Summary
Sepsis henviser til en systemisk inflammatorisk respons syndrom skyldes en mikrobiel infektion, og kan simuleres ved en kirurgisk teknik kaldet cecal ligering og punktering (CLP). Her beskriver vi en fremgangsmåde til at anvende CLP-induceret dyremodel til screening lægeurter for terapeutiske midler.
Abstract
Sepsis henviser til en systemisk inflammatorisk respons syndrom skyldes en mikrobiel infektion. Det har været rutinemæssigt simuleret i dyr ved adskillige teknikker, herunder infusion af eksogent bakterielt toksin (endotoksæmi) eller bakterier (bakteriæmi), samt kirurgisk perforering af coecum ved cecal ligering og punktering (CLP) 1-3. CLP kan bakterierne spild og fækalt kontaminering af den peritoneale kavitet, efterligne den humane kliniske sygdom perforeret blindtarmsbetændelse eller diverticulitis. Sværhedsgraden af sepsis, som afspejlet i de endelige dødelighed, kan styres kirurgisk ved at variere størrelsen af nålen, der anvendes til cecal punktering 2. Hos dyr, inducerer CLP lignende, bifasisk hæmodynamisk kardiovaskulære, metaboliske, og immunologiske reaktioner som observeret under kliniske forløb af menneskets sepsis 3. Således er CLP-modellen betragtes som en af de mest klinisk relevante modeller for eksperimentel sepsis 1-3. </ P>
Forskellige dyremodeller er blevet anvendt til at belyse de indviklede mekanismerne bag patogenesen af eksperimentel sepsis. Den letale konsekvens af sepsis skyldes dels en overdreven ophobning af tidlige cytokiner (såsom TNF, IL-1 og IFN-γ) 4-6 og sene proinflammatoriske mediatorer (f.eks HMGB1) 7. Sammenlignet med tidligere proinflammatoriske cytokiner, har sen virkende mediatorer et bredere terapeutisk vindue til kliniske anvendelser. For eksempel, forsinket indgift af HMGB1-neutraliserende antistoffer begyndende 24 timer efter CLP stadig reddet mus fra dødelighed 8,9, om HMGB1 som et sent mediator for letal sepsis. Opdagelsen af HMGB1 som en sen-virkende mægler har indledt et nyt felt for undersøgelse for udvikling af sepsis behandlinger ved hjælp af traditionel kinesisk urtemedicin. I dette papir, beskriver vi en procedure for CLP-induceret sepsis, og dens anvendelse i screening urtemedicin for HMGB1 målretning terapier.
Protocol
1. Etablering af Animal Model af Sepsis
- Mus er bedøvet med ketamin (75 mg / kg, intramuskulær, IM) og xylazin (10 mg / kg, IM) og anbragt i rygleje.
- Fastgør fødderne af musen med tape for at sikre en stabil position.
- Rengør maven med 3 skiftende krat af betadin eller andre hud desinfektionsmiddel og alkohol. Derefter foretage en 15 mm midtlinjeincision for at eksponere coecum.
- Ligere coecum med en 4-0 silkesutur ved ca 5,0 mm fra den coecale spids og derefter punktere ligerede cecal stumpen en gang med en 22-gauge nål for at tillade ekstrudering af afføring.
- Coecum umiddelbart ændres tilbage til sin normale intra-abdominal position.
- Lukke incisionsstedet i to lag, ved først at lukke muskulatur maven med absorberbare suturer, og derefter lukke huden med sårklemmer eller ikke-absorberbare suturer.
- Genoplive mus med 0,5 ml normalt saltvand og en enkelt dose af imipenem (0,5 mg / mus subkutant) umiddelbart efter afslutningen af den kirurgiske procedure.
- Retur musen tilbage til et rent bur med fri adgang til mad og vand.
- På forskellige tidspunkter efter CLP, er urteekstrakt eller komponent indgivet intraperitonealt.
- Dyrenes overlevelse overvåges over to uger. Døende dyr udviser vanskeligheder til at stå, agonal vejrtrækning, svær muskelsvind og ukontrolleret blødning bør aflives ved en overdosis kuldioxid indånding.
- Det er vigtigt at bemærke, at cirkulerende cytokinniveauer er vigtige parametre i disse undersøgelser. Forskellige analgetika har vist sig at påvirke cytokin frigivelse og aktiviteter, og derfor er blevet bevidst undgået i postoperativ pleje.
2. Fremstillinq af urteekstrakt
- Udtrække urter i varmt vand (85 ° C) i 1-4 timer (1 time til blade, og 4 timer efter rødder).
- Centrifugeres vand, såluble fraktion (3300 g, 20 min, 4 ° C) for at fjerne uopløselige partikler.
- Filtratet supernatantfraktionen gennem et 0,2 um filter.
- Den klare vandopløselige filtratfraktion derefter fraktioneret ved ultrafiltrering under anvendelse Centriprep YM-10 centrifugalfilterenhed (catalog no. 4305, Millipore).
- Det resulterende lave (<10 kDa) og høj (> 10 kDa) molekylvægtsfraktioner (MWF) screenes for HMGB1-inhiberende aktiviteter med makrofagkulturer.
- Intraperitoneal administration af HMGB1-inhiberende urteekstrakt eller komponenter ved 24 timer efter CLP at evaluere deres terapeutiske virkning.
3. Peritoneal makrofag Isolation
- Thioglycollat bouillon (4%, 2,0 ml) indgivet intraperitonealt i normale mus.
- Primære peritoneale makrofager høstet efter 3 dage som beskrevet tidligere 10.
- Makrofager er præ-dyrket i DMEM-medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mmol / L glutamin, og 1% penicillin.
- Adhærerende makrofager vaskes forsigtigt med, og dyrket i serum-frit OPTI-MEM I medium to timer før stimulering med bakterielt endotoxin (lipopolysaccharid, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
- Ved 16 timer efter LPS-stimulering, er niveauer af HMGB1 i dyrkningsmediet bestemmes ved Western blotting-analyse 11.
- Den relative båndintensitet blev kvantificeret ved anvendelse af NIH image 1,59 software til at bestemme HMGB1 niveauer med hensyn til standardkurver genereret med oprenset HMGB1.
4. Repræsentative resultater
1. CLP inducerer systemisk og lokal inflammation.
Inden for få timer efter CLP kirurgi udviser dyr kliniske tegn på sepsis, der omfatter piloerektion, sløvhed, huddling, og fald i fødevare-og vandindtag. Dyr udvikler en svær bughindebetændelse med efterfølgende systemiskinfektion normalt dør inden for 48 til 96 timer. Men selv alder-, køn-, og genetiske baggrund-matchede dyr reagere på CLP kirurgi i en nævneværdig måde i løbet af eksperimentel sepsis. For eksempel, at 48 timer efter CLP mens nogle dyr kan have henvendt sig til døende tilstand (som defineret i figur 1), andre kan forblive på et ikke-døende tilstand.
Omfattende undersøgelser af cirkulerende cytokiner afslørede dramatiske forskelle i adskillige cytokiner (f.eks IL-6, KC, MIP-2 og sTNFR1) mellem mus i de døende og ikke-er døende tilstande (fig. 1) 12. Især har disse inflammatoriske mediatorer blevet klassificeret som surrogatmarkører for sepsis, fordi deres cirkulerende niveauer er pålideligt billede af dødelig udgang i eksperimentel 12-14 eller klinisk sepsis 15. Desuden CLP inducerede lokale frigivelse af forskellige pro-og anti-inflammatoriske cytokiner og chemokiner. For eksempel ved48 timer efter CLP, betydelige mængder af cytokiner (f.eks IL-6) og chemokiner (KC og MIP-2) stadig kan måles ikke blot systemisk i blodet, men også lokalt i den peritoneale lavagevæske (figur 2).
2. Screening for HMGB1-inhiberende urteekstrakt eller komponenter.
Brug makrofagkulturer, var vi i stand til at vurdere kapaciteten i forskellige urteekstrakt eller komponenter i hæmme endotoksininduceret HMGB1 release (Figur 3). I lyset af deres kapacitet til at inhibere HMGB1 udgivelse, har vi yderligere undersøgt deres effekt i dyremodeller sepsis. Betragtning af de sene og langvarig kinetik HMGB1 akkumulering i eksperimentelle sepsis 8, blev den første dosis af HMGB1 inhibitorer given 24 timer efter indtræden af sepsis - en tidspunkt, når mus udviklet klare tegn på sepsis, herunder sløvhed, diarré og piloerektion. Som vist i figur 4, forsinket og gentagen indgivelse af en større grøn te component, epigallocatechin-3-gallat (EGCG), begyndende 24 timer efter indtræden af sepsis, signifikant reddet mus mod letal sepsis 12. Selv når det gives oralt, EGCG stadig reddet mus mod letal sepsis, en væsentlig forøgelse dyr overlevelsesrater fra 16% til 44% 16. Det ville være vigtigt at bestemme, hvorvidt kombinatoriske terapi med flere urter komponenter kan opnå en betydelig bedre beskyttelse i dyremodeller af sepsis. Taget sammen viser disse eksperimentelle data valideres vores fremgangsmåde til screening af hidtil ukendte terapeutiske midler ved hjælp af en dyremodel for CLP-induceret sepsis.
5. Repræsentative resultater
Figur 1. Cirkulerende niveauer af surrogatmarkører er dramatisk højere septiske dyr nærmer døende tilstand. Balb / C-mus blev udsat for sepsis i CLP og overvåges for udvikling af tegn på sygdom. Ved ensent stadium sepsis (52 timer efter CLP) blev blod opsamlet fra 3 normale mus (-CLP), 3 septiske mus, der nærmer sig døende tilstand, og 3 septiske mus i den ikke-døende tilstand. Serum blev puljet fra hver gruppe, og analyseret for cytokinprofilen af antistof arrays. Bemærk den dramatiske forskel i de relative niveauer af flere surrogatmarkører mellem forskellige grupper. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tilladelse fra udgiveren.
Figur 2. Påvisning af lokale og systemiske cytokiner og chemokiner ved 48 timer efter CLP. Balb / C-mus blev udsat for sepsis i CLP og blod eller peritonealvæske blev høstet ved 48 timer post CLP. Relative niveauer af adskillige cytokiner og chemokiner i samlet serum eller peritoneal udskylningsvæske blev målt ved cytokin antistof arrays, og udtrykt som arbitrære enheder (AU). Som kontroller, blod og peritonealvæske SAmples blev opnået fra normale sunde dyr-CLP) uden laparotomi.
Figur 3. Urte komponent dosisafhængigt inhiberer endotoksin-induceret HMGB1 frigivelse i primære makrofagkulturer. Primære murine peritoneale makrofager blev stimuleret med LPS i fravær eller tilstedeværelse af naturlægemidler komponent (f.eks egcg, 15 uM). Ved 16 timer efter LPS-stimulering, blev niveauer af HMGB1 i dyrkningsmediet bestemmes ved Western blotting-analyse. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tilladelse fra udgiveren.
Figur 4. Naturlægemidler komponent reddet mus mod letal sepsis. Balb / C-mus blev udsat for letal sepsis ved CLP og naturlægemidler komponent (EGCG) blev administreret intraperitonealt i 24, +48, +72 timer efter indtræden af sepsis. Enimal overlevelse blev overvåget i op til to uger. Kaplan-Meier-fremgangsmåden blev anvendt til at sammenligne forskellene i dødelighed mellem grupper. * P <0,05 versus saltvand. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tilladelse fra udgiveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I laboratoriet har flere dyremodeller af sepsis blevet anvendt til at forstå patogenesen af sepsis for at udvikle potentielle nye terapier. Deres kliniske relevans er stadig genstand for debat, før den vellykkede oversættelse af dyreforsøg i kliniske ansøgninger om sepsis. Selv neutraliserende antistoffer mod tidlige cytokiner (f.eks TNF) var beskyttende i dyremodeller for bakteriæmi / endotoksæmi 17,18, de faktisk forværre overlevelse dyremodel af sepsis 19. På samme måde, de fleste anti-TNF-agenter ikke at vise effekt i kliniske forsøg med sepsis 20-22. Denne fiasko afspejler dels på kompleksiteten af de underliggende sygdomsfremkaldende mekanismer sepsis 23,24. Derudover kan det også skyldes faldgruber i udvælgelsen af: 1) gennemførlige terapeutiske mål eller lægemidler, 2) optimale doser og timing af narkotika, og 3) ikke-realistiske kliniske effektmål (såsom dødelighed) 25. Den nylige opdagelse af HMGB1 målretning urteekstrakt og / komponenter, herunder Danggui 26, grøn te 12,16, og Danshen 27 har givet vellykkede eksempler på prækliniske undersøgelser anvender dyremodeller af sepsis. Yderligere undersøgelser på dette område vil kaste mere lys over de molekylære Cascades ligger til grund for reguleringen af det medfødte immunforsvar, og give et fingerpeg for udvikling af lægemidler til behandling af forskellige inflammatoriske sygdomme. Når først om CLP i dit laboratorium, bør det tilstræbes at udføre kirurgi procedure så hurtigt og præcist som muligt at sikre reproducerbarhed, især når der anvendes et stort antal (30-40) af mus at sammenligne de overlevelsesprocenten mellem flere eksperimentelle grupper af et eksperiment. Anvendelse af langtidsvirkende anæstetika (f.eks ketamin og xylazin) tillader os at fuldføre CLP kirurgisk procedure på et stort antal mus i en relativ kort tid, og i mellemtiden bidrage tilfjerne potentielle dosis varians ofte sket med flygtige anæstetika. Overlevelsesrater og systemisk cytokin ophobning kan tages som tegn på vellykket udførelse af CLP procedure.
CLP-modellen har været meget anvendt i gnavere på grund af åbenlyse fordele i lave omkostninger, enkelhed af kirurgisk procedure, og omfattende patologiske, immunologiske og fysiologiske beskrivelser. Der er imidlertid en række begrænsninger af muse CLP model 1-3. For eksempel, som alle dyremodeller er en art forskel fremhævet ved, at cecal ligering uden punktering kan være dødelig i humane, men ikke i mus. Desuden, på grund af ringe størrelse af mus og dehydrering efter CLP, er det ofte vanskeligt at opnå serielle blodprøver for cytokin måling. Disse ulemper kan delvist overvindes ved at etablere CLP-modeller i større dyr 2,3,27,28. Desuden er det vigtigt at påpege, at dødelighed ogforløbet af peritonitis hos gnavere, er stort set bestemt af mængden af afføring ekstrudering, som påvirkes af profilet af den nål, der anvendes til at punktere coecum, antallet af punkteringer, det totale volumen af ligerede coecum og viskositeten af afføring 2, 3. Derudover kan dosis og hyppighed af indgivelse af antibiotika på et tidligt stadium af CLP også påvirke dødelighed. Endelig kan dyrekilder og boligmiljø også bidrage til variansen af dødeligheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AES og HW er medopfindere af patentansøgninger relateret til HMGB1 hæmmere (tanshinones) som potentielle terapeutiske midler til sepsis.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, National Institute of General Medical Science (R01GM063075) og National Center for Komplementær og Alternativ Medicin (R01AT05076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 25655-41-8 | |
| imipenem | Merck & Co., Inc. | 9882821 | |
| Ketamine HCl | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | 4821 | |
| Autoclip | BD Biosciences | 427631 | |
| 4-0 silk suture | Roboz Surgical Instruments Co. | SUT-15-2 | |
| Surflo I.V. Catheter | Terumo Medical Corp. | SR*OX2419CA | |
| RayBio mouse cytokine antibody array | RayBiotech, Inc. | AAM-CYT-3 | |
| Thioglycollate | BD Biosciences | 211716 |
References
- Wichterman, K. A., Baue, A. E., Chaudry, I. H. Sepsis and septic shock--a review of laboratory models and a proposal. J. Surg. Res. 29, 189-201 (1980).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Hubbard, W. J. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, Suppl . 1. 52-57 (2005).
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 4, 499-511 (2004).
- Baggiolini, M., Loetscher, P. Chemokines in inflammation and immunity. Immunol. Today. 21, 418-420 (2000).
- Balkwill, F. Cytokines--soluble factors in immune responses. Curr. Opin. Immunol. 1, 241-249 (1988).
- Wang, H. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science. 285, 248-251 (1999).
- Yang, H. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous high-mobility group box 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 296-301 (2004).
- Qin, S. Role of HMGB1 in apoptosis-mediated sepsis lethality. J. Exp. Med. 203, 1637-1642 (2006).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. J. Vis. Exp. (35), e1488 (2010).
- Rendon-Mitchell, B. IFN-gamma Induces High Mobility Group Box 1 Protein Release Partly Through a TNF-Dependent Mechanism. J. Immunol. 170, 3890-3897 (2003).
- Li, W. A Major Ingredient of Green Tea Rescues Mice from Lethal Sepsis Partly by Inhibiting HMGB1. PLoS ONE. 2, e1153 (2007).
- Osuchowski, M. F., Welch, K., Siddiqui, J., Remick, D. G. Circulating cytokine/inhibitor profiles reshape the understanding of the SIRS/CARS continuum in sepsis and predict mortality. J. Immunol. 177, 1967-1974 (2006).
- Heuer, J. G. Evaluation of protein C and other biomarkers as predictors of mortality in a rat cecal ligation and puncture model of sepsis. Crit. Care. Med. 32, 1570-1578 (2004).
- Bozza, F. A. Cytokine profiles as markers of disease severity in sepsis: a multiplex analysis. Crit. Care. 11, R49 (2007).
- Li, W. EGCG stimulates autophagy and reduces cytoplasmic HMGB1 levels in endotoxin-stimulated macrophages. Biochem. Pharmacol. 81, 1152-1163 (2011).
- Beutler, B., Milsark, I. W., Cerami, A. C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 229, 869-871 (1985).
- Tracey, K. J. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature. 330, 662-664 (1987).
- Eskandari, M. K. Anti-tumor necrosis factor antibody therapy fails to prevent lethality after cecal ligation and puncture or endotoxemia. J. Immunol. 148, 2724-2730 (1992).
- Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. The HA-1A Sepsis Study Group. N. Engl. J. Med. 324, 429-436 (1991).
- Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli. N. Engl. J. Med. 307, 1225-1230 (1982).
- Abraham, E. Efficacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor alpha in patients with sepsis syndrome. A randomized, controlled, double-blind, multicenter clinical trial. TNF-alpha MAb Sepsis Study Group. JAMA. 273, 934-941 (1995).
- Cohen, J. Adjunctive therapy in sepsis: a critical analysis of the clinical trial programme. Br. Med. Bull. 55, 212-225 (1999).
- Dellinger, R. P. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Crit. Care Med. 36, 296-327 (2008).
- Wang, H., Zhu, S., Zhou, R., Li, W., Sama, A. E. Therapeutic potential of HMGB1-targeting agents in sepsis. Expert. Rev. Mol. Med. 10, e32 (2008).
- Wang, H. The aqueous extract of a popular herbal nutrient supplement, Angelica sinensis, protects mice against lethal endotoxemia and sepsis. J. Nutr. 136, 360-365 (2006).
- Li, W. A cardiovascular drug rescues mice from lethal sepsis by selectively attenuating a late-acting proinflammatory mediator, high mobility group box 1. J. Immunol. 178, 3856-3864 (2007).
- Fukuyama, M. Mixed bacterial infection model of sepsis in rabbits and its application to evaluate superantigen-adsorbing device. Blood Purif. 23, 119-127 (2005).
