Summary
Sepsis bezieht sich auf eine systemische inflammatorische Reaktion, die sich aus einer mikrobiellen Infektion, und simuliert werden können durch eine Blinddarm-OP-Technik bezeichnet Ligatur und Punktion (CLP). Hier beschreiben wir eine Methode zur CLP-induzierte Tiermodell zu verwenden, um Heilkräuter für therapeutische Wirkstoffe zu screenen.
Abstract
Sepsis bezieht sich auf eine Systemic Inflammatory Response Syndrome, die aus einer mikrobiellen Infektion. Es wurde routinemäßig simulierten bei Tieren durch mehrere Techniken, einschließlich der Infusion von exogenem bakterielles Toxin (Endotoxämie) oder Bakterien (Bakteriämie), sowie chirurgische Perforation des Blinddarms von Blinddarm Ligation und Punktion (CLP) 1-3. CLP ermöglicht es Bakterien Verschütten und fäkalen Verunreinigung der Bauchhöhle, Nachahmung der menschlichen klinischen Erkrankung der perforierten Appendizitis oder Divertikulitis. Die Schwere der Sepsis, wie durch die eventuelle Sterblichkeit reflektiert, können chirurgisch durch Variieren der Größe der Nadel zum Blinddarm Punktion 2 verwendet gesteuert werden. Bei Tieren induziert CLP ähnlich, biphasische hämodynamischen kardiovaskulären, metabolischen und immunologischen Reaktionen, wie bei den klinischen Verlauf der menschlichen Sepsis 3 beobachtet. So wird die CLP-Modell als eines der klinisch relevanten experimentellen Modellen für Sepsis 3.1 berücksichtigt. </ P>
Verschiedene Tiermodelle wurden verwendet, um die komplizierten Mechanismen der Pathogenese der experimentellen Sepsis aufzuklären. Die tödliche Folge von Sepsis basiert teils auf einer übermäßigen Ansammlung von frühen Zytokine (wie TNF, IL-1 und IFN-γ) 4-6 und späten proinflammatorischen Mediatoren (zB HMGB1) 7. Im Vergleich mit früher proinflammatorische Zytokine, haben Ende wirkenden Mediatoren eine größere therapeutische Fenster für klinische Anwendungen. So verzögerte Gabe von HMGB1-neutralisierende Antikörper beginnend 24 Stunden nach CLP, noch zu retten Mäuse aus Letalität 8,9, Gründung HMGB1 als späte Vermittler von tödlichen Sepsis. Die Entdeckung von HMGB1 als spät wirkender Mediator hat ein neues Feld der Forschung für die Entwicklung einer Sepsis Therapien mit traditionellen chinesischen Kräutermedizin eingeleitet. In diesem Beitrag beschreiben wir ein Verfahren der CLP-induzierten Sepsis, und seine Verwendung in Screening Kräutermedizin für HMGB1-Targeting-Therapien.
Protocol
1. Gründung Tiermodell der Sepsis
- Mäuse sind mit Ketamin (75 mg / kg, intramuskulär, im) und Xylazin (10 mg / kg, im), und in Rückenlage.
- Befestigen der Füße der Maus mit Band, um eine stabile Position zu sichern.
- Reinigen Sie den Bauch mit 3 abwechselnd von Scrubs Betadin oder andere Haut Desinfektionsmittel und Alkohol. Dann, mit 15 mm Mittellinienschnitt bis zum Zökum aussetzen.
- Ligieren des Blinddarms mit einem 4-0 Seidenfaden bei ca. 5,0 mm von der Blinddarm-Spitze, und dann Punktion der ligierten cecal Stumpf einmal mit einer 22-Gauge-Nadel zur Extrusion von Stuhl zu ermöglichen.
- Der Blinddarm wird sofort wieder in seine normale Position intraabdominalen ersetzt.
- Schließen Sie die Inzisionsstelle in zwei Schichten, indem Sie zuerst Schließen der Muskulatur des Bauches mit resorbierbaren Fäden und dann Schließen der Haut mit Wundklammern oder nicht resorbierbaren Fäden.
- Resuscitate Maus mit 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung und eine einzelne tunsich von Imipenem (0,5 mg / Maus, subkutan) unmittelbar nach Beendigung des chirurgischen Eingriffs.
- Kehren Sie die Maustaste wieder auf einem sauberen Käfig mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
- Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der CLP wird pflanzliche Extrakt oder eine Komponente intraperitoneal verabreicht.
- Das Überleben der Tiere wird für mehr als zwei Wochen überwacht. Sterbende Tiere ausstellen Schwierigkeiten zu stehen, agonale Atmung, schwere Muskelatrophie und unkontrollierte Blutungen sollten durch Überdosierung Kohlendioxidinhalation eingeschläfert werden.
- Es ist wichtig zu beachten, dass zirkulierende Cytokin Ebenen sind in diesen Studien. Verschiedene Analgetika hat sich gezeigt, Zytokinfreisetzung und Aktivitäten beeinflussen, und deshalb wurden absichtlich in der postoperativen Betreuung vermieden werden.
2. Vorbereitung der Kräuter-Extrakt
- Auszug Kräuter in heißem Wasser (85 ° C) für 1-4 Std. (1 Std. für Blätter und Wurzeln für 4 Std.).
- Zentrifugieren Sie die Wasser-soUnlöslich Fraktion (3300 g, 20 min, 4 ° C) zur Entfernung unlöslicher Teilchen.
- Filtrat der Überstand Fraktion durch eine 0,2 um-Filter.
- Die klare wasserlösliche Filtratfraktion wird dann fraktioniert durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centriprep YM-10 Filterzentrifuge (Katalog-Nr. 4305, Millipore).
- Das führte zu niedrig (<10 kDa) und hoch (> 10 kDa) Molekulargewichtsfraktionen (MWF) für HMGB1-hemmenden Aktivitäten mit Makrophagen-Kulturen gescreent werden.
- Intraperitoneale Gabe von HMGB1-hemmenden Kräuterextrakt oder Komponenten bei 24 Stunden nach CLP zu evaluieren ihre therapeutische Wirksamkeit.
3. Peritonealen Makrophagen Isolierung
- Thioglycolat-Brühe (4%, 2,0 ml) intraperitoneal in normale Mäuse verabreicht.
- Primäre Peritonealmakrophagen werden zu 3 Tage früher als 10 beschrieben geerntet.
- Makrophagen sind vorkultiviert in DMEM-Medium (Gibco BRL, Grand Island, NY), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mmol / l Glutamin und 1% Penicillin.
- Adhärente Makrophagen vorsichtig mit gewaschen und kultiviert, serumfreien OPTI-MEM I Medium zwei Stunden vor der Stimulation mit bakteriellem Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
- 16 Stunden nach der LPS-Stimulation, die Spiegel des HMGB1 in dem Kulturmedium durch Western-Blot-Analyse 11 bestimmt.
- Die relative Bandenintensität wurde unter Verwendung des NIH-Image-Software 1,59 HMGB1 Ebenen mit Bezug auf Standardkurven mit gereinigtem HMGB1 erzeugt bestimmen quantifiziert.
4. Repräsentative Ergebnisse
1. CLP induziert systemische und lokale Entzündung.
Innerhalb von wenigen Stunden von CLP Chirurgie, zeigen Tiere klinische Symptome einer Sepsis, die Piloerektion, Lethargie, kauern, und die Abnahme der Futter-und Wasseraufnahme sind. Tiere entwickeln eine schwere Bauchfellentzündung mit konsekutiver systemischer96 Stunden - Infektion in der Regel innerhalb von 48 sterben. Allerdings kann auch das Alter, das Geschlecht und genetischen Hintergrund abgestimmt Tieren reagieren Operation in einer unterscheidbaren Weise im Verlauf der experimentellen Sepsis CLP. Zum Beispiel bei 48 Stunden nach der CLP, während einige Tiere dem schlechten Zustand (wie in 1 definiert sind) Ansätze möglich sind, können andere in einem Nicht-moribunde Zustand bleiben.
Umfassende Erhebungen über zirkulierende Zytokine zeigten dramatische Unterschiede bei den verschiedenen Zytokinen (zB IL-6, KC, MIP-2, und sTNFR1) zwischen Mäusen in den maroden und nicht-sterbenden Staaten (Abbildung 1) 12. Bemerkenswerterweise haben diese Entzündungsmediatoren als Surrogat-Marker der Sepsis klassifiziert worden, weil ihre Blutspiegel zuverlässige Prädiktoren für tödlichem Ausgang sind in der experimentellen oder klinischen Sepsis 12-14 15. Darüber hinaus CLP auch lokale Freisetzung von verschiedenen pro-und anti-inflammatorische Zytokine und Chemokine induziert. Zum Beispiel bei der48 h nach der CLP, signifikante Mengen von Cytokinen (zB IL-6) und Chemokine (KC und MIP-2) noch nicht nur systemisch im Blut gemessen werden, sondern auch lokal im Peritoneallavage Fluid (2).
2. Screening für HMGB1-hemmenden Kräuterextrakt oder Komponenten.
Mit Makrophagen-Kulturen, konnten wir die Kapazitäten der verschiedenen Kräuterextrakt oder Komponenten bei der Hemmung der Endotoxin-induzierten Freisetzung HMGB1 (Abbildung 3) zu bewerten. Angesichts ihrer Kapazität bei der Hemmung der Freisetzung HMGB1 wir weiter erforscht ihre Wirksamkeit in Tiermodellen Sepsis. Einem Zeitpunkt, wenn Mäuse deutliche Anzeichen einer Sepsis entwickelt einschließlich Lethargie, Durchfall und Piloerektion - Angesichts der späten und verlängerte Kinetik der Akkumulation HMGB1 in der experimentellen Sepsis 8, wurde die erste Dosis von HMGB1-Hemmern 24 Stunden nach dem Auftreten der Sepsis gegeben. Wie in 4 gezeigt ist, verzögert und wiederholte Verabreichung einer großen grünen Tee cls Bestandteil, Epigallocatechin-3-Gallat (EGCG), beginnend bei 24 h nach Beginn einer Sepsis, deutlich gerettet Mäuse vor tödlichen Sepsis 12. Selbst wenn es oral verabreicht, EGCG noch zu retten Mäuse vor tödlichen Sepsis, die deutliche Steigerung Tier-Überlebensraten von 16% auf 44% 16. Es wäre wichtig, um festzustellen, ob kombinatorische Therapien mit verschiedenen pflanzlichen Komponenten konnte eine signifikante besseren Schutz im Tiermodell der Sepsis zu erzielen. Zusammengenommen sind diese experimentellen Daten unserer Herangehensweise an Bildschirm neuartigen therapeutischen Wirkstoffen mit einem Tiermodell der CLP-induzierten Sepsis validiert.
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Zirkulierenden Spiegel Surrogatmarker sind dramatisch höher in septischen Tieren nähern moribunden Zustand. Balb / C-Mäuse wurden zu einer Sepsis durch CLP unterworfen und überwacht werden für die Entwicklung von Anzeichen einer Krankheit. An einspäten Stadium der Sepsis (52 Stunden nach der CLP) wurde Blut aus 3 normalen Mäusen (-CLP), 3 septischen Tieren nähert dem schlechten Zustand, und 3 septischen Tiere in der nicht-moribunde Zustand gesammelt. Das Serum wurde aus jeder Gruppe vereinigt, und im Hinblick auf die Zytokin-Profils von Antikörper-Arrays. Notieren Sie sich den dramatischen Unterschied in der relativen Pegel von mehreren Surrogat-Marker zwischen verschiedenen Gruppen. Übernommen aus doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 mit Erlaubnis des Herausgebers.
Abbildung 2. Nachweis von lokalen und systemischen Cytokine und Chemokine bei 48 Stunden nach CLP. Balb / C-Mäuse wurden von Sepsis durch CLP unterzogen, und Blut oder Peritonealflüssigkeit wurden nach 48 h nach CLP geerntet. Relative Ebenen mehrerer Zytokine und Chemokine im gepoolten Serum oder peritoneale Lavage wurden von Zytokin-Antikörper-Arrays gemessen und ausgedrückt in willkürlichen Einheiten (AU). Als Kontrollen, Blut-und Peritonealflüssigkeit SAmples wurden aus normalen gesunden Tieren (-CLP) ohne Laparotomie erhalten.
Abbildung 3. Herbal Komponente dosisabhängig gehemmt Endotoxin-induzierten Freisetzung HMGB1 in primären Makrophagen-Kulturen. Primären murinen peritonealen Makrophagen mit LPS in Abwesenheit oder Anwesenheit von Kräuter-Komponente (zB EGCG, 15 pM) stimuliert wurden. 16 Stunden nach der LPS-Stimulation wurden Ebenen von HMGB1 in dem Kulturmedium durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Übernommen aus doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 mit Erlaubnis des Herausgebers.
Abbildung 4. Herbal Komponente gerettet Mäuse aus tödliche Sepsis. Balb / C-Mäuse wurden zu tödlichen Sepsis durch CLP unterzogen und Kräuter-Komponente (EGCG) wurde intraperitoneal bei +24 verabreicht wird, posten 48, 72 Stunden das Auftreten von Sepsis. Einimal Überleben wurde für bis zu zwei Wochen beobachtet. Die Kaplan-Meier-Methode wurde verwendet, um die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen den Gruppen zu vergleichen. *, P <0,05 im Vergleich zu Kochsalzlösung. Übernommen aus doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 mit Erlaubnis des Herausgebers.
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Discussion
Im Labor wurden verschiedene Tiermodelle der Sepsis eingesetzt worden, um die Pathogenese der Sepsis zu verstehen, um mögliche neue Therapien zu entwickeln. Deren klinische Relevanz bleibt ein Thema der Debatte vor der gelungene Übersetzung von Tierversuchen in klinische Anwendungen für die Sepsis. Obwohl neutralisierende Antikörper gegen den frühen Zytokinen (zB TNF) waren Schutzschicht in Tiermodellen von Bakteriämie / Endotoxämie 17,18 sie tatsächlich verschlechtern Überleben im Tiermodell der Sepsis 19. Ebenso scheiterte die meisten TNF-Blockern, um die Wirksamkeit in klinischen Studien der Sepsis 20-22 zeigen. Dieser Fehler ist zum Teil von der Komplexität der zugrunde liegenden pathogenen Mechanismen der Sepsis 23,24. Darüber hinaus kann es auch darauf zurückzuführen sein, Fallstricke bei der Auswahl: 1) machbar therapeutische Ziele oder Drogen; 2) optimale Dosis und Zeitpunkt der Drogen, und 3) nicht-realistischen klinischen Endpunkte (z. B. Sterblichkeit) 25. Die jüngste Entdeckung von HMGB1-Targeting-Kräuterextrakt und / Komponenten, einschließlich Danggui 26, Grüner Tee 12,16, und 27 hat danshen erfolgreiche Beispiele von präklinischen Untersuchung beschäftigt Tiermodellen der Sepsis zur Verfügung gestellt. Weitere Untersuchungen in diesem Bereich wird mehr Licht auf die zugrunde liegenden molekularen Kaskaden Regelung der angeborenen Immunantwort zu vergießen, und liefern Anhaltspunkte für die Entwicklung von Therapeutika für verschiedene entzündliche Erkrankungen. Bei der erstmaligen CLP in Ihrem Labor, sollten Anstrengungen unternommen werden, um die Chirurgie Verfahren so schnell und so genau wie möglich, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten führen, insbesondere bei der Verwendung einer großen Zahl (30-40) von Mäusen, um die Überlebensraten zwischen verschiedenen experimentellen Gruppen vergleichen ein Experiment. Der Einsatz von lang wirksamen Anästhetika (wie Ketamin und Xylazin) ermöglicht es uns, CLP chirurgischen Eingriff auf einer großen Anzahl von Mäusen komplett in einem relativ kurzen Zeitrahmen, und in der Zwischenzeit zu helfenentfernen Potenzial Dosis Varianz oft aufgetreten bei der Verwendung volatiler Anästhetika. Die Überlebensraten und systemische Zytokin-Anreicherung kann als Zeichen der erfolgreichen Durchführung der CLP-Verfahren gefasst werden.
CLP-Modell wurde in großem Stil bei Nagern aufgrund der offensichtlichen Vorteile in niedrige Kosten, Einfachheit des chirurgischen Eingriffs und umfangreichen pathologischen, immunologischen, physiologischen Charakterisierung verwendet. Es gibt jedoch eine Reihe von Einschränkungen der Maus CLP Modell 1-3. Zum Beispiel, wie alle Tiermodellen, wird eine Art Unterschied, daß Blinddarm Ligation ohne Punktion kann in humanen, aber nicht in Mäusen tödlich hervorgehoben. Da außerdem der geringen Größe der Maus und Dehydratisierung nachfolgenden CLP, ist es oft schwierig, serielle Blutproben für die Cytokin-Messung zu erhalten. Diese Nachteile lassen sich teilweise durch die Schaffung CLP-Modelle in größeren Tieren 2,3,27,28 überwunden werden. Darüber hinaus ist es wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Sterblichkeitsraten undder Fortschritt der Peritonitis bei Nagetieren werden weitgehend durch die Menge an Stuhl Extrusion, die durch das Meßgerät der Nadel verwendet, um Schmiermittel den Blinddarm, die Anzahl der Löcher beeinflusst bestimmt werden, das Gesamtvolumen der ligierten Caecum und der Viskosität des Stuhls 2, 3. Darüber hinaus kann die Dosis und Häufigkeit der Verabreichung von Antibiotika in einem frühen Stadium des CLP auch Auswirkungen auf die Sterblichkeit. Schließlich können tierischen Quellen und Wohnumfeld auch für die Varianz der Sterblichkeitsraten beitragen.
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Disclosures
AES und HW sind Miterfinder der Patentanmeldungen im Zusammenhang mit HMGB1-Inhibitoren (tanshinones) als potenzielle Therapeutika für die Sepsis.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health, National Institute of General Medical Science (R01GM063075) und das Nationale Zentrum für Komplementär-und Alternativmedizin (R01AT05076) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 25655-41-8 | |
| imipenem | Merck & Co., Inc. | 9882821 | |
| Ketamine HCl | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | 4821 | |
| Autoclip | BD Biosciences | 427631 | |
| 4-0 silk suture | Roboz Surgical Instruments Co. | SUT-15-2 | |
| Surflo I.V. Catheter | Terumo Medical Corp. | SR*OX2419CA | |
| RayBio mouse cytokine antibody array | RayBiotech, Inc. | AAM-CYT-3 | |
| Thioglycollate | BD Biosciences | 211716 |
References
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