Summary
Sepsis refererer til en systemisk inflammatorisk respons syndrom som følge av en mikrobiell infeksjon, og kan være simulert av en kirurgisk teknikk kalt cecal ligation og punktering (CLP). Her beskriver vi en metode for å bruke CLP-indusert dyremodell for å skjerme medisinske urter for terapeutiske agenter.
Abstract
Sepsis refererer til en systemisk inflammatorisk respons syndrom som følge av mikrobiell infeksjon. Det har vært rutinemessig simulert i dyr av flere teknikker, inkludert tilførsel av eksogent bakteriell toksin (endotoxemia) eller bakterier (bakteriemi), samt kirurgisk perforering av cecum ved cecal ligation og punktering (CLP) 1-3. CLP tillater bakterier søl og fecal forurensing av bukhulen, etterligne menneskelige klinisk sykdom av perforert appendisitt eller divertikulitt. Alvorlighetsgraden av sepsis, som reflekteres av de eventuelle dødelighet, kan kontrolleres kirurgisk ved å variere størrelsen på nålen brukes for cecal punktere to. I dyr, induserer CLP lignende, bifasisk hemodynamiske kardiovaskulære, metabolske, og immunologiske responser som observeres under det kliniske forløpet av menneskelig sepsis tre. Dermed er CLP-modellen regnet som en av de mest klinisk relevante modeller for eksperimentell sepsis 1-3. </ P>
Ulike dyremodeller blitt brukt til å belyse de intrikate mekanismene bak patogenesen av eksperimentelle sepsis. Den dødelige konsekvensen av sepsis skyldes dels en overdreven opphopning av tidlige cytokiner (for eksempel TNF, IL-1 og IFN-γ) 4-6 og sent proinflammatoriske mediatorer (f.eks HMGB1) 7. Sammenlignet med tidlige proinflammatoriske cytokiner, sent langtidsvirkende meklere har en bredere terapeutisk vindu for kliniske applikasjoner. For eksempel, forsinket administrasjon av HMGB1-nøytraliserende antistoffer som begynner 24 timer etter CLP, likevel reddet mus fra letalitet 8,9, etablere HMGB1 som en sen formidler av dødelig sepsis. Funnet av HMGB1 som en sen-fungerende Mekleren har igangsatt et nytt felt med etterforskning for utvikling av sepsis terapier som bruker tradisjonell kinesisk urtemedisin. I denne artikkelen beskriver vi en prosedyre for CLP-indusert sepsis, og bruken i screening urtemedisin for HMGB1 målretting terapier.
Protocol
1. Etablering av Animal Model of Sepsis
- Mus er bedøvet med ketamin (75 mg / kg, intramuskulært, im) og xylazin (10 mg / kg, im), og plasseres i ryggleie.
- Fest føttene på musen med tape for å sikre en stabil posisjon.
- Rengjør magen med 3 vekslende scrubs av Betadine eller annen hud desinfeksjonsmiddel og alkohol. Deretter lage en 15 mm midtlinjen innsnitt for å avsløre cecum.
- Ligate cecum med en 4-0 silke sutur ved ca 5,0 mm fra cecal spissen, og deretter punktere ligated cecal stubben gang med en 22-gauge kanyle for å tillate ekstrudering av avføring.
- Cecum umiddelbart erstattet tilbake til sin normale intra-abdominale stilling.
- Lukk snitt nettstedet i to lag, ved først å lukke muskulaturen i magen med absorberbare suturer, og deretter lukker huden med sår klipp eller absorberbare suturer.
- Gjenopplive mus med 0,5 ml fysiologisk saltvann og en enkelt gjørese av imipenem (0,5 mg / mus, subkutant) umiddelbart etter ferdigstillelse av det kirurgiske inngrepet.
- Tilbake musen tilbake til et rent bur med fri tilgang til mat og vann.
- Ved ulike tidspunkter etter CLP, er urte-ekstrakt eller komponent administrert intraperitonealt.
- Animal overlevelse overvåkes for mer enn to uker. Døende dyr stiller vanskeligheter å stå, agonal puste, alvorlig muskelatrofi og ukontrollert blødning bør avlives av overdose karbondioksid innånding.
- Det er viktig å merke seg at sirkulerende cytokin nivåer er viktige parametre i disse studiene. Ulike smertestillende har vist seg å påvirke cytokin frigjøring og aktiviteter, og derfor har blitt bevisst unngått i postoperativ omsorg.
2. Utarbeidelse av urte-ekstrakt
- Pakk urter i varmt vann (85 ° C) for 1-4 timers (1 time for blader, og 4 timer for røtter).
- Sentrifuger vannet-såluble fraksjon (3300 g, 20 min, 4 ° C) for å fjerne uoppløselige partikler.
- Filtratet supernatanten brøkdel gjennom et 0,2 mikrometer filter.
- Den klare vannløselig filtratet fraksjon er så fraksjonert ved ultrafiltrasjon hjelp Centriprep YM-10 sentrifugalfilter (Katalognr. 4305, Millipore).
- Det resulterte lave (<10 kDa) og høy (> 10 kDa) molekylvekt fraksjoner (MWF) er undersøkt for HMGB1-hemmende aktiviteter ved hjelp macrophage kulturer.
- Intraperitoneal administrasjon av HMGB1-hemmende urte-ekstrakt eller komponenter på 24 timers innlegg CLP å evaluere deres terapeutiske effekt.
3. Peritoneal macrophage Isolasjon
- Thioglycollate kjøttkraft (4%, 2,0 ml) administreres intraperitonealt i normale mus.
- Primær peritoneal makrofager blir høstet på 3 dager som tidligere beskrevet 10.
- Makrofager er pre-kulturperler i DMEM medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) supplert med en0% fosterets storfe serum (FBS), 2 mmol / L glutamin, og 1% penicillin.
- Tilhenger makrofager blir varsomt vasket med, og kultivert i, serum-free OPTI-MEM jeg medium to timer før stimulering med bakteriell endotoksiner (lipopolysakkarid, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
- På 16 timer etter LPS stimulering, er nivåene av HMGB1 i kulturen medium bestemmes av Western blotting-analyse 11.
- Den relative Bandet Intensiteten ble kvantifisert ved hjelp av NIH bildet 1,59 programvare for å fastslå HMGB1 nivåer med referanse til standard kurver generert med renset HMGB1.
4. Representative Resultater
1. CLP induserer systemisk og lokal inflammasjon.
Innen et par timer med CLP kirurgi, dyr viser kliniske tegn på sepsis som inkluderer piloerection, sløvhet, huddling, og nedgang i mat og vann inntak. Dyr utvikle en alvorlig bukhinnebetennelse med påfølgende systemiskinfeksjon vanligvis dø innen 48-96 timer. Imidlertid kan selv alder, kjønn-og genetisk background-matchede dyr svare til CLP kirurgi i en identifiserbar måte i løpet av eksperimentelle sepsis. For eksempel, på 48 hr innlegg CLP, mens noen dyr kan ha nærmet døende tilstand (som definert i figur 1), mens andre kan ligge på et ikke-døende tilstand.
Omfattende undersøkelser av sirkulerende cytokiner avdekket dramatiske forskjeller i nivåer av flere cytokiner (f.eks IL-6, KC, MIP-2, og sTNFR1) mellom mus i døende og ikke-døende stater (Figur 1) 12. Spesielt har disse inflammatoriske mediatorer blitt klassifisert som surrogatmarkører av sepsis fordi deres sirkulerende nivåer er pålitelige prediktorer for dødelig utfall i eksperimentell 12-14 eller klinisk sepsis 15. I tillegg CLP også indusert lokale utslipp av ulike pro-og anti-inflammatoriske cytokiner og chemokines. For eksempel ved48 hr innlegg CLP, betydelige mengder cytokiner (f.eks IL-6) og chemokines (KC og MIP-2) kan fortsatt måles ikke bare systemisk i blodet, men også lokalt i peritoneal lavage fluid (figur 2).
2. Screening for HMGB1-hemmende urte-ekstrakt eller komponenter.
Ved hjelp macrophage kulturer, kunne vi vurdere kapasiteten til ulike urte ekstrakt eller komponenter i hemme endotoksin-indusert HMGB1 utgivelse (figur 3). I lys av sin kapasitet i hemme HMGB1 utgivelse, vi ytterligere utforsket deres effekt i dyremodeller sepsis. Gitt sene og langvarig kinetikk HMGB1 opphopning i eksperimentell sepsis 8, ble den første dosen av HMGB1 hemmere gitt 24 time etter utbruddet av sepsis - en tid punkt når mus utviklet klare tegn på sepsis inkludert sløvhet, diaré, og piloerection. Som vist i figur 4, forsinket og gjentatt administrasjon av en stor grønn te component, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), som begynner etter 24 timer etter utbruddet av sepsis, betydelig reddet mus fra dødelig sepsis 12. Selv når det gis oralt, EGCG likevel reddet mus fra dødelig sepsis, betydelig økt dyr overlevelse fra 16% til 44% 16. Det ville være viktig å avgjøre om kombinatoriske behandlingsformer med flere urte komponenter kan oppnå en betydelig bedre beskyttelse i dyremodeller av sepsis. Samlet utgjør disse eksperimentelle data validert vår tilnærming til skjermen nye terapeutiske midler ved å bruke en dyr modell av CLP-indusert sepsis.
5. Representative Resultater
Figur 1. Sirkulerende nivåer av surrogatmarkører er dramatisk høyere i septisk dyr nærmer døende tilstand. BALB / C mus ble utsatt for sepsis med CLP og overvåkes for utvikling av tegn på sykdom. På etsent stadium av sepsis (52 hr innlegget CLP), ble blod samlet fra 3 normale mus (-CLP), 3 septik mus nærmer seg døende staten, og 3 septik mus i den ikke-døende tilstand. Serum ble samlet fra hver gruppe, og analysert for cytokin profil ved antistoff arrays. Merk den dramatiske forskjellen i den relative nivåer av flere surrogatmarkører mellom ulike grupper. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tillatelse fra forlaget.
Figur 2. Påvisning av lokale og systemiske cytokiner og chemokines på 48 hr post CLP. BALB / C mus ble utsatt for sepsis med CLP og blod eller peritoneal væske ble høstet i 48 timer etter CLP. Relative nivåer av flere cytokiner og chemokines i sammenslåtte serum eller peritoneal lavage væske ble målt ved cytokin antistoff matriser, og uttrykt som vilkårlige enheter (AU). Som kontroller, blod og peritonealvæske SAmples ble innhentet fra friske dyr (-CLP) uten laparotomi.
Figur 3. Herbal komponent doseavhengig hemmet endotoksin-indusert HMGB1 utgivelse i primære macrophage kulturer. Primary murine peritoneale makrofager ble stimulert med LPS i fravær eller nærvær av urte komponent (f.eks EGCG, 15 mm). På 16 timer etter LPS stimulering, var nivået på HMGB1 i kulturen medium bestemmes av Western blotting-analyse. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tillatelse fra forlaget.
Figur 4. Herbal komponent reddet mus fra dødelig sepsis. BALB / C mus ble utsatt for dødelig sepsis med CLP, og urte komponent (EGCG) var intraperitonealt administreres ved 24, +48, +72 timer etter utbruddet av sepsis. Enimal overlevelse ble overvåket i opptil to uker. Kaplan-Meier metoden ble brukt for å sammenligne forskjeller i dødelighet mellom grupper. *, P <0,05 versus saltvann. Tilpasset fra doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med tillatelse fra forlaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I laboratoriet har flere dyremodeller av sepsis blitt ansatt for å forstå patogenesen av sepsis for å utvikle potensielle nye behandlingsformer. Deres kliniske relevansen er fortsatt gjenstand for debatt før den vellykkede oversettelse av dyrestudier til kliniske applikasjoner for sepsis. Selv nøytraliserende antistoffer mot tidlig cytokiner (f.eks TNF) var beskyttende i dyremodeller av bakteriemi / endotoxemia 17,18, de faktisk forverre overlevelse i dyremodell av sepsis 19. Tilsvarende mislyktes de fleste anti-TNF midler til å vise effekt i kliniske studier av sepsis 20-22. Denne feilen skyldes dels av kompleksiteten av de underliggende sykdomsfremkallende mekanismer av sepsis 23,24. I tillegg kan det også skyldes fallgruver i valg av: 1) gjennomførbare terapeutiske mål eller narkotika, 2) optimale doser og tidspunkt for narkotika, og 3) ikke-realistiske kliniske utfallsmål (for eksempel dødelighet) 25. Den nylige oppdagelsen av HMGB1 målretting urte-ekstrakt og / komponenter, inkludert 26 Danggui, grønn te 12,16, og Danshen 27 har gitt vellykkede eksempler på prekliniske etterforskning sysselsetter dyremodeller av sepsis. Videre undersøkelser i dette området vil kaste mer lys over de molekylære kaskader underliggende regulering av det medfødte immunforsvaret, og gi ledetråder for utvikling av legemiddelselskap for ulike inflammatoriske sykdommer. Når første etablering CLP i laboratoriet ditt, bør innsats gjøres for å utføre kirurgi prosedyren så raskt og nøyaktig som mulig for å sikre reproduserbarhet, spesielt når du bruker et stort antall (30-40) av mus for å sammenligne overlevelse mellom flere eksperimentelle grupper av et eksperiment. Bruk av langtidsvirkende bedøvelse (slik som ketamin og xylazin) tillater oss å fullføre CLP kirurgiske inngrep på et stort antall mus i en relativt kort tidsramme, og i mellomtiden bidra til åfjerne potensiell dose variansen ofte skjedde ved bruk av flyktige anestetika. Overlevelse og systemisk cytokin akkumulering kan tas som tegn på vellykkede utførelse av CLP prosedyre.
CLP-modellen har vært mye brukt i gnagere grunn av åpenbare fordeler i lav pris, enkelhet for kirurgisk inngrep, og omfattende patologiske, immunologiske, fysiologiske karakteristikk. Det finnes imidlertid en rekke begrensninger i mus CLP-modellen 1-3. For eksempel, som alle dyremodeller, er en art misforhold markert ved at cecal ligation uten punktering kan være dødelig i menneskelige, men ikke hos mus. Dessuten, på grunn av liten størrelse på mus og dehydrering etterkant CLP, er det ofte vanskelig å få tak serielle blodprøver for cytokin måling. Disse ulempene kan delvis overvinnes ved å etablere CLP modeller i større dyr 2,3,27,28. I tillegg er det viktig å påpeke at dødelighet ogfremdriften av peritonitt i gnagere er i stor grad bestemmes av mengden avføring ekstrudering, som er påvirket av måleren av nålen som brukes til å punktere cecum, antall punkteringer, det totale volumet av ligated cecum og viskositeten på avføring 2, 3. I tillegg kan dosen og hyppigheten av administrasjon av antibiotika på et tidlig stadium av CLP også påvirke dødeligheten. Endelig kan animalske kilder og bomiljø også bidra til variansen dødelighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AES og HW er co-oppfinnerne av patentsøknader relatert til HMGB1 hemmere (Tanshinones) som potensielle terapeutiske agenter for sepsis.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health, National Institute of General Medical Science (R01GM063075) og National Center of komplementær og alternativ medisin (R01AT05076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 25655-41-8 | |
| imipenem | Merck & Co., Inc. | 9882821 | |
| Ketamine HCl | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | 4821 | |
| Autoclip | BD Biosciences | 427631 | |
| 4-0 silk suture | Roboz Surgical Instruments Co. | SUT-15-2 | |
| Surflo I.V. Catheter | Terumo Medical Corp. | SR*OX2419CA | |
| RayBio mouse cytokine antibody array | RayBiotech, Inc. | AAM-CYT-3 | |
| Thioglycollate | BD Biosciences | 211716 |
References
- Wichterman, K. A., Baue, A. E., Chaudry, I. H. Sepsis and septic shock--a review of laboratory models and a proposal. J. Surg. Res. 29, 189-201 (1980).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Hubbard, W. J. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, Suppl . 1. 52-57 (2005).
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 4, 499-511 (2004).
- Baggiolini, M., Loetscher, P. Chemokines in inflammation and immunity. Immunol. Today. 21, 418-420 (2000).
- Balkwill, F. Cytokines--soluble factors in immune responses. Curr. Opin. Immunol. 1, 241-249 (1988).
- Wang, H. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science. 285, 248-251 (1999).
- Yang, H. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous high-mobility group box 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 296-301 (2004).
- Qin, S. Role of HMGB1 in apoptosis-mediated sepsis lethality. J. Exp. Med. 203, 1637-1642 (2006).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. J. Vis. Exp. (35), e1488 (2010).
- Rendon-Mitchell, B. IFN-gamma Induces High Mobility Group Box 1 Protein Release Partly Through a TNF-Dependent Mechanism. J. Immunol. 170, 3890-3897 (2003).
- Li, W. A Major Ingredient of Green Tea Rescues Mice from Lethal Sepsis Partly by Inhibiting HMGB1. PLoS ONE. 2, e1153 (2007).
- Osuchowski, M. F., Welch, K., Siddiqui, J., Remick, D. G. Circulating cytokine/inhibitor profiles reshape the understanding of the SIRS/CARS continuum in sepsis and predict mortality. J. Immunol. 177, 1967-1974 (2006).
- Heuer, J. G. Evaluation of protein C and other biomarkers as predictors of mortality in a rat cecal ligation and puncture model of sepsis. Crit. Care. Med. 32, 1570-1578 (2004).
- Bozza, F. A. Cytokine profiles as markers of disease severity in sepsis: a multiplex analysis. Crit. Care. 11, R49 (2007).
- Li, W. EGCG stimulates autophagy and reduces cytoplasmic HMGB1 levels in endotoxin-stimulated macrophages. Biochem. Pharmacol. 81, 1152-1163 (2011).
- Beutler, B., Milsark, I. W., Cerami, A. C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 229, 869-871 (1985).
- Tracey, K. J. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature. 330, 662-664 (1987).
- Eskandari, M. K. Anti-tumor necrosis factor antibody therapy fails to prevent lethality after cecal ligation and puncture or endotoxemia. J. Immunol. 148, 2724-2730 (1992).
- Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. The HA-1A Sepsis Study Group. N. Engl. J. Med. 324, 429-436 (1991).
- Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli. N. Engl. J. Med. 307, 1225-1230 (1982).
- Abraham, E. Efficacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor alpha in patients with sepsis syndrome. A randomized, controlled, double-blind, multicenter clinical trial. TNF-alpha MAb Sepsis Study Group. JAMA. 273, 934-941 (1995).
- Cohen, J. Adjunctive therapy in sepsis: a critical analysis of the clinical trial programme. Br. Med. Bull. 55, 212-225 (1999).
- Dellinger, R. P. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Crit. Care Med. 36, 296-327 (2008).
- Wang, H., Zhu, S., Zhou, R., Li, W., Sama, A. E. Therapeutic potential of HMGB1-targeting agents in sepsis. Expert. Rev. Mol. Med. 10, e32 (2008).
- Wang, H. The aqueous extract of a popular herbal nutrient supplement, Angelica sinensis, protects mice against lethal endotoxemia and sepsis. J. Nutr. 136, 360-365 (2006).
- Li, W. A cardiovascular drug rescues mice from lethal sepsis by selectively attenuating a late-acting proinflammatory mediator, high mobility group box 1. J. Immunol. 178, 3856-3864 (2007).
- Fukuyama, M. Mixed bacterial infection model of sepsis in rabbits and its application to evaluate superantigen-adsorbing device. Blood Purif. 23, 119-127 (2005).
