרים HMGB1.

4. נציג תוצאות

1. CLP גורם לדלקת מערכתית המקומית.

בתוך כמה שעות של ניתוח CLP, בעלי חיים מפגינים סימנים קליניים של אלח דם הכוללות piloerection, עייפות, מצטופפים, וירידה בצריכת מזון ומים. בעלי חיים מתפתחות הצפק חמורה עם מערכתית ברציפותזיהום בדרך כלל מתים תוך 48-96 שעות. עם זאת, גם גיל, מין, ועל רקע גנטי מתאימים בעלי החיים יכולים להגיב CLP הניתוח באופן להבחין במהלך אלח דם ניסיונית. למשל, ב 48 שעות שלאחר CLP, ואילו בעלי חיים מסוימים פנו המדינה הגוססת (כהגדרתו איור 1), אחרים עשויים להישאר במצב לא גוססת.

סקרים מקיפים של ציטוקינים במחזור גילה הבדלים משמעותיים ברמות של ציטוקינים שונים (למשל, IL-6, KC, MIP-2, ו sTNFR1) בין עכברים מדינות דועכות ולא גוסס (איור 1) 12. יש לציין, מתווכים דלקתיים אלה סווגו כסמנים של פונדקאית אלח דם בגלל רמות במחזור שלהם הם מנבאים שניתן לסמוך על התוצאה הקטלנית של הניסוי 12-14 או אלח דם קליני 15. בנוסף, CLP הנגרמת גם מהדורה מקומית של ציטוקינים תומכי ואנטי דלקתיות כמוקינים שונים. למשל, ב48 שעות הודעה CLP, כמויות משמעותיות של ציטוקינים (כגון IL-6) ו כמוקינים (KC ו MIP-2) עדיין יכול להימדד לא רק מערכתית בדם, אלא גם באופן מקומי בנוזל שטיפה הצפק (איור 2).

2. ההקרנה HMGB1 עיכוב תמצית או רכיבים צמחיים.

שימוש תרבויות מקרופאג, היינו יכולים להעריך את היכולות של תמצית צמחית או רכיבים שונים עיכוב שחרור HMGB1 רעלן פנימי המושרה (איור 3). לאור יכולתם בהודעה HMGB1 עיכוב, אנחנו עוד בחנו את יעילותם של אלח דם החיה מודלים. בהתחשב קינטיקה המאוחרות וממושכת של הצטברות HMGB1 של אלח דם ניסיוני 8, המנה הראשונה של HMGB1 מעכבי קיבל 24 שעות לאחר תחילת אלח דם - נקודת זמן שבו העכברים פיתחו סימנים ברורים של אלח דם ובכלל זה, עייפות piloerection שלשולים. כפי שמוצג באיור 4, עיכב מינהל חוזרות ונשנות של מרכזי תה ירוק גomponent, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), החל ב 24 שעות לאחר תחילתה של אלח דם, באופן משמעותי להציל עכברים של אלח דם קטלני 12. גם כאשר ניתנת דרך הפה, עכברים שניצלו-EGCG עדיין אלח דם קטלני, להגדיל באופן משמעותי בשיעורי ההישרדות של בעלי חיים מ% 16-44% 16. זה יהיה חשוב כדי לקבוע אם טיפולים קומבינטוריים עם רכיבים צמחיים שונים יכולים להשיג הגנה טובה יותר משמעותית במודלים של בעלי חיים של אלח דם. יחדיו, אלה נתוני הניסוי תוקף את הגישה שלנו סוכני מסך טיפוליות חדשניות תוך שימוש במודל חיה של אלח דם CLP-Induced.

5. נציג תוצאות

איור 1
באיור 1. רמות במחזור של סמנים פונדקאית הם באופן משמעותי יותר אצל בעלי חיים ספיגה מתקרבים המדינה הגוססת. Balb / C עכברים היו נתונים אלח דם על ידי CLP פיקוח על הפיתוח של סימני מחלה. בבשלב מאוחר של אלח דם (52 שעות הודעה CLP), הדם נאסף 3 עכברים נורמליים (-CLP), 3 עכברים ספיגה מתקרבים המדינה גוססת, ו -3 עכברים ספיגה במצב לא גוססת. סרום היה אספו מכל קבוצה, ו assayed עבור פרופיל ציטוקינים על ידי מערכי נוגדנים. שים לב להבדל דרמטי את רמות היחסי של סמנים פונדקאית אחדים בין קבוצות שונות. מעובד מתוך דוי: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 באישור כמובן מאליו את הספר.

איור 2
איור 2. זיהוי של ציטוקינים כמוקינים מקומיים מערכתית בגיל 48 משאבי אנוש הודעה CLP. Balb / C עכברים היו נתונים אלח דם על ידי CLP, נוזל הדם או הצפק נבצרו ב 48 שעות שלאחר CLP. הרמות היחסיות של ציטוקינים כמה כמוקינים בנוזל שטיפה נקווה סרום או הצפק נמדדו על ידי מערכי נוגדנים ציטוקינים, והביע כיחידות שרירותיים (AU). כפקדי, דם נוזל הצפק SAmples התקבלו מבעלי חיים בריאים רגילים (-CLP) ללא laparotomy.

איור 3
איור 3. מרכיב צמחים במינון dependently עכבות רעלן פנימי הנגרמת שחרור HMGB1 בתרבויות מקרופאג ראשוניים. ראשיים מקרופאגים הצפק Murine היו מגורה עם LPS בהעדר או נוכחות של רכיב צמחי (למשל, EGCG, 15 מיקרומטר). לאחר 16 שעות לאחר גירוי LPS, רמות HMGB1 במדיום תרבות נקבעו על ידי ניתוח סופג המערבי. מעובד מתוך דוי: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 באישור כמובן מאליו את הספר.

איור 4
באיור 4. מרכיב צמחים הציל עכברים מן אלח דם קטלני. Balb / C עכברים היו נתונים אלח דם קטלני על ידי CLP, ורכיב צמחים (EGCG) היה intraperitoneally מנוהל על 24, 48, +72 שעות לכתוב את התחלתה של אלח דם.הישרדות imal היה פיקוח לתקופה של עד שבועיים. שיטת Kaplan-Meier שימש להשוות את ההבדלים בשיעורי התמותה בין הקבוצות. * P <0.05 לעומת מלוחים. מעובד מתוך דוי: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 באישור כמובן מאליו את הספר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במעבדה, במודלים של בעלי חיים שונים של אלח דם כבר מועסק על מנת להבין את הפתוגנזה של אלח דם כדי לפתח טיפולים חדשים פוטנציאליים. הרלוונטיות הקלינית שלהם נשאר נושא לוויכוח לפני התרגום המוצלח של מחקרים בבעלי חיים לתוך יישומים קליניים של אלח דם. למרות נוגדנים מנטרלים נגד ציטוקינים הראשונות (למשל, TNF) היו מגן במודלים של בעלי חיים endotoxemia / בקטרמיה 17,18, הם למעשה להחמיר הישרדות במודל חיה של אלח דם 19. כמו כן, רוב אנטי TNF סוכנים לא הצליחו להראות יעילות בניסויים קליניים של אלח דם 20-22. כישלון זה משקף באופן חלקי על המורכבות של מנגנוני פתוגניים הבסיסית של אלח דם 23,24. בנוסף, הוא יכול להיות גם לייחס החסרונות בבחירה של: 1) מטרות טיפוליות האפשריים או סמים; 2) במינונים אופטימליים והעיתוי של תרופות, ו -3) לא מציאותיים מדדי התוצאה קליניים (כגון שיעורי תמותה) 25. התגלית האחרונה של תמצית-HMGB1 מיקוד צמחים / רכיבים, כולל 26 Danggui, תה ירוק 12,16, ו 27 Danshen סיפקה דוגמאות מוצלחות של פרה המעסיקים חקירה במודלים של בעלי חיים של אלח דם. חקירה נוספת בתחום זה יהיה לשפוך אור נוסף על מפלי המולקולריים שבבסיס רגולציה של התגובה החיסונית המולדת, ולספק רמזים לפיתוח הרפוי של מחלות דלקתיות שונות. כאשר 1 הקמת CLP במעבדה שלך, מאמץ צריך להיעשות כדי לבצע את הליך הניתוח במהירות ובדיוק האפשרי כדי להבטיח שחזור, במיוחד כאשר באמצעות מספר גדול (30-40) של עכברים להשוות את שיעורי ההישרדות בין קבוצות הניסוי מספר הניסוי. שימוש ארוך טווח הרדמה (כגון קטמין ו xylazine) מאפשר לנו להשלים את הליך כירורגי CLP על מספר רב של עכברים בלוח זמנים קצר יחסית, ובינתיים לעזורלהסיר השונות במינון הפוטנציאל התרחשו לעתים קרובות כאשר באמצעות הרדמה נדיפים. שיעורי ההישרדות וצבירה ציטוקינים מערכתית יכולה להיחשב סימנים של ביצוע מוצלח של הליך CLP.

דגם CLP נעשה שימוש נרחב מכרסמים בגלל יתרונות ברורים של עלות נמוכה, פשטות הליך כירורגי, ונרחבת פתולוגיים, אימונולוגיות, אפיונים פיזיולוגיים. עם זאת, ישנן מספר מגבלות CLP העכבר מודל 1-3. למשל, כמו כל במודלים של בעלי חיים, פער המינים מודגשת על ידי העובדה כי קשירת cecal בלי לנקב עלולה להיות קטלנית בעכברים אדם אבל לא. יתר על כן, בגלל גודלו הקטן של העכבר התייבשות לאחר CLP, לעתים קרובות קשה להשיג דגימות דם הסידורי של המדידה ציטוקינים. חסרונות אלה ניתן להתגבר באופן חלקי על ידי הקמת מודלים CLP בבעלי חיים גדולים יותר 2,3,27,28. בנוסף, חשוב לציין כי שיעורי תמותהאת התקדמות דלקת הצפק במכרסמים נקבעים במידה רבה לפי כמות שחול שרפרף, אשר מושפעים מד המחט פעם לנקב cecum, מספר דקירות, בנפח כולל של cecum ligated ואת צמיגות הצואה 2, 3. בנוסף, מינון ותדירות מתן אנטיביוטיקה בשלב מוקדם של CLP יכול להשפיע גם על שיעורי התמותה. לבסוף, החי והסביבה הדיור יכול גם לתרום השונות של שיעורי התמותה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

AES ו HW הם שיתוף ממציאי בקשות לפטנטים הקשורים HMGB1 מעכבי (tanshinones) כסוכני טיפולית פוטנציאל אלח דם.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות בארה"ב, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (R01GM063075) לבין המרכז הלאומי לרפואה משלימה ואלטרנטיבית (R01AT05076).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Betadine Purdue Products L.P. 25655-41-8
imipenem Merck & Co., Inc. 9882821
Ketamine HCl Hospira Inc. RL-0065
Xylazine Lloyd, Inc. 4821
Autoclip BD Biosciences 427631
4-0 silk suture Roboz Surgical Instruments Co. SUT-15-2
Surflo I.V. Catheter Terumo Medical Corp. SR*OX2419CA
RayBio mouse cytokine antibody array RayBiotech, Inc. AAM-CYT-3
Thioglycollate BD Biosciences 211716

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wichterman, K. A., Baue, A. E., Chaudry, I. H. Sepsis and septic shock--a review of laboratory models and a proposal. J. Surg. Res. 29, 189-201 (1980).
  2. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  3. Hubbard, W. J. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, Suppl . 1. 52-57 (2005).
  4. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 4, 499-511 (2004).
  5. Baggiolini, M., Loetscher, P. Chemokines in inflammation and immunity. Immunol. Today. 21, 418-420 (2000).
  6. Balkwill, F. Cytokines--soluble factors in immune responses. Curr. Opin. Immunol. 1, 241-249 (1988).
  7. Wang, H. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science. 285, 248-251 (1999).
  8. Yang, H. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous high-mobility group box 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 296-301 (2004).
  9. Qin, S. Role of HMGB1 in apoptosis-mediated sepsis lethality. J. Exp. Med. 203, 1637-1642 (2006).
  10. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. J. Vis. Exp. (35), e1488 (2010).
  11. Rendon-Mitchell, B. IFN-gamma Induces High Mobility Group Box 1 Protein Release Partly Through a TNF-Dependent Mechanism. J. Immunol. 170, 3890-3897 (2003).
  12. Li, W. A Major Ingredient of Green Tea Rescues Mice from Lethal Sepsis Partly by Inhibiting HMGB1. PLoS ONE. 2, e1153 (2007).
  13. Osuchowski, M. F., Welch, K., Siddiqui, J., Remick, D. G. Circulating cytokine/inhibitor profiles reshape the understanding of the SIRS/CARS continuum in sepsis and predict mortality. J. Immunol. 177, 1967-1974 (2006).
  14. Heuer, J. G. Evaluation of protein C and other biomarkers as predictors of mortality in a rat cecal ligation and puncture model of sepsis. Crit. Care. Med. 32, 1570-1578 (2004).
  15. Bozza, F. A. Cytokine profiles as markers of disease severity in sepsis: a multiplex analysis. Crit. Care. 11, R49 (2007).
  16. Li, W. EGCG stimulates autophagy and reduces cytoplasmic HMGB1 levels in endotoxin-stimulated macrophages. Biochem. Pharmacol. 81, 1152-1163 (2011).
  17. Beutler, B., Milsark, I. W., Cerami, A. C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 229, 869-871 (1985).
  18. Tracey, K. J. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature. 330, 662-664 (1987).
  19. Eskandari, M. K. Anti-tumor necrosis factor antibody therapy fails to prevent lethality after cecal ligation and puncture or endotoxemia. J. Immunol. 148, 2724-2730 (1992).
  20. Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. The HA-1A Sepsis Study Group. N. Engl. J. Med. 324, 429-436 (1991).
  21. Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli. N. Engl. J. Med. 307, 1225-1230 (1982).
  22. Abraham, E. Efficacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor alpha in patients with sepsis syndrome. A randomized, controlled, double-blind, multicenter clinical trial. TNF-alpha MAb Sepsis Study Group. JAMA. 273, 934-941 (1995).
  23. Cohen, J. Adjunctive therapy in sepsis: a critical analysis of the clinical trial programme. Br. Med. Bull. 55, 212-225 (1999).
  24. Dellinger, R. P. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Crit. Care Med. 36, 296-327 (2008).
  25. Wang, H., Zhu, S., Zhou, R., Li, W., Sama, A. E. Therapeutic potential of HMGB1-targeting agents in sepsis. Expert. Rev. Mol. Med. 10, e32 (2008).
  26. Wang, H. The aqueous extract of a popular herbal nutrient supplement, Angelica sinensis, protects mice against lethal endotoxemia and sepsis. J. Nutr. 136, 360-365 (2006).
  27. Li, W. A cardiovascular drug rescues mice from lethal sepsis by selectively attenuating a late-acting proinflammatory mediator, high mobility group box 1. J. Immunol. 178, 3856-3864 (2007).
  28. Fukuyama, M. Mixed bacterial infection model of sepsis in rabbits and its application to evaluate superantigen-adsorbing device. Blood Purif. 23, 119-127 (2005).

Tags

רפואה גיליון 62 טיפולים צמחים תאים חיסוניים מולדים ציטוקינים HMGB1 מודל ניסיוני של אלח דם בעלי חיים קשירת לנקב cecal ו
שימוש במודל של בעלי חיים אלח דם להערכת טיפולים צמחים רומן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W., Zhu, S., Zhang, Y., Li, J.,More

Li, W., Zhu, S., Zhang, Y., Li, J., Sama, A. E., Wang, P., Wang, H. Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies. J. Vis. Exp. (62), e3926, doi:10.3791/3926 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter