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Immunology and Infection

집중 Waterborne 바이러스와 농업 Zoonotic 병원균에 대한 유리 양모 필터

Published: March 3, 2012 doi: 10.3791/3930

Summary

유리 양모 필터는 전세계 연구 그룹의 숫자 waterborne 바이러스를 집중하는 데 사용되었습니다. 여기 글라스울 필터를 구축하기위한 간단한 접근 방식을 보여 주며 필터도 waterborne 바이러스성, 세균성 및 protozoan 병원균을 집중 효과입니다 보여줍니다.

Abstract

의심 오염된 물에 병원체 수준을 평가의 중요한 첫 번째 단계는 농도입니다. 농도 방법은 예를 들어, 샘플링 프로그램이 하나 이상의 병원체 그룹을 대상으로하는 경우 여러 가지 방법이 필요합니다 의미한다 Giardia와 Cryptosporidium 1에 대한 미국 환경 보호청 방법 1623 특정 병원체 그룹에 대한 구체적인 경향이 있습니다. 현재 방법의 또 다른 단점은 장비 예를 들어, 바이러스에게 2 집중에 대한 1MDS 카트리지 필터 VIRADEL 방법 복잡하고 비쌀 수있다. 이 문서에서는 waterborne 병원균을 집중을위한 글라스 울 필터를 구성하는 방법에 대해 설명합니다. 필터는 용출 후 원액은 문화적 또는 분자 방법에 의해 병원균 감지 및 열거 다음과 같은 원심 분리와 같은 두 번째 농도 단계, 의무가있다. 필터는 몇 가지 장점이 있습니다. 건설 간단하고 필터를 만들 수 있습니다특정 샘플링 요구 사항을 충족을위한 NY 크기. 필터 부분은 가능한 심하게 프로젝트 예산에 영향을주지 않고 샘플의 다수를 수집하고, 저렴합니다. 대형 샘플 볼륨 (100s 1,000의 패)은 샘플 탁도에서 막힘의 비율에 따라 집중하실 수 있습니다. 필터는 매우 휴대용이며, 펌프 및 유량계 등 최소한의 장비로, 그들은 완성된 식수, 표면 물, 지하수 및 농업 결선을 샘플링을 위해 현장에서 구현할 수 있습니다. 마지막으로, 글라스 울 여과은 하나의 방법이 필요하므로 병원체 종류의 다양한 집중을위한 효과적입니다. 여기 waterborne 인간 enterovirus, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum 및 조류 독감 바이러스를 자세하게 필터 효과에 대한 리포트입니다.

Protocol

1. 글라스 울 준비

  1. 필터의 각 일괄 처리 전에시키고 이후 10 %의 표백제 용액으로 작업 영역을 소독.
  2. 장갑과 가운 입어. 최소한 20 분 동안 121 ° C와 15 PSI에 autoclaving하여 양동이를 소독. 멸균 양동이에 유리 양모를 놓습니다.
  3. 역삼투 물로 글라스 울을 포화 및 15 분 동안 흠뻑 젖어 보자.
  4. 양동이에서 역삼투 물을 배수.
  5. 1 M HCL로 글라스 울을 포화 및 15 분 동안 흠뻑 젖어 보자.
  6. 양동이에서 1 M HCL 드레인.
  7. 역삼투 물로 글라스 울을 씻어.
  8. 철저하게 섞는다.
  9. 산도 용지를 사용하여 산도를 확인하고 중성 산도가 달성될 때까지 역삼투 물 린스 반복한다.
  10. 헹굼 물을 붓고.
  11. 1 M NaOH로 글라스 울을 포화 및 15 분 동안 흠뻑 젖어 보자.
  12. 양동이에서 1 M NaOH 드레인.
  13. R중성 산도가 달성되기 전까지 역삼투 린스 epeat.
  14. 헹굼 물을 붓고.
  15. 대신 양동이로, 글라스 울 세척기는 디자인 유리 피펫 세척기 (그림 1)과 비슷있는 건설 수 있습니다.
  16. 멸균 인산과 완전히 유리 양모를 맡아 식염수 (PBS)는 산도를 6.8로 조정 버퍼.
  17. 4에서 준비한 유리 즉시 양털 또는 상점을 사용 ° C. 그것은 최대 2 주 동안 사용자에게 위해 저장할 수 있습니다. 사용하기 전에, 그것이 시간이지나면서 상승하므로 산도 중립한지 확인하십시오. 산도가 중성이 아닌 경우, 멸균 인산과 다시 헹굼 (산도 6.8) 염분 버퍼.

2. 유리 양모 필터 조립

  1. 남성 어댑터 나일론 피팅은 대문자로 엉망 수 있도록 PVC 모자와 탭 스레드로 16분의 11 인치 구멍을 드릴 다운합니다. 이 단계는 첫 번째 어셈블리를 위해 꼭 필요한 사항입니다. 이후 마개는 년간 사용하실 수 있습니다. 테플론을 적용나일론 피팅 스레드와 뚜껑의 나사에 테이프.
  2. 글라스 울 작은 조각으로 PVC 파이프를 싸. 꽉를 싣고, 자동차 엔진 밸브와 같은 금속 플런저를 사용하십시오. 포장은 큰 힘을 필요로하지 않습니다. 꽉 충분한 글라스 울은 제자리에 유지되도록 싸서 채널을 형성하지 않습니다. 그러나 너무 단단히 물이 필터를 통해 흐를 수를 포장하지 않습니다. 적절하게 포장되면 분당 4-5리터의 유속은 필터가 40-60 PSI 사이의 압력으로 물을 도청에 부착되었을 때 달성해야합니다. 이 프로토콜에 명시된 PVC 파이프의 크기의 경우 약 85g은 씻어과 포장 글라스 울은 파이프마다 사용됩니다. 포장 재료의 중량은 파이프 질량 85 그램 한물간 글라스 울로 최고로드 균형과 팩을에 빈 PVC 파이프 증가 때까지.
  3. 첨부 남성 어댑터 나일론 피팅과 PVC 마개로 폴리 프로필렌 메쉬를 삽입합니다.
  4. PVC 파이프의 나사 부분에 테플론 테이프를 적용합니다.
  5. PVC p로 PVC 모자에 나사IPE 및 레이블 하나의 필터 끝에 유입하고 다른 쪽 끝을 유출. 이것은 용출 단계 나중에 중요하다. 어떤 끝이 유입 상관 없어요 표시됩니다.
  6. 멸균 인산의 60 ML은 카테터를 사용하여 필터로 (산도 = 6.8)을 식염수 버퍼 푸시는 주사기 줬지. 초과는 반대 끝이 나올 것이다.
  7. 포장은 누수 방지하기 Parafilm과 밀접하게 끝납니다. 필터는 4 ° C.에 30 일 이내에 저장될 수

3. 샘플링

  1. 0.525 % NaClO (즉, 일반 가정용 표백제의 10 % 용액)에 30 분간 항목을 순환하거나 immersing하여 샘플링에 사용되는 튜브를 소독. 차아 염소 산염 용액을 배수하여이 작업을 따라 역삼투 물의 일리터에 2 %의 주식 무수 나트륨 thiosulfate 용액의 25 ML을 추가하여 만든 0.05 % 나트륨 thiosulfate로 무력화.
  2. 7.5보다 큰 산도와 견본 물의 경우 HCL과 6.5 사이 7.0으로 산도를 조정합니다. HCL 농도 범위는 수 0.25에서한 M. 포 리터에 M 0.5 M HCL은 일반적으로 물이 주변 산도와 버퍼링 용량에 따라 두 800리터 샘플, 충분합니다. 연동 펌프 또는 Venturi을 (그림 2)를 사용하여 샘​​플링 기간 동안 HCL을 주사. 펌프 속도 또는 대상 산도를 달성하기위한 Venturi 개구부를 조정합니다. 필드 산도 측정기를 사용하여 샘​​플 라인 콘센트에서 산도를 측정합니다.
  3. 글라스 울 필터 나막신 경우 높은 탁도와 물에서 prefilter을 사용합니다. (prefilter과 주택 사양 자료 목록을 온라인에 있습니다.) 병원균은 그것이 (아래) 유리 양모 필터와 함께 eluted해야 prefilter에 의해 갇힌 입자에 장착할 수 있기 때문에.
  4. 둘 사이 4리터 / 분으로 유량을 조정합니다. 일반 샘플 볼륨 200 사이 1천5백리터 있습니다.
  5. 최대 48 시간 동안 4 ° C에서 플라스틱 무균 봉투에 유리 양모 필터와 저장소를 분리합니다.

4. 용리

  1. 접사 링에 유리 양모 필터샘플 유입 엔드 폴리 프로필렌 병으로 하향 지적과 함께하라. 샘플 흐름의 방향을 반대로 Elute.
  2. 필터로 9.5의 산도와 0.05 M 글리신에 무균 3 % 쇠고기 추출물의 80 ML 밀어.
  3. 15 분 정도 기다리십시오.
  4. 필터로 9.5의 산도와 0.05 M 글리신에 무균 3 % 쇠고기 추출물의 또 다른 80 ML 밀어.
  5. 거품이 필터 입구에서 나오는 공기까지 철저한 필터를 누르십시오.
  6. 1 M HCL과 7.0 사이 7.5에 eluate의 산도를 조정합니다.
  7. 매장 4에 eluate ° C에서 시간의 긴 기간 동안 최대 24 시간까지 또는 -20 ° C에서.
  8. 하나를 사용하는 경우 prefilter을 Elute. 나사가 빠지다가 주택 카트리지의 상단과 멸균 장갑 낀 손으로 장소에 prefilter을 누른 상태 하우징 내부에 모두 잔류 물을 부어.
  9. 주택 카트리지에서 prefilter를 제거하고 15 "X 6"지퍼 잠금 가방에 그것을 풀.
  10. 0.05 M g의 무균 3 % 쇠고기 추출물 200 ML을 부어가방에 9.5의 산도와 지퍼 잠금 장치로 안전하게 도장 lycine.
  11. 전체 표면 쇠고기 추출물과 접촉되도록 빌어 prefilter를 여러 번 반전.
  12. 15 분 기다려 가끔씩 반전하고 빌어 prefilter을 마사지.
  13. 지퍼 잠금 장치를 엽니다. prefilter 주변 그립 가방이 꽉 가능한 한 많은 쇠고기 추출물로 짜낸하고, 멸균 장갑 낀 손으로 prefilter을 당겨합니다.
  14. 폴리 프로필렌 병에 쇠고기 추출물의 eluate 하거라.
  15. 1M HCL과 7.0 사이 7.5에 eluate의 산도를 조정합니다.
  16. 매장 4에 eluate ° C에서 시간의 긴 기간 동안 최대 24 시간까지 또는 -20 ° C에서. prefilter의 eluate는 별도로 병원균에 대한 분석이나 유리 양모 필터 eluate과 결합 할 수 있습니다.

5. 대표 결과

병원체 물의 탁도 수준 (NTU) 금액 시드 / L B, C, D % 복구 ± 1 SD 숫자 독립 평가판
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III 0.5 500 81% ± 11 7
힘들어바이러스 Poliovirus 세이빈 III 0.5 5000 67% ± 12 8
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III 215 500 59% ± 32 7
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III 215 5000 38% ± 22 6
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III 447 500 56% ± 18 8
Enterovirus-Poliovirus 세이빈 III 447 5000 63% ± 37 8
Cryptosporidium parvum 0.5 5 38% ± 14 7
Cryptosporidium parvum 0.5 50 53% ± 19 8
울어ptosporidium parvum 215 5 40% ± 16 7
Cryptosporidium parvum 215 50 30% ± 6 6
Cryptosporidium parvum 447 5 33% ± 13 8
Cryptosporidium parvum 447 50 28% ± 11 8
살모넬라 enterica 0.5 5 29% ± 24 7
살모넬라 enterica 0.5 500 56% ± 16 8
살모넬라 enterica 215 5 32% ± 24 7
살모넬라 enterica 215 500 34% ± 11 6
살모넬라 enterica 447 5 34% ± 18 8
살모넬라 enterica 447 500 31% ± 24 8
  1. Nephelometric 탁도 단위
  2. 게놈 사본 / L로 qPCR가 열거 Enteroviruses
  3. C. parvum은 oocysts로 immunofluorescence가 열거
  4. S. enterica는 식민지 - 성형 단위로 문화가 열거

다양한 수상 turbidities 및 병원균 밀도와 표 1. 유리 양모 농도.

병원체 물 샘플 위치 금액 시드 / L % Reco 대단히
조류 독감 H5N2 Sundi 호수, 앵커리지 자치구 2500 42.9 %
조류 독감 H5N2 Minto 플래 츠, 페어 뱅크스 노스 스타 자치구 2500 36.7 %
조류 독감 H5N2 운반 밸리, 앵커리지 자치구 2500 7.8 %
조류 독감 H5N2 포터 마쉬, 앵커리지 자치구 2500 41.5 %
조류 독감 H5N2 윌로우 호수, 유콘-Koyukuk의 자치구 2500 15.5 %
  1. 게놈 사본 / L로 qPCR로 측정

조류 독감 바이러스의 표 2. 유리 양모 농도는 알래스카에서 다섯 사이트에서 물을 사용합니다.

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그림 1. 글라스 울 와셔의 다이어그램. 이것은 rinsing에서 시간을 절약하는 대신 양동이에 사용될 수있다. 개념은 유리 피펫 세척기와 비슷합니다.

그림 2
연동 펌프에 의한 산성 주입과 그림 2. 유리 울 여과. 펌프 튜브가 물이 수돗물과 글라스울 필터 사이의 샘플 라인에 산성을 소개하는 "T"커넥터가 있습니다. 샘플 물이 산도에게> 7.5가있는 경우에만 산도 조정이 필요합니다.

유리 양모 필터는 탁도 수준과 병원균 밀도 (표 1) 다양한으로 물로부터 병원균을 집중에 효과적입니다. 이것을 테스트하려면 dechlorinated 수돗물 20리터은 탁도의 원하는 수준을 달성하기위한 건조 미사 롬 토양 (0, 1.27, 또는 2.75 G / L)과 혼합하고 다양한 밀도의 병원균으로 놓는되었다. 물글라스 울 필터 통과되었다 eluate에 집중 병원균은 열거하고,이 값은 퍼센트 복구 계산에서 분자였다되었다. , %의 복구 계산의 분모입니다 물,,에 놓는 병원균의 양을 먼저 다음 병원체를 열거하는 부정적인 eluate로 병원균을 퍼뜨리고에 의해 결정되었다. 부정적인 eluate는 필터를 통해 unseeded 20리터 샘플을 전달하고 eluting에 의해 준비되었다. 부정적인 eluate에 놓는 병원균을 Quantifying 것은 유리 양모 필터에 의해 만들어진 매트릭스의 차이에서 발생할 수있는 병원균 열거의 차이가 발생하지 않습니다. qPCR에 의한 병원균을 quantifying이 단계의 중요성은 Lambertini 외에 설명되어 있습니다. 3. 20리터 부정적인 컨트롤 샘플 퍼센트 복구 계산을 먹이고 수도 네이티브 병원균의 존재가 없었 결정하는 글라스 울 여과를 통해 집중되었다. 10 μm의 공칭 기공 크기 prefilter w탁도 수준이 ≥ 215 NTU 때 같이 사용됩니다.

Poliovirus은 Lambertini 외에 설명되어. 3 차 농축 및 핵산 추출 절차 및 primers와 프로브를 사용하여 실시간 qPCR에 의해 계량되었다. Cryptosporidium parvum은 poliovirus를위한 보조 농도 절차에서 만든 최종 농축 시료 부피 (FCSV) 논리적으로 양이되었다 . Oocysts은 immunofluorescence (MeriFluor CryptosporidiumGiardia 탐지 키트, 메리디안 생명 과학 주식 회사, 신시내티, OH)에 의한 시각 있었다. 살모넬라 enterica는 XLD 한천로 도금하여 FCSV 논리적으로 양이 (Remel, Lenexa, KS) 및 집계되었다 식민지 - 성형 - 단위.

유리 양모 필터는 조류 독감 바이러스 (표 2) 집중에 효과적입니다. 낮은 pathogenicity 조류 독감 바이러스 (H5N2)는 알래스카의 여러 위치에서 물에 놓는 및 abov을 설명한대로 %의 복구 계산전자. 차 집중과 핵산 절차 poliovirus 대한으로 수행되었다; 바이러스 Spackman 외에 설명된 primers와 프로브를 사용 qPCR하여 계량되었다 4.

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Discussion

유리 양모 필터와 같은 완료 식수 7 지하수 8,9, 표면 물 10, 바다 물 11, 폐수 12 등 물의 다양한 소스에서 인간 장용 바이러스를 집중 여러 연구 팀으로 3,5,6에서 사용하고있다 농업 결선 13. 여기 필터는 또한 조류 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 세균 및 병원체 protozoan 각각 살모넬라 enterica (serovar Typhimurium)와 Cryptosporidium parvum을 집중의 효과가보고합니다. Deboosere 외. 조류 독감 바이러스는 14도 최근 보고된 글라스울 농도.

필터들은 물 매트릭스의 넓은 범위에서 사용할 높은 휴대용, 저렴하고 waterborne 병원균의 여러 유형을 집중에 대한 효과는 점에서 유리합니다. 그들은 연구의 요구에 따라, 어떤 크기로 구축하실 수 있습니다. 소독 후이온, 필터 하우징은 재사용입니다.

유리 양모 필터는하지만, 그렇게는 제한이 있습니다. 바이러스 흡착 (예 : 1MDS 필터, CUNO 주식 Meriden, CT)에 대한 electropositively 청구 미디어에 의존하는 바이러스 농도 방법과 마찬가지로 필터 효과는 주위 물의 산도에 따라 달라집니다. 저희 연구실에서는 물의 산도가 지속적으로 샘플링 중에 필터 입력 라인에 0.25 M HCL을 펌핑하여 하향 조정되는 위, 컷 - 오프로 산도 7.5을 선택하셨습니다. 높은 산도의 바닷물은 pH의 조정없이도 ​​샘플이지만 필터 효과 3의 비용으로 할 수 있습니다. 또 다른 제한은 선반 생활이다. 우리는 4에서 저장된 필터 보여주 병원균 농도 효과가 (미발표 자료) 거절하지 못하는 6 주나 ° C에서. 그럼에도 불구하고, 긴 저장 시간은 우리가 30 일 이내 필터 나이가 사용하지 않는 데이터의 품질을 향상시키기 위해, conservatively 때문에 테스트된 것은 아닙니다. 일반적으로 필터는 필요에 따라 만들어집니다. 일부 countrie의 또 다른 잠재적인 장애물s의 이전 논문에서 지정한 프랑스 소스의 글라스 울을 획득하고 있습니다. 최근, 우리는 표준 unfaced 유리 섬유 절연을 증명하는 것은 동등하게 효과적이며, 이것은 (자료 목록을 온라인으로 참조) 하드웨어 또는 홈 개선 스토어에서 쉽게 사용할 수 있습니다.

모든 실험 들어, 컨트롤의 두 세트, 글라스 울 필터는 필터와 같은 설계 작동되도록 건설 및 복구 관리하는 동안 오염되지 않은 않도록 장비 공백을 실행하는 것이 중요합니다. 이러한 컨트롤은 어떤 waterborne 병원균 농도 방식을 위해 필요합니다.

글라스 울 필터를 사용하면 수도꼭지에 부착하고 수도꼭지를 켜기처럼 간단하거나 펌프, 산도 조정, 그리고 막힘을 방지하기 prefilter을 필요로하는, 원격 위치에 침전물 - 라덴 강을 샘플링처럼 복잡 될 수 있습니다. 우리의 연구 그룹의 경우 유리 양모 필터 사용의 가장 큰 장점은 물 샘플의 수천을 수집하고 분석하는 기능입니다13,15보다 비용이 많이 드는 복잡한 방법으로 가능하지 않다고 말하는 환경에서 병원체 풍요로움과 배포에 데이터를하였으며 인간과 가축 병원균, 대한의.

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Disclosures

관심 분야의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는 비디오를 해설을 위해 윌리엄 T. Eckert 감사드립니다. 글라스 울 프로토콜의 개발은 미국 EPA는 스타 그랜트 R831630로부터 자금 장용 위험 (WAHTER 연구)에 대한 위스콘신 물과 건강 평가판의 일부였다. 알래스카 샘플은 US 지질로부터 재정 지원으로 A. 리브스, A. Ramey,와 B Meixell이 수집되었다. 무역, 제품 또는 회사 이름의 사용을 설명용으로만 사용되며 미국 정부에 의한 승인을 의미하지는 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-500
Sodium hydroxide Fisher Scientific BP359-212
Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic Fisher Scientific BP358-212 BP363-500 BP362-500
Sodium hypochlorite i.e., household bleach Clorox
Sodium thiosulfate, anhydrous Fisher Scientific S 475-212
Beef extract, desiccated BD Biosciences 211520
Glycine Fisher Scientific G46-500
Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation Johns Manville Bourre 725 QN
Polypropylene mesh Industrial Netting xN4510
2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple Grainger 6MW35
2" Sch 40 PVC cap Grainger 5WDW3
Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") US Plastic Corp. 62178
Sample bottles for eluate- 1 liter Fisher Scientific 03-313-4F
60 mL syringe Fisher Scientific NC9661991
pH strips Whatman, GE Healthcare 2614 991
Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 μm McMaster-Carr 4411K75
Prefilter housing Cole-Parmer S-29820-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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면역학 이슈 61 조류 독감 바이러스 환경 샘플링 Cryptosporidium 병원체 집중력 살모넬라균 waterborne 질환 waterborne 병원균
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Millen, H. T., Gonnering, J. C.,More

Millen, H. T., Gonnering, J. C., Berg, R. K., Spencer, S. K., Jokela, W. E., Pearce, J. M., Borchardt, J. S., Borchardt, M. A. Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3930, doi:10.3791/3930 (2012).

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