Summary
Glasuld filtre er blevet anvendt til at koncentrere vandbårne virus ved en række forskningsgrupper hele verden. Her viser vi en enkel fremgangsmåde til at konstruere glasuld filtre og påvise filtrene er også effektive til at koncentrere vandbårne virale, bakterielle og protozoiske patogener.
Abstract
Nøglen første skridt i evalueringen patogen niveauet i mistanke om forurenet vand er koncentration. Koncentration metoder har tendens til at være specifikke for et særligt patogen gruppe, for eksempel US Environmental Protection Agency Fremgangsmåde 1623 for Giardia og Cryptosporidium 1, hvilket betyder multiple fremgangsmåder er påkrævet, hvis prøveudtagningsprogrammet er målrettet mod mere end ét patogen gruppe. En anden ulempe ved de nuværende fremgangsmåder er udstyret kan være kompliceret og kostbar, for eksempel VIRADEL metoden med 1MDS patronfilter til koncentrering virus 2. I denne artikel beskriver vi, hvordan man opfører glas uld filtre til at koncentrere vandbårne patogener. Efter filter eluering er koncentrat egnet til en anden koncentration trin, såsom centrifugering, efterfulgt af påvisning af patogener og tælling af kultur eller molekylærbiologiske metoder. Filtrene har adskillige fordele. Byggeri er nemt, og filtrene kan bygges til enny størrelse til at opfylde specifikke krav til dataindsamling. Filteret dele er billig, gør det muligt at samle et stort antal af prøver uden alvorligt at påvirke en projektbudget. Store prøvevolumener (100s til 1000 s L) kan koncentreres afhængig af hastigheden af tilstopning fra prøve turbiditet. Filtrene er yderst bærbar og med minimal udstyr, såsom en pumpe og flowmåler, kan de gennemføres inden for prøvetagning færdige drikkevand, overfladevand, grundvand og landbrug afstrømning. Endelig glasuld filtrering er effektiv til at koncentrere en række patogene former, så kun én metode er nødvendig. Her har vi en rapport om filter effektivitet i at koncentrere vandbårne menneskelige enterovirus, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, og aviær influenza-virus.
Protocol
1. Forberedelse af Glasuld
- Før og efter at hver portion af filtre, sterilisere arbejdsområdet med 10% blegemiddel.
- Tag handsker og kittel. Sterilisere en spand ved autoklavering ved 121 ° C og 15 psi i mindst 20 minutter. Placere glasuld i sterile spanden.
- Mættes glasuld med omvendt osmose vand og lad trække i 15 minutter.
- Tømme omvendt osmosevand fra skovlen.
- Mætte glasuld med 1 M HCI og lad blød i 15 minutter.
- Dræne 1 M HCI fra skovlen.
- Skyl glasuld med omvendt osmose vand.
- Bland grundigt.
- Kontrolleres pH ved anvendelse af pH-papir og gentage omvendt osmose vandskylning, indtil en neutral pH er opnået.
- Hæld skyllevandet.
- Mætte glasuld med 1 M NaOH og lad blød i 15 minutter.
- Dræne 1 M NaOH fra skovlen.
- REPEAT omvendt osmose skylning indtil en neutral pH er opnået.
- Hæld skyllevandet.
- I stedet for en skovl, kan en glasuld skive konstrueres, som er tilsvarende i konstruktion til en glaspipette skive (fig. 1).
- Omfatte glasuld fuldstændigt med steril phosphatpufret saltopløsning (PBS) indstillet til pH 6,8.
- Brug forberedt glasuld straks eller opbevares ved 4 ° C. Den kan opbevares i op til to uger. Før du bruger, skal du sørge pH-værdien er neutral, da det vil stige over tid. Hvis pH ikke er neutralt, igen skylles med sterilt phosphatbufret saltvand (pH 6,8).
2. Montering af Glasuld Filter
- Bor et 11/16 tommer hul i PVC hætter og tryk tråde, så de mandlige adapter nylon beslag kan skrues ind i hætter. Dette trin er kun nødvendigt for den første samling. Derefter kan hætterne anvendes til år. Anvend Teflontape til nylon beslag tråde og skrue til caps.
- Pak PVC-rør med små stykker af glasuld. Anvende et metal stempel, som en bilmotor ventil, at pakke tæt. Pakning kræver ikke stor kraft. Pakke tæt nok, således at glasuld forbliver på plads og kanalerne danner ikke. Imidlertid ikke pakke så tæt vand ikke kan strømme gennem filtret. Når den er pakket på passende må en strømningshastighed på 4 til 5 liter per minut kan nås, når filteret er fastgjort til vandhaner med tryk mellem 40-60 psi. For størrelsen af PVC-rør er angivet i denne protokol, vasket ca 85 gram og pakkes glasuld bruges per rør. Tarere tomme PVC-rør på en top-loading balance og pakke med vasket glasuld, indtil røret massen stiger 85 gram.
- Sæt polypropylen mesh i PVC hætter med mandlige adapter nylon fittings.
- Anvendelse teflontape til de gevindskårne dele af PVC-rør.
- Skru PVC hætter til PVC-pIPE og mærke en filter ende tilstrømningen og den anden ende tilbagetrækningen. Dette er vigtigt senere for elueringstrinnet. Hvilken ende er mærket tilstrømningen betyder ikke noget.
- Skubbe 60 ml sterilt phosphatbufret saltvand (pH = 6,8) i filteret ved hjælp af et kateter tippet sprøjte. Overskydende kommer ud modsatte ende.
- Wrap slutter tæt med Parafilm for at undgå lækage. Filtrene kan opbevares i op til 30 dage ved 4 ° C.
3. Sampling
- Steriliser slange anvendes til prøveudtagning ved recirkulation eller nedsænke poster for 30 minutter i 0,525% NaCIO (dvs. en 10% opløsning af standard husholdningsblegemiddel). Følge denne ved at dræne hypochloritopløsningen og neutraliseres med 0,05% natriumthiosulfat, fremstillet ved tilsætning af 25 ml af en 2% stamopløsning vandfrit natriumthiosulfat til en liter af omvendt osmose.
- For prøve vand med en pH større end 7,5, indstille pH til mellem 6,5 og 7,0 med HCl. HCl koncentrationen kan spænde fra 0,25M til 1 M. Fire liter 0,5 M HCl, er i almindelighed tilstrækkelig til to 800 liters prøver, afhængigt af vandets omgivelsernes pH-værdi og bufferkapacitet. Injicer HCl under prøveudtagning under anvendelse af en peristaltisk pumpe eller en venturi (fig. 2). Juster pumpehastigheden eller Venturi åbning for at nå målet pH. PH måles ved prøvelinjen udløbet ved hjælp af et felt pH-meter.
- Anvendes et forfilter, hvis glasulden filteret tilstopning af vand med høj turbiditet. (Specifikationer for forfilter og dens hus er i Materials listen online.) Eftersom patogener kan bindes til partiklerne fanges af forfilteret det skal elueres sammen med glasuld filter (se nedenfor).
- Justere strømningshastigheden til mellem 2 og 4 liter / minut. Typiske prøvevolumener er mellem 200 og 1500 liter.
- Tag glasuld filter og opbevar det i en plastik steril pose ved 4 ° C i op til 48 timer.
4. Eluering
- Anbringelse af glasuld filter til en ringstår med prøven indstrømningen pegende nedad i en polypropylenflaske. Eluere modsat af retningen af prøvestrømmen.
- Skubbe 80 ml sterilt 3% kødekstrakt i 0,05 M glycin med et pH på 9,5 i filteret.
- Vent 15 minutter.
- Skubbe anden 80 ml sterilt 3% kødekstrakt i 0,05 M glycin med et pH på 9,5 i filteret.
- Skubbe luften grundig filteret, indtil skummet kommer ud af filteret indløbet.
- Justere eluatet pH til mellem 7,0 og 7,5 med 1 M HCI.
- Store eluat ved 4 ° C i op til 24 timer eller ved -20 ° C i længere perioder.
- Eluere forfilteret hvis et sådant anvendes. Skrue toppen af huset patronen og hæld enhver resterende vand inde i huset, mens holder forfilteret på plads med sterile handsker.
- Fjerne forfilteret fra huset patronen og glide det i en 15 "x 6" lynlås pose.
- Hæld 200 ml steril 3% kødekstrakt i 0,05 M glycine med en pH på 9,5 i posen og forsegle sikkert med lynlås.
- Inverterer sække forfilter flere gange for at sikre, at hele overfladen er i kontakt med kødekstrakt.
- Vent 15 minutter, og vende og massere sække forfilter.
- Åbn zip-lock. Grip posen omkring forfilter stramt at presse så meget oksekød ekstrakt som muligt, og træk forfilteret ud med sterile handsker,.
- Hæld oksekød ekstrakt eluatet i en polypropylen flaske.
- Justere eluatet pH til mellem 7,0 og 7,5 med 1M HCI.
- Store eluat ved 4 ° C i op til 24 timer eller ved -20 ° C i længere perioder. Forfilteret Eluatet kan separat analyseres for patogener eller kombineret med glasuld filteret eluat.
5. Repræsentative resultater
| Patogen | Vand Uklarhed Level (NTU) en | Mængden Seeded / L b, c, d | % Recovery ± 1 SD | Antal uafhængige forsøg |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 0,5 | 500 | 81% ± 11 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 0,5 | 5000 | 67% ± 12 | 8 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 215 | 500 | 59% ± 32 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 215 | 5000 | 38% ± 22 | 6 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 447 | 500 | 56% ± 18 | 8 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 447 | 5000 | 63% ± 37 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 5 | 38% ± 14 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 50 | 53% ± 19 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 5 | 40% ± 16 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 50 | 30% ± 6 | 6 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 5 | 33% ± 13 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 50 | 28% ± 11 | 8 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 5 | 29% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 500 | 56% ± 16 | 8 |
| Salmonella enterica | 215 | 5 | 32% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica 215 | 500 | 34% ± 11 | 6 | |
| Salmonella enterica | 447 | 5 | 34% ± 18 | 8 |
| Salmonella enterica | 447 | 500 | 31% ± 24 | 8 |
- Nephelometriske turbiditetsenheder Enhed
- Enterovira opregner qPCR som genomiske kopier / L
- C. parvum optalt ved immunfluorescens som oocyster
- S. enterica optælles ved dyrkning som kolonidannende-enheder
Tabel 1. Glasuld koncentration med varierende vand uklarhederne og patogene tætheder.
| Patogen | Vand prøvested | Mængden Seeded / L en | % Reco meget |
| Aviær Influenza H5N2 | Sundi Lake, Anchorage Borough | 2500 | 42,9% |
| Aviær Influenza H5N2 | Minto Flats, Fairbanks North Star Borough | 2500 | 36,7% |
| Aviær Influenza H5N2 | Portage Valley, Anchorage Borough | 2500 | 7,8% |
| Aviær Influenza H5N2 | Potter Marsh, Anchorage Borough | 2500 | 41,5% |
| Aviær Influenza H5N2 | Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough | 2500 | 15,5% |
- Målt ved qPCR som genomisk kopier / L
Tabel 2. Glasuld koncentration af aviær influenza-virus ved hjælp af vand fra fem steder i Alaska.
les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Diagram af glasuld skive. Dette kan anvendes i stedet for en skovl, hvilket sparer tid fra skylning. Begrebet svarer til en glaspipette skive.
Figur 2. Glasuld filtrering med syre injektion ved peristaltisk pumpe. Bemærk "T"-stik, hvor pumpen slangen introducerer syre i prøven linje mellem vandhanen og glasuld filter. pH-justering er nødvendig, hvis det samplede vand har en pH> 7,5.
Glasuld filtre er effektive til at koncentrere patogener fra vand med en bred vifte af turbiditetsniveauer og patogene densiteter (tabel 1). At teste dette blev 20 liter dechlorerede ledningsvand blandes med tørret dynd-lerblandet jord (0, 1,27, eller 2,75 g / L) for at opnå det ønskede niveau af turbiditet og dernæst podet med patogener ved forskellige tætheder. Vandetblev ledt gennem en prop af glasuld filter blev de koncentrerede patogener i eluatet optalt, og denne værdi var tælleren i den procentvise udvinding beregningen. Mængden af patogener podet i vandet, dvs nævneren af den procentvise udvinding beregningen blev bestemt ved først at podning af patogener i en negativ eluat derefter optælle patogener. Den negative Eluatet blev fremstillet ved at lede en upodet 20 liter prøven gennem et filter og eluering. Kvantificere de sået patogener i en negativ eluat undgår forskelle i patogen optælling, som kunne følge af matrix forskelle skabt af glasuld filter. Vigtigheden af dette trin ved kvantificering patogener ved qPCR er diskuteret i Lambertini et al. 3. En 20 liters negativ kontrolprøve blev opkoncentreret via glasuld filtrering for at bestemme der ikke var nativt patogener til stede, kan forvirre den procentvise udvinding beregningen. En 10 um porestørrelse forfilter wsom anvendt ved turbiditeten niveauet var ≥ 215 NTU.
Poliovirus blev kvantificeret ved real-time qPCR hjælp af sekundære koncentration og nukleinsyresekvenser ekstraktionsmetoder og primere og probe, der er beskrevet i Lambertini et al. 3. Cryptosporidium parvum blev kvantificeret i den endelige koncentreret prøvevolumenet (FCSV) skabt af den sekundære koncentrationen procedure for poliovirus . Oocyster blev visualiseret ved immunfluorescens (MeriFluor Cryptosporidium og Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH). Salmonella enterica blev kvantificeret i FCSV ved udpladning på XLD-agar (Remel, Lenexa, KS) og tælling kolonidannende- enheder.
Glas uld filtre er effektive til at koncentrere aviær influenza-vira (Tabel 2). Lavpatogent aviær influenza-virus (H5N2) blev podet i vand fra en række steder i Alaska og den procentvise udvinding beregnet som beskrevet above. Sekundær koncentrering og nukleinsyresekvenser procedurer blev udført som for poliovirus, virus blev kvantificeret ved qPCR anvendelse af primerne og proben er beskrevet i Spackman et al 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glas uld filtre er blevet brugt af flere forskerhold 3,5,6 at koncentrere de menneskelige enteriske virus fra en række af vandkilder f.eks færdig drikkevand 7, grundvand 8,9, overfladevand 10, havvand 11, spildevand 12, og landbruget afstrømning 13. Her rapporterer vi filtrene er også effektive til at koncentrere aviær influenza-virus samt bakterielle og protozoiske patogener Salmonella enterica (serovar typhimurium) og Cryptosporidium parvum, hhv. Deboosere et al. Også for nylig rapporteret glasuld koncentration af aviær influenza-virus 14.
Filtrene er fordelagtige, idet de er billige, meget transportabel, er anvendelige i en lang række vand-matricer og er effektive til at koncentrere mange typer vandbårne patogener. De kan være konstrueret til enhver størrelse, afhængigt af forskningsbehov. Efter Desinficerion, filterhuse kan genbruges.
Glas uld filtre, men har dog begrænsninger. Som med enhver viruskoncentration metode, der er baseret på electropositively ladede medier til virusadsorption (f.eks 1MDS filter, Cuno Inc., Meriden, CT), afhænger filter effektiviteten af den omgivende vand pH. I vores laboratorium har vi valgt pH 7,5 som den afskårne, over hvilket vandet pH justeres nedad ved kontinuerligt at pumpe 0,25 M HCI i filteret indgangslinien under prøveudtagning. Højere pH vand kan udtages uden pH-justering, men på bekostning af filteret effektivitet 3. En anden begrænsning er holdbarhed. Vi har vist for filtre opbevaret ved 4 ° C i seks uger at patogenet koncentration effektivitet ikke falde (upublicerede data). Ikke desto mindre, har længere opbevaringstid ikke blevet testet for, konservativt, for at sikre datakvaliteten, vi ikke bruge filtre er ældre end 30 dage. Sædvanligvis filtre fremstillet efter behov. En anden potentiel afspærring i nogle countries er at få glasset uld fra den franske kilde er angivet i tidligere papirer. Vi har for nylig demonstreret standard unfaced glasfiber isolering er lige effektive, og det er let tilgængelig fra hardware eller byggemarkeder (se Materialer liste online).
For alle eksperimenter, er det vigtigt at køre to sæt kontroller, et udstyr tomme for at sikre, glas uld filtre blev ikke forurenet under konstruktion og et opsving kontrol for at sikre filtrene fungerer efter hensigten. Disse kontroller er nødvendige for enhver vandbåren patogen koncentration metode.
Ved hjælp af en glasuld-filter kan være så simpelt som at fastgøre det til en vandhane og tænde for vandhanen eller så kompliceret som prøven består af en sediment-lastet flod i et fjernt sted, der kræver pumper, justering af pH, og et forfilter for at undgå tilstopning. For vores forskningsgruppe, er den største fordel ved at anvende glas uld filtre evnen til at indsamle og analysere tusindvis af vandprøves for mennesker og husdyr patogener, hvilket giver data om patogen overflod og udbredelse i miljøet, som ikke ville have været lige så muligt med mere kostbare, komplicerede metoder 13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker William T. Eckert for fortællemæssige videoen. Udvikling af glasuld protokol var en del af Wisconsin vand og sundhed Trial for Enteriske risici (WAHTER Study), finansieret af US EPA STAR Grant R831630. Alaska prøver blev indsamlet af A. Reeves, A. Ramey, og B. Meixell med økonomisk støtte fra USGS. Enhver brug af handels-, produkt eller firma navne er beskrivende formål og indebærer ikke godkendelse af den amerikanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrochloric acid |  Fisher Scientific |
A144-500 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific |
BP359-212 | |
| Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic | Fisher Scientific |
BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Sodium hypochlorite i.e., household bleach | Clorox |
||
| Sodium thiosulfate, anhydrous | Fisher Scientific |
S 475-212 | |
| Beef extract, desiccated | BD Biosciences |
211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific |
G46-500 | |
| Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation | Johns Manville |
Bourre 725 QN | |
| Polypropylene mesh | Industrial Netting |
xN4510 | |
| 2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple | Grainger |
6MW35 | |
| 2" Sch 40 PVC cap | Grainger |
5WDW3 | |
| Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") | US Plastic Corp. |
62178 | |
| Sample bottles for eluate- 1 liter | Fisher Scientific |
03-313-4F | |
| 60 mL syringe | Fisher Scientific |
NC9661991 | |
| pH strips | Whatman, GE Healthcare |
2614 991 | |
| Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 μm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Prefilter housing | Cole-Parmer | S-29820-10 |
References
- US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002. , (2012).
- Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
- Lambertini, E. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).
- Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).
- Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705 (2004).
- Powell, K. L. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).
- Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).
- van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).
- Vilaginés, P. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).
- Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).
- Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).
- Deboosere, N. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).
- Lambertini, E. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).
