Summary
Сепсис относится к синдрома системного воспалительного ответа в результате микробной инфекции, и могут быть смоделированы с помощью хирургической техникой слепой кишки называется перевязка и прокол (CLP). Здесь мы опишем метод использовать CLP-индуцированной животной модели для скрининга лекарственных трав для терапевтических агентов.
Abstract
Сепсис относится к синдрома системного воспалительного ответа в результате микробной инфекции. Это было обычно моделируются на животных несколько методов, в том числе вливания экзогенного бактериального токсина (эндотоксемии) или бактерии (бактериемия), а также хирургическое перфорация слепой от слепой кишки перевязки и пункции (CLP) 1-3. CLP позволяет бактериям и разлива фекальных загрязнений в брюшную полость, имитируя человеческий клинической болезни перфорированный аппендицит или дивертикулит. Тяжесть сепсиса, как это отражено в возможной смертности, можно контролировать хирургическим путем изменения размера иглы для прокола слепой кишки 2. У животных, CLP вызывает подобное, двухфазный гемодинамики сердечно-сосудистой системы, метаболических и иммунологических реакций, как наблюдалось в течение клинического течения сепсиса человека 3. Таким образом, модель CLP считается одним из наиболее клинически значимых моделей для экспериментального сепсиса 1-3. </ P>
Различные модели животных были использованы для выяснения сложных механизмов, лежащих в основе патогенеза экспериментального сепсиса. Смертельным следствием сепсиса связано отчасти с чрезмерным накоплением ранних цитокинов (таких как ФНО, ИЛ-1 и ИФН-γ) 4-6 и поздно провоспалительных медиаторов (например, HMGB1) 7. По сравнению с ранними провоспалительных цитокинов, в конце действия посредники имеют более широкое терапевтическое окно для клинического применения. Например, задержка администрации HMGB1-нейтрализующих антител начинается через 24 часа после CLP-прежнему спасли мышей от летальность 8,9, создание HMGB1 в конце посредником летальный сепсис. Открытие HMGB1 в конце действия посредника инициировал новое поле исследований для развития сепсиса терапии с использованием традиционной китайской травяной медицины. В этой статье мы опишем процедуру CLP-индуцированной сепсисом, и его использование при проверке лекарственных трав для HMGB1-планирование лечения.
Protocol
1. Создание животной модели сепсиса
- Мыши наркоз с кетамином (75 мг / кг, внутримышечно, мкм) и ксилазина (10 мг / кг, внутримышечно), и помещается в положении лежа.
- Зафиксируйте ноги мышь с лентой для обеспечения устойчивого положения.
- Очистите живот с 3 переменного скрабы из бетадин или другими дезинфицирующими кожи и алкоголя. Затем сделать 15 мм средней линии разреза, чтобы разоблачить слепой кишки.
- Перевязывать слепой кишки с 4-0 шва шелком примерно 5,0 мм от кончика слепой кишки, а затем прокол перевязанной слепой кишки пень раз с 22-иглу, чтобы экструзии стула.
- Слепой немедленно заменен обратно в нормальное внутрибрюшное положение.
- Закройте разреза в два слоя, сначала закрыв мускулатуры живота с рассасывающиеся швы, а затем закрыть рану кожи или клипов нерассасывающиеся швов.
- Реанимацию мышь с 0,5 мл физиологического раствора и одного этоготаковой имипенема (0,5 мг / мышь, подкожно) сразу же после завершения операции.
- Вернуться мышь обратно в чистую клетку со свободным доступом к пище и воде.
- В разное время CLP сообщение пункты, растительный экстракт или компонент вводят внутрибрюшинно.
- Животное выживания контролируется в течение более двух недель. Умирающий животных выставке трудности стоять, предсмертное дыхание, сильная мышечная атрофия и неконтролируемые кровотечения следует усыплять от передозировки вдыхание двуокиси углерода.
- Важно отметить, что циркулирующие уровни цитокинов являются важными параметрами, в этих исследованиях. Различные обезболивающие было показано, что влияет на высвобождение цитокинов и деятельности, и, следовательно, были намеренно избегал в послеоперационном периоде.
2. Подготовка Растительные экстракты
- Извлечение травы в горячей воде (85 ° C) в течение 1-4 часов (1 час на листьях, и 4 часа на корни).
- Центрифуга с водой такluble фракции (3300 г, 20 мин, 4 ° C) для удаления нерастворимых частиц.
- Фильтрат фракции супернатанта через 0,2 мкм фильтр.
- Ясно водорастворимой фракции фильтрата затем фракционировали ультрафильтрацией использованием Centriprep YM-10 центробежный фильтр (не каталог. 4305, Millipore).
- Результатом низкой (<10 кДа) и высоких (> 10 кДа) молекулярного веса (MWF) проверяются на HMGB1 ингибиторов деятельности с использованием макрофагов культур.
- Внутрибрюшинное администрации HMGB1 ингибирующих растительный экстракт или компонентов на 24 часа после CLP, чтобы оценить их терапевтическую эффективность.
3. Выделение макрофагов перитонеального
- Тиогликолята бульон (4%, 2,0 мл) вводят внутрибрюшинно в нормальных мышей.
- Первичная макрофагов собирают на 3 дня, как описано выше 10.
- Макрофаги предварительно культивировали в DMEM среде (Gibco BRL, Grand Island, NY) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 ммоль / л глутамина, и 1% пенициллина.
- Приверженец макрофагов мягко промывают и культивируют в, бессывороточной OPTI-я среда MEM два часа до начала стимуляции бактериального эндотоксина (липополисахарида, ЛПС, E.coli 0111: В4, Sigma-Aldrich).
- В 16 часов после стимуляции LPS, уровни HMGB1 в культуральной среде определяется западных промокательной анализ 11.
- Относительная интенсивность группа была количественно с помощью образа NIH 1,59 программное обеспечение для определения уровня HMGB1 со ссылкой на стандартные кривые, созданные с очищенной HMGB1.
4. Представитель Результаты
1. CLP вызывает системного и местного воспаления.
В течение нескольких часов операции CLP, животные проявляют клинические признаки сепсиса, которые включают пилоэрекции, вялость, сбившись, и снижение потребления пищи и воды. Животные развивается тяжелый перитонит с последовательной системнойинфекции обычно умирают в течение 48 - 96 часов. Тем не менее, даже по возрасту, полу, и генетический фон подобранные животные могут реагировать на CLP хирургии в различимы образом, в ходе экспериментального сепсиса. Например, в 48 часов после CLP, а некоторые животные, возможно, подошел к умирающим государством (как показано на рис 1), другие могут оставаться без умирающего государства.
Справочники циркулирующих цитокинов выявлены значительные различия в уровнях ряда цитокинов (например, IL-6, КС, MIP-2, и sTNFR1) между мышами в умирающую и не умирающего государства (рис. 1) 12. Примечательно, что эти медиаторы воспаления были классифицированы в качестве суррогатных маркеров сепсиса, потому что их уровень циркулирующих служат надежными предикторами летального исхода в экспериментальных или клинических 12-14 сепсис 15. Кроме того, CLP также индуцируется местный выпуск различных про-и противовоспалительных цитокинов и хемокинов. Например, на48 часов после CLP, значительное количество цитокинов (например, IL-6) и хемокинов (KC и MIP-2) все еще можно измерять не только системно в крови, но и на местном уровне в перитонеальной жидкости лаважа (рис. 2).
2. Скрининг на HMGB1 ингибирующих растительный экстракт или компонентов.
Использование макрофагов культур, мы смогли оценить возможности различных растительных экстрактов и компонентов для ингибирования эндотоксин-индуцированный выброс HMGB1 (рис. 3). В свете их потенциала в подавлении выпуск HMGB1, мы дополнительно изучить их эффективность при сепсисе животных моделях. Учитывая поздний и длительной кинетики HMGB1 накопления в экспериментальном сепсисе 8, первая доза HMGB1 ингибиторов было дано 24 часа после начала сепсиса - момент времени, когда мышей разработаны четкие признаки сепсиса, включая сонливость, понос и пилоэрекции. Как показано на рисунке 4, задерживается и повторного введения основной зеленый чай сomponent, эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG), начиная с 24 часов после начала сепсиса, значительно спасли мышей от смертельных сепсис 12. Даже когда в устной форме, EGCG, еще спасли мышей от смертельных сепсиса, значительно повышая выживаемость животных ставки с 16% до 44% 16. Было бы важно для определения комбинационной терапии с несколько травяных компонентов можно добиться значительного улучшения защиты на животных моделях сепсиса. Взятые вместе, эти экспериментальные данные подтверждены наш подход к экрану новых терапевтических агентов с помощью животной модели CLP-индуцированной сепсисом.
5. Представитель Результаты
Рисунок 1. Циркулирующие уровни суррогатных маркеров значительно выше в септик животные приближаются умирающего государства. BALB / C мышей подвергали сепсис от CLP и контроль за развитием признаков болезни. Впоздней стадии сепсиса (52 часов после CLP), кровь была собрана от 3 нормальных мышей (-CLP), 3 септический мышей приближается к умирающим государством, и 3-септических мышей в не умирающий государства. Сыворотку объединения из каждой группы, а также анализировали на цитокиновой профиль антител массивов. Обратите внимание на резкое различие в относительных уровней ряда суррогатных маркеров между различными группами. Взято из DOI: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 с разрешение от издателя.
Рисунок 2. Выявление местных и системных цитокинов и хемокинов в 48 часов после CLP. BALB / C мышей подвергали сепсис по CLP и крови или перитонеальной жидкости были собраны в 48 часов после CLP. Относительный уровень ряда цитокинов и хемокинов в пробах сыворотки или перитонеального лаважа жидкости были измерены массивов цитокинов антитела, и выражается в условных единицах (а.е.). В качестве контроля, крови и перитонеальной жидкости SAmples были получены от нормальных здоровых животных (-CLP) без лапаротомии.
Рисунок 3. Травяные компоненты дозозависимо ингибирует эндотоксин-индуцированное HMGB1 выпуска в первичных культурах макрофагов. Первичная перитонеальных макрофагов стимулировали LPS в отсутствии или наличии растительных компонентов (например, EGCG, 15 мкм). В 16 часов после стимуляции LPS, уровни HMGB1 в культуральной среде определяли западных промокательной анализа. Взято из DOI: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 с разрешение от издателя.
Рисунок 4. Травяные компоненты спасли мышей от смертельных сепсиса. BALB / C мышей подвергали смертельной сепсис от CLP, а также травяные компоненты (EGCG) вводили внутрибрюшинно в +24, +48, +72 часов после начала сепсиса.мальные выживание следили в течение двух недель. Kaplan-Meier метод был использован для сравнения различий в уровне смертности между группами. * Р <0,05 в сравнении с физиологическим раствором. Взято из DOI: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 с разрешение от издателя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В лаборатории несколько животных моделях сепсиса были использованы для понимания патогенеза сепсиса, для того, чтобы развивать потенциал терапии романа. Их клиническое значение остается предметом дискуссий до успешного воплощения в исследованиях на животных в клинической практике для сепсиса. Несмотря на то, нейтрализующих антител против ранних цитокинов (например, фактор некроза опухоли) были защитные на животных моделях бактериемия / 17,18 эндотоксемии, они на самом деле ухудшает выживание в животной модели сепсис 19. Кроме того, большинство анти-ФНО агенты не смогли показать эффективность в клинических испытаниях при сепсисе 20-22. Этот отказ отражает частично от сложности основные патогенетические механизмы развития сепсиса 23,24. Кроме того, он также может быть связано с подводных камней в выборе: 1) возможно терапевтических целей или наркотиков; 2) оптимальные дозы и сроки наркотиков, и 3) без реальных клинических меры результата (например, смертность) 25. Недавнее открытие HMGB1 таргетирования растительный экстракт и / компонентов, в том числе Danggui 26, Зеленый чай, 12,16, 27 и Danshen обеспечил успешные примеры доклинических расследование использования животных моделях сепсиса. Дальнейшие исследования в этой области будет пролить свет на молекулярные каскады, лежащие в основе регулирования врожденного иммунного ответа, и дать ключи для развития терапии различных воспалительных заболеваний. При первом создании CLP в вашей лаборатории, следует предпринять усилия для выполнения операции процедуру максимально быстро и точно, как можно обеспечить воспроизводимость результатов, особенно при использовании большого количества (30-40) мышей для сравнения выживаемости между несколькими экспериментальными группами эксперимента. Использование пролонгированного действия анестетиков (например, кетамин и ксилазина) позволяет завершить CLP хирургическое вмешательство на большое количество мышей в относительно короткие сроки, а тем временем помочьустранить возможные отклонения дозы часто происходит при использовании летучих анестетиков. Выживаемость и системное накопление цитокинов можно рассматривать как признаки успешного выполнения процедуры CLP.
CLP модель широко используется у грызунов из-за очевидного преимущества в низкой стоимости, простоте хирургическое вмешательство, а также обширные патологические, иммунологических, физиологических характеристик. Тем не менее, существует ряд ограничений мыши CLP модель 1-3. Например, как и все модели на животных, виды неравенства свидетельствует тот факт, что перевязка слепой кишки без прокола может быть смертельным в человека, но не у мышей. Кроме того, из-за небольших размеров мыши и обезвоживания после CLP, часто бывает трудно получить серийные образцы крови для измерения цитокинов. Эти недостатки могут быть частично преодолены путем создания моделей CLP в более крупных животных 2,3,27,28. Кроме того, важно отметить, что смертность ипрогресс перитонита у грызунов во многом определяется количеством стула экструзии, которые пострадали от датчика иглы используются для прокола слепой кишки, количество проколов, общий объем перевязанной слепой кишки и вязкости стул 2, 3. Кроме того, дозы и частота приема антибиотиков на ранней стадии CLP также может повлиять на уровень смертности. Наконец, животного происхождения и жилищные условия, также могут способствовать дисперсии смертности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AES и HW являются со-изобретателями патентных заявок, связанных с HMGB1 ингибиторов (tanshinones) как потенциальные терапевтические агенты для сепсиса.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здравоохранения, Национальный институт общей медицинских наук (R01GM063075) и Национального центра дополнительной и альтернативной медицины (R01AT05076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 25655-41-8 | |
| imipenem | Merck & Co., Inc. | 9882821 | |
| Ketamine HCl | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | 4821 | |
| Autoclip | BD Biosciences | 427631 | |
| 4-0 silk suture | Roboz Surgical Instruments Co. | SUT-15-2 | |
| Surflo I.V. Catheter | Terumo Medical Corp. | SR*OX2419CA | |
| RayBio mouse cytokine antibody array | RayBiotech, Inc. | AAM-CYT-3 | |
| Thioglycollate | BD Biosciences | 211716 |
References
- Wichterman, K. A., Baue, A. E., Chaudry, I. H. Sepsis and septic shock--a review of laboratory models and a proposal. J. Surg. Res. 29, 189-201 (1980).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Hubbard, W. J. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, Suppl . 1. 52-57 (2005).
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 4, 499-511 (2004).
- Baggiolini, M., Loetscher, P. Chemokines in inflammation and immunity. Immunol. Today. 21, 418-420 (2000).
- Balkwill, F. Cytokines--soluble factors in immune responses. Curr. Opin. Immunol. 1, 241-249 (1988).
- Wang, H. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science. 285, 248-251 (1999).
- Yang, H. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous high-mobility group box 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 296-301 (2004).
- Qin, S. Role of HMGB1 in apoptosis-mediated sepsis lethality. J. Exp. Med. 203, 1637-1642 (2006).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. J. Vis. Exp. (35), e1488 (2010).
- Rendon-Mitchell, B. IFN-gamma Induces High Mobility Group Box 1 Protein Release Partly Through a TNF-Dependent Mechanism. J. Immunol. 170, 3890-3897 (2003).
- Li, W. A Major Ingredient of Green Tea Rescues Mice from Lethal Sepsis Partly by Inhibiting HMGB1. PLoS ONE. 2, e1153 (2007).
- Osuchowski, M. F., Welch, K., Siddiqui, J., Remick, D. G. Circulating cytokine/inhibitor profiles reshape the understanding of the SIRS/CARS continuum in sepsis and predict mortality. J. Immunol. 177, 1967-1974 (2006).
- Heuer, J. G. Evaluation of protein C and other biomarkers as predictors of mortality in a rat cecal ligation and puncture model of sepsis. Crit. Care. Med. 32, 1570-1578 (2004).
- Bozza, F. A. Cytokine profiles as markers of disease severity in sepsis: a multiplex analysis. Crit. Care. 11, R49 (2007).
- Li, W. EGCG stimulates autophagy and reduces cytoplasmic HMGB1 levels in endotoxin-stimulated macrophages. Biochem. Pharmacol. 81, 1152-1163 (2011).
- Beutler, B., Milsark, I. W., Cerami, A. C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 229, 869-871 (1985).
- Tracey, K. J. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature. 330, 662-664 (1987).
- Eskandari, M. K. Anti-tumor necrosis factor antibody therapy fails to prevent lethality after cecal ligation and puncture or endotoxemia. J. Immunol. 148, 2724-2730 (1992).
- Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. The HA-1A Sepsis Study Group. N. Engl. J. Med. 324, 429-436 (1991).
- Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli. N. Engl. J. Med. 307, 1225-1230 (1982).
- Abraham, E. Efficacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor alpha in patients with sepsis syndrome. A randomized, controlled, double-blind, multicenter clinical trial. TNF-alpha MAb Sepsis Study Group. JAMA. 273, 934-941 (1995).
- Cohen, J. Adjunctive therapy in sepsis: a critical analysis of the clinical trial programme. Br. Med. Bull. 55, 212-225 (1999).
- Dellinger, R. P. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Crit. Care Med. 36, 296-327 (2008).
- Wang, H., Zhu, S., Zhou, R., Li, W., Sama, A. E. Therapeutic potential of HMGB1-targeting agents in sepsis. Expert. Rev. Mol. Med. 10, e32 (2008).
- Wang, H. The aqueous extract of a popular herbal nutrient supplement, Angelica sinensis, protects mice against lethal endotoxemia and sepsis. J. Nutr. 136, 360-365 (2006).
- Li, W. A cardiovascular drug rescues mice from lethal sepsis by selectively attenuating a late-acting proinflammatory mediator, high mobility group box 1. J. Immunol. 178, 3856-3864 (2007).
- Fukuyama, M. Mixed bacterial infection model of sepsis in rabbits and its application to evaluate superantigen-adsorbing device. Blood Purif. 23, 119-127 (2005).
