Summary
Sepsis avser en systemiskt inflammatoriskt responssyndrom resulterande från en mikrobiell infektion, och kan simuleras genom en kirurgisk teknik kallad cekala ligering och punktering (CLP). Här beskriver vi en metod att använda CLP-inducerad djurmodell för att screena läkemedel örter för terapeutiska medel.
Abstract
Sepsis avser en systemiskt inflammatoriskt responssyndrom resulterande från en mikrobiell infektion. Det har varit rutinmässigt simuleras i djur genom flera tekniker, inklusive infusion av exogent bakteriellt toxin (endotoxemi) eller bakterier (bakteriemi), såväl som kirurgiska perforering av blindtarmen genom cekala ligering och punktering (CLP) 1-3. CLP gör att bakterier spill och fekal kontaminering av bukhålan, imitera den humana kliniska sjukdomen av perforerad blindtarmsinflammation eller divertikulit. Svårighetsgraden av sepsis, vilket återspeglas av de eventuella dödlighet, kan kontrolleras kirurgiskt genom att variera storleken på nålen som används för cecal punktering 2. Hos djur inducerar CLP liknande bifasisk hemodynamisk kardiovaskulära, metabola och immunologiska svar som observerats under kliniska förloppet av mänsklig sepsis 3. Således är CLP-modellen betraktas som en av de mest kliniskt relevanta modeller för experimentell sepsis 1-3. </ P>
Olika djurmodeller har använts för att belysa de intrikata mekanismer som ligger till grund för patogenesen av experimentell sepsis. Den letala följd av sepsis beror delvis på en överdriven ansamling av tidiga cytokiner (såsom TNF, IL-1 och IFN-γ) 4-6 och sena pro-inflammatoriska mediatorer (t ex HMGB1) 7. Jämfört med tidiga proinflammatoriska cytokiner, sent verkande mediatorer har en bredare terapeutiskt fönster för kliniska tillämpningar. Till exempel, fördröjd administrering av HMGB1-neutraliserande antikroppar med början 24 timmar efter CLP fortfarande räddade möss från dödlighet 8,9, inrättande av HMGB1 som en sen mediator av dödlig sepsis. Upptäckten av HMGB1 som en sen verkande medlare har inlett ett nytt område av utredning för utveckling av sepsis behandlingar med traditionell kinesisk örtmedicin. I denna skrift beskriver vi ett förfarande för CLP-inducerad sepsis, och dess användning i screening örtmedicin för HMGB1-inriktning terapier.
Protocol
1. Fastställande av djurmodell av Sepsis
- Möss bedövades med ketamin (75 mg / kg, intramuskulär, im) och xylazin (10 mg / kg, IM), och placerades i ryggläge.
- Fäst fötterna på musen med tejp för att säkerställa en stabil position.
- Rengör buken med 3 omväxlande Scrubs av Betadine eller andra hud desinfektionsmedel och alkohol. Sedan gör en 15 mm mittlinjesnitt att exponera blindtarmen.
- Ligera cekum med en 4-0 silkessutur vid ca 5,0 mm från den cekala spetsen, och sedan punktera den ligerade cekala stumpen gång med en 22-gauge nål för att tillåta utpressning av avföring.
- Blindtarmen omedelbart ersättas tillbaka till sitt normala intraabdominella läge.
- Stänga snittstället i två skikt, genom att först stänga muskulaturen i buken med absorberbara suturer, och därefter stängandet av huden med sårklämmor eller icke-absorberbara suturer.
- Återuppliva mus med 0,5 ml normal saltlösning och en enda görase av imipenem (0,5 mg / mus, subkutant) omedelbart efter fullbordandet av den kirurgiska proceduren.
- Återgå musen tillbaka till en ren bur med fri tillgång till mat och vatten.
- Vid olika tidpunkter efter CLP, är växtbaserade extrakt eller en komponent administreras intraperitonealt.
- Animal överlevnad övervakas under mer än två veckor. Döende djur som uppvisar svårigheter att stå och agonal andning, svår muskelatrofi och okontrollerad blödning bör avlivas med överdos av koldioxid inandning.
- Det är viktigt att notera att cirkulerande cytokinnivåer är viktiga parametrar i dessa studier. Olika analgetika har visat sig påverka cytokinfrisättning och aktiviteter, och har därför avsiktligt undvikas i postoperativ vård.
2. Beredning av Herbal Extract
- Packa örter i varmt vatten (85 ° C) för 1-4 timmar (1 timme för löv och 4 h för rötter).
- Centrifugera det vatten-såluble fraktion (3300 g, 20 min, 4 ° C) för att avlägsna olösliga partiklar.
- Filtratet supernatantfraktionen genom en 0,2 pm filter.
- Den klara vattenlösliga filtratfraktionen fraktioneras sedan genom ultrafiltrering med användning av Centriprep YM-10 centrifugalfilter (katalog nr. 4305, Millipore).
- Det resulterade låg (<10 kDa) och hög (> 10 kDa) molekylviktsfraktioner (MWF) undersöks med avseende på HMGB1-hämmande verksamhet med hjälp av makrofager kulturer.
- Intraperitoneal administrering av HMGB1-hämmande växtbaserade extrakt eller komponenter vid 24 timmar efter CLP för att utvärdera deras terapeutiska effekt.
3. Peritoneal makrofag Isolering
- Tioglykolat buljong (4%, 2,0 ml) administrerades intraperitonealt i normala möss.
- Primära peritoneala makrofager skördas efter 3 dagar som tidigare beskrivits 10.
- Makrofager är för-odlades i DMEM-medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mmol / L glutamin och 1% penicillin.
- Adherenta makrofager tvättas varsamt med, och odlades i serum-fritt OPTI-MEM I-medium två timmar före stimulering med bakteriellt endotoxin (lipopolysackarid, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
- Vid 16 timmar efter LPS-stimulering, är halter av HMGB1 i odlingsmediet bestämdes med Western blotting analys 11.
- Den relativa bandet intensiteten kvantifierades genom att använda NIH bilden 1,59 programvara för att avgöra HMGB1 nivåer med hänvisning till standardkurvor genererade med renat HMGB1.
4. Representativa resultat
1. CLP inducerar systemisk och lokal inflammation.
Inom några timmar efter CLP kirurgi, djur uppvisar kliniska tecken på sepsis som inkluderar piloerektion, slöhet, kryper, och minskar i livsmedel och vatten intag. Djur utvecklar en allvarlig bukhinneinflammation med rad systemiskinfektion dör normalt inom 48 till 96 timmar. Men kan även ålder, kön-, och genetisk bakgrund, anpassade djur svara på CLP kirurgi i en urskiljbar sätt i samband med experimentell sepsis. Till exempel, vid 48 h efter CLP, medan vissa djur kan ha närmat sig döende tillstånd (såsom definieras i figur 1), kan andra förblir vid en icke-döende tillstånd.
Omfattande undersökningar av cirkulerande cytokiner avslöjade dramatiska skillnader i olika cytokiner (t.ex. IL-6, KC, MIP-2 och sTNFR1) mellan möss i de döende och icke-döende tillstånd (figur 1) 12. I synnerhet har dessa inflammatoriska mediatorer har klassificerats som surrogatmarkörer av sepsis eftersom deras cirkulerande nivåer är pålitliga prediktorer för dödlig utgång vid experimentell 12-14 eller klinisk sepsis 15. Dessutom CLP inducerade också lokal frisättning av olika pro-och anti-inflammatoriska cytokiner och kemokiner. Exempelvis vid48 h efter CLP, signifikanta mängder av cytokiner (t.ex. IL-6) och kemokiner (KC och MIP-2) kan fortfarande mätas inte bara systemiskt i blodet, utan även lokalt i peritoneal lavage (figur 2).
2. Screening för HMGB1-inhiberande växtbaserade extrakt eller komponenter.
Med makrofagkulturer kunde vi utvärdera kapaciteten av olika örtextrakt och komponenter i hämma endotoxin-inducerad HMGB1 frisättning (Figur 3). Mot bakgrund av sin kapacitet att hämma HMGB1 release, utforskade vi ytterligare deras effektivitet i djurmodeller sepsis. Med tanke på de sena och långvariga kinetik HMGB1 ackumulering i experimentell sepsis 8, den första dosen av HMGB1-hämmare ges 24 timmar efter starten av sepsis - en tidpunkt när möss utvecklade tydliga tecken på sepsis, inklusive slöhet, diarré och piloerektion. Som visas i figur 4, försenats och upprepad administrering av en stor grönt te component, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), som börjar vid 24 timmar efter början av sepsis, signifikant räddade möss från dödliga sepsis 12. Även när det ges oralt, EGCG ändå räddats möss från dödlig sepsis, signifikant öka antalet djur överlevnad från 16% till 44% 16. Det skulle vara viktigt att avgöra om kombinatoriska terapier med flera växtbaserade komponenter kan uppnå en signifikant bättre skydd i djurmodeller av sepsis. Sammantaget utgör dessa experimentella data valideras vår inställning till skärmen nya läkemedel med hjälp av en djurmodell av CLP-inducerad sepsis.
5. Representativa resultat
Figur 1. Cirkulerande nivåer av surrogatmarkörer är dramatiskt högre i septiska djur närmar döende tillstånd. Balb / C-möss utsattes för sepsis med CLP och övervakas för utveckling av tecken på sjukdom. Vid ensent stadium av sepsis (52 h efter CLP), uppsamlades blod från 3 normala möss (-CLP), 3 septiska möss som närmar sig döende tillstånd, och 3 septiska möss i den icke-döende tillstånd. Serum uppsamlades från varje grupp, och analyserades med avseende på cytokinprofil av antikropp matriser. Notera den dramatiska skillnaden i de relativa nivåerna av flera surrogatmarkörer mellan olika grupper. Anpassad från doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med beviljat tillstånd från förlaget.
Figur 2. Detektering av lokala och systemiska cytokiner och kemokiner vid 48 h efter CLP. Balb / C-möss utsattes för sepsis av CLP, och blod eller peritoneal vätska skördades vid 48 h efter CLP. Relativa nivåerna av flera cytokiner och kemokiner i poolade serum eller peritoneal lavage mättes med matriser cytokin antikropp och uttryckt som godtyckliga enheter (AU). Som kontroller, blod och peritonealvätska SAmples erhölls från normala friska djur (-CLP) utan laparotomi.
Figur 3. Herbal del dosberoende hämmade endotoxin-inducerad HMGB1 release i primära makrofagkulturer. Primära murina peritoneala makrofager stimulerades med LPS i frånvaro eller närvaro av växtbaserade komponent (t.ex. EGCG, 15 M). Vid 16 timmar efter LPS-stimulering, var nivåerna av HMGB1 i odlingsmediet bestämdes med Western blotting analys. Anpassad från doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med beviljat tillstånd från förlaget.
Figur 4. Herbal komponent räddade möss från dödliga sepsis. Balb / C-möss utsattes för dödliga sepsis med CLP och naturläkemedel komponent (EGCG) administrerades intraperitonealt på +24, +48 och +72 timmar efter starten av sepsis. Enimal överlevnad övervakades under upp till två veckor. Kaplan-Meier-metod användes för att jämföra skillnaden i dödlighet mellan grupper. *, P <0,05 kontra koksaltlösning. Anpassad från doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 med beviljat tillstånd från förlaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I laboratoriet, har flera djurmodeller för sepsis använts för att förstå patogenesen av sepsis i syfte att utveckla potentiella nya behandlingar. Deras kliniska relevansen fortfarande ett ämne för debatt innan den framgångsrika översättning av djurstudier till kliniska tillämpningar för sepsis. Även neutraliserande antikroppar mot tidiga cytokiner (t.ex. TNF) var skyddande i djurmodeller av bakteriemi / endotoxemi 17,18, försämras de faktiskt överleva i djurmodell av sepsis 19. På samma sätt misslyckades de flesta anti-TNF läkemedel för att visa effekt i kliniska prövningar av sepsis 20-22. Detta misslyckande beror delvis på komplexiteten i de underliggande patogena mekanismer sepsis 23,24. Dessutom kan det också bero på fallgropar vid valet av: 1) genomförbara terapeutiska mål eller läkemedel, 2) optimala doser och tidpunkter för läkemedel, och 3) icke-realistiska kliniska effektmått (t.ex. dödlighet) 25. Den senaste upptäckten av HMGB1 inriktning växtbaserade extrakt och / komponenter, inklusive Danggui 26, grönt te 12,16, och Danshen 27 har gett goda exempel från prekliniska undersökningar använder djurmodeller för sepsis. Ytterligare undersökningar inom detta område kommer att kasta mer ljus över de molekylära Cascades ligger reglering av det medfödda immunförsvaret och ger ledtrådar för utveckling av läkemedel för olika inflammatoriska sjukdomar. När första upprättandet CLP i ditt laboratorium bör ansträngningar göras för att utföra kirurgi förfarande så snabbt och exakt som möjligt för att säkerställa reproducerbarhet, speciellt när man använder ett stort antal (30-40) hos möss att jämföra överlevnaden mellan flera experimentella grupper av ett experiment. Användningen av långverkande anestetika (som ketamin och xylazin) ger oss möjlighet att slutföra CLP kirurgiskt ingrepp på ett stort antal möss i en relativt kort tid, och under tiden hjälpa till attavlägsna eventuella dosen varians ofta uppträtt vid användning av flyktiga anestetika. Överlevnaden och systemisk cytokin ackumulering kan tas som tecken på framgångsrik prestanda CLP förfarande.
CLP-modellen har använts i stor utsträckning gnagare på grund av uppenbara fördelar i låg kostnad, enkelhet av kirurgiskt ingrepp, och omfattande patologiska, immunologiska, fysiologiska karakteriseringar. Det finns dock ett antal begränsningar på musen CLP-modellen 1-3. Till exempel, liksom alla djurmodeller, är en art skillnad belyses av det faktum att cecal ligering utan punktering kan vara dödlig i humana men inte hos möss. Dessutom, på grund av liten storlek av mus och dehydratisering efter CLP, är det ofta svårt att erhålla Serieblodprover för cytokin mätning. Dessa nackdelar kan delvis övervinnas genom att CLP modeller i större djur 2,3,27,28. Dessutom är det viktigt att påpeka att dödligheten ochfortskridande peritonit hos gnagare är till stor del bestäms av mängden avföring strängsprutning, vilka påverkas av tjockleken för den nål som används för att punktera blindtarmen, antalet punkteringar, den totala volymen av ligerade blindtarmen och viskositeten hos pallen 2, 3. Dessutom kan dosen och frekvensen för administrering av antibiotika i ett tidigt skede av CLP påverkar också dödligheten. Slutligen kan animaliska källor och bostäder miljö bidrar också till variationen av dödlighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AES och HW är co-uppfinnarna av patentansökningar relaterade till HMGB1 hämmare (tanshinones) som potentiella terapeutiska medel för sepsis.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health, National Institute of General Medical Science (R01GM063075) och National Center of komplementär och alternativ medicin (R01AT05076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 25655-41-8 | |
| imipenem | Merck & Co., Inc. | 9882821 | |
| Ketamine HCl | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | 4821 | |
| Autoclip | BD Biosciences | 427631 | |
| 4-0 silk suture | Roboz Surgical Instruments Co. | SUT-15-2 | |
| Surflo I.V. Catheter | Terumo Medical Corp. | SR*OX2419CA | |
| RayBio mouse cytokine antibody array | RayBiotech, Inc. | AAM-CYT-3 | |
| Thioglycollate | BD Biosciences | 211716 |
References
- Wichterman, K. A., Baue, A. E., Chaudry, I. H. Sepsis and septic shock--a review of laboratory models and a proposal. J. Surg. Res. 29, 189-201 (1980).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Hubbard, W. J. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, Suppl . 1. 52-57 (2005).
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 4, 499-511 (2004).
- Baggiolini, M., Loetscher, P. Chemokines in inflammation and immunity. Immunol. Today. 21, 418-420 (2000).
- Balkwill, F. Cytokines--soluble factors in immune responses. Curr. Opin. Immunol. 1, 241-249 (1988).
- Wang, H. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science. 285, 248-251 (1999).
- Yang, H. Reversing established sepsis with antagonists of endogenous high-mobility group box 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 296-301 (2004).
- Qin, S. Role of HMGB1 in apoptosis-mediated sepsis lethality. J. Exp. Med. 203, 1637-1642 (2006).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. J. Vis. Exp. (35), e1488 (2010).
- Rendon-Mitchell, B. IFN-gamma Induces High Mobility Group Box 1 Protein Release Partly Through a TNF-Dependent Mechanism. J. Immunol. 170, 3890-3897 (2003).
- Li, W. A Major Ingredient of Green Tea Rescues Mice from Lethal Sepsis Partly by Inhibiting HMGB1. PLoS ONE. 2, e1153 (2007).
- Osuchowski, M. F., Welch, K., Siddiqui, J., Remick, D. G. Circulating cytokine/inhibitor profiles reshape the understanding of the SIRS/CARS continuum in sepsis and predict mortality. J. Immunol. 177, 1967-1974 (2006).
- Heuer, J. G. Evaluation of protein C and other biomarkers as predictors of mortality in a rat cecal ligation and puncture model of sepsis. Crit. Care. Med. 32, 1570-1578 (2004).
- Bozza, F. A. Cytokine profiles as markers of disease severity in sepsis: a multiplex analysis. Crit. Care. 11, R49 (2007).
- Li, W. EGCG stimulates autophagy and reduces cytoplasmic HMGB1 levels in endotoxin-stimulated macrophages. Biochem. Pharmacol. 81, 1152-1163 (2011).
- Beutler, B., Milsark, I. W., Cerami, A. C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 229, 869-871 (1985).
- Tracey, K. J. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature. 330, 662-664 (1987).
- Eskandari, M. K. Anti-tumor necrosis factor antibody therapy fails to prevent lethality after cecal ligation and puncture or endotoxemia. J. Immunol. 148, 2724-2730 (1992).
- Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. The HA-1A Sepsis Study Group. N. Engl. J. Med. 324, 429-436 (1991).
- Ziegler, E. J. Treatment of gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli. N. Engl. J. Med. 307, 1225-1230 (1982).
- Abraham, E. Efficacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor alpha in patients with sepsis syndrome. A randomized, controlled, double-blind, multicenter clinical trial. TNF-alpha MAb Sepsis Study Group. JAMA. 273, 934-941 (1995).
- Cohen, J. Adjunctive therapy in sepsis: a critical analysis of the clinical trial programme. Br. Med. Bull. 55, 212-225 (1999).
- Dellinger, R. P. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Crit. Care Med. 36, 296-327 (2008).
- Wang, H., Zhu, S., Zhou, R., Li, W., Sama, A. E. Therapeutic potential of HMGB1-targeting agents in sepsis. Expert. Rev. Mol. Med. 10, e32 (2008).
- Wang, H. The aqueous extract of a popular herbal nutrient supplement, Angelica sinensis, protects mice against lethal endotoxemia and sepsis. J. Nutr. 136, 360-365 (2006).
- Li, W. A cardiovascular drug rescues mice from lethal sepsis by selectively attenuating a late-acting proinflammatory mediator, high mobility group box 1. J. Immunol. 178, 3856-3864 (2007).
- Fukuyama, M. Mixed bacterial infection model of sepsis in rabbits and its application to evaluate superantigen-adsorbing device. Blood Purif. 23, 119-127 (2005).
