Summary
Os filtros de lã de vidro têm sido utilizados para concentrar os vírus pela água por um número de grupos de pesquisa em todo o mundo. Aqui, mostramos uma abordagem simples para a construção de filtros de lã de vidro e demonstrar os filtros são também eficazes na concentração waterborne virais, agentes patogénicos bacterianos e protozoários.
Abstract
O primeiro passo fundamental na avaliação de níveis de patógenos em água contaminada suspeita é a concentração. Métodos de concentração tendem a ser específicas para um determinado grupo patógeno, por exemplo Ambiental dos EUA Método Agência de Protecção 1623 para Giardia e Cryptosporidium 1, o que significa que vários métodos são necessários se o programa de amostragem é a segmentação mais do que um grupo patógeno. Outra desvantagem dos métodos actuais é o equipamento pode ser complicado e caro, por exemplo, o método VIRADEL com o filtro de cartucho para a concentração de vírus 1MDS 2. Neste artigo vamos descrever como construir filtros de lã de vidro para a concentração de agentes patogênicos. Após eluição do filtro, o concentrado é passível de um passo de concentração em segundo lugar, tal como centrifugação, seguido por detecção de agentes patogénicos e enumeração por métodos de cultura ou molecular. Os filtros têm várias vantagens. A construção é fácil e os filtros podem ser construídos para umny tamanho para atender aos requisitos específicos de amostragem. As peças de filtro são baratos, tornando possível a recolha de um grande número de amostras, sem que prejudica gravemente a um orçamento do projecto. Grandes volumes de amostra (100S a 1.000 s L) pode ser concentrada, dependendo da taxa de entupimento de turvação da amostra. Os filtros são altamente portátil e com o mínimo de equipamento, tais como uma bomba e medidor de fluxo, eles podem ser implementados no campo para a amostragem de água potável acabado, água de superfície, a água subterrânea, e do escoamento agrícola. Por último, o vidro de filtração lã é eficaz para a concentração de uma variedade de tipos de organismos patogénicos para que apenas um método é necessário. Aqui nós relatamos sobre a eficácia do filtro em concentrar enterovirus humano por via aquática, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum e vírus da gripe aviária.
Protocol
1. Preparação da Lã de Vidro
- Antes e depois fazendo com que cada lote de filtros, esterilizar a área de trabalho com uma solução de lixívia a 10%.
- Coloque luvas e jaleco. Esterilizar um balde em autoclave a 121 psi e 15 ° C durante pelo menos 20 minutos. Coloque a lã de vidro no balde estéril.
- Saturar a lã de vidro com água de osmose reversa e deixe de molho durante 15 minutos.
- Escorra a água de osmose reversa do balde.
- Saturar a lã de vidro com 1 M de HCl e deixe de molho durante 15 minutos.
- Escorra a 1 M HCl do balde.
- Lavar a lã de vidro com água de osmose reversa.
- Misturar bem.
- Verificar o pH usando papel de pH e repetir a água de osmose inversa enxaguamento até um pH neutro é alcançada.
- Deitar fora a água do enxágüe.
- Saturar a lã de vidro com 1 M de NaOH e deixe de molho durante 15 minutos.
- Escorra a 1 M NaOH do balde.
- REPEAT a osmose inversa enxaguamento até um pH neutro é alcançada.
- Deitar fora a água do enxágüe.
- Em vez de um balde, uma anilha de lã de vidro pode ser construído, que é semelhante em desenho para uma máquina de lavar pipeta de vidro (Figura 1).
- Cobrir a lã de vidro completamente com fosfato estéril tamponado salino (PBS), ajustada a pH 6,8.
- Use lã de vidro preparada imediatamente ou armazenar a 4 ° C. Pode ser armazenado por até duas semanas. Antes de usar, certificar-se o pH é neutro uma vez que irá aumentar com o tempo. Se o pH não é neutro, re-lavar com fosfato estéril salino tamponado (pH 6,8).
2. Montagem do Filtro Lã de Vidro
- Perfurar um furo 11/16 polegadas em as tampas de PVC e fios de torneira para os encaixes de nylon machos adaptador pode ser aparafusado no tampões. Esta etapa é necessária apenas para a primeira assembléia. Depois disso, os tampões podem ser utilizados para ano. Aplicar Teflonfita para os fios de nylon ferragens e parafusos para as tampas.
- Embale o tubo de PVC com pequenos pedaços de lã de vidro. Use um êmbolo de metal, como uma válvula de motor de carro, para embalar apertado. Embalagem não requer muita força. Embale apertado o suficiente para que a lã de vidro permanece no lugar e os canais não fazem. No entanto, não embalar tão bem a água não pode fluir através do filtro. Quando embalada de forma adequada, uma taxa de fluxo de 4 a 5 litros por minuto deve ser atingido quando o filtro está ligado a torneiras de água com pressões entre 40-60 psi. Para o tamanho de tubo de PVC especificado neste protocolo, cerca de 85 gramas de lã de vidro lavados e embalados é usado por tubo. Tara o tubo de PVC vazio em um equilíbrio de carregamento superior e embalagem com lã de vidro lavado até que a massa do tubo aumenta 85 gramas.
- Inserir tela de polipropileno no tampas de PVC com conexões para o adaptador macho de nylon ligados.
- Aplicar fita de Teflon para as porções roscadas do tubo de PVC.
- Parafuso com tampas de PVC para a p PVCipe e uma extremidade de etiqueta filtro o influxo ea outra extremidade a saída. Isto é importante mais tarde para a etapa de eluição. Que final é rotulado entrada não importa.
- Empurrar 60 ml de fosfato estéril salino tamponado (pH = 6,8) para dentro do filtro usando um cateter de ponta de uma seringa. Excesso sairá extremidade oposta.
- Enrole firmemente termina com Parafilm para evitar fugas. Os filtros podem ser armazenadas até 30 dias a 4 ° C.
3. Amostragem
- Esterilizar tubos utilizados para a amostragem por recirculação ou imergindo itens durante 30 minutos, 0,525% NaClO (isto é, uma solução a 10% de lixívia doméstica padrão). Segue este por drenagem da solução de hipoclorito e neutralizar com tiossulfato de sódio 0,05%, feita pela adição de 25 mL de uma solução a 2% de tiossulfato de estoque de sódio anidro para um litro de água de osmose inversa.
- Para a água da amostra com um pH superior a 7,5, ajustar o pH a entre 6,5 e 7,0 com HCl. Concentração de HCl pode variar de 0,25M para 1 M. Quatro litros HCl 0,5 M é geralmente suficiente para dois 800 amostras litro, dependendo do pH do ambiente da água e capacidade de tamponamento. Injectar HCl durante a amostragem utilizando uma bomba peristáltica ou Venturi (Figura 2). Ajustar a velocidade da bomba ou Venturi abertura para atingir o pH alvo. Medir o pH na linha de saída de amostra, utilizando um medidor de pH de campo.
- Utilizar um pré-filtro, se as obstruções lã de vidro de filtro a partir de água com turvação elevada. (Especificações para o pré-filtro eo seu alojamento estão na linha lista de materiais.) Devido agentes patogénicos pode ser ligado a partículas retidas pelo pré-filtro deve ser eluída juntamente com o filtro de fibra de vidro (ver abaixo).
- Ajustar a taxa de fluxo para entre 2 e 4 litros / minuto. Volumes de amostra típicos são entre 200 e 1500 litros.
- Desligue o filtro de lã de vidro e armazenar em um saco de plástico estéril a 4 ° C durante até 48 horas.
4. Eluição
- Apor o filtro de lã de vidro para um anelficar com a extremidade de influxo amostra apontando para baixo dentro de uma garrafa de polipropileno. Eluir oposta da direcção do fluxo de amostra.
- Empurrar 80 mL de extracto de carne estéril de 3% em 0,05 M de glicina com um pH de 9,5 para dentro do filtro.
- Aguarde 15 minutos.
- Empurrar outro mL 80 de extracto de carne estéril de 3% em 0,05 M de glicina com um pH de 9,5 para dentro do filtro.
- Empurre o filtro de ar completa até espuma sai da entrada do filtro.
- Ajustar o pH eluato entre 7,0 e 7,5 com 1 M de HCl.
- Eluato Armazenar a 4 ° C durante até 24 horas ou à temperatura de -20 ° C durante períodos de tempo mais longos.
- Eluir a pré-filtro, se uma for usado. Desparafuse a parte superior da carcaça do cartucho e deitar fora toda a água residual dentro do invólucro, mantendo o pré-filtro no lugar com luvas esterilizadas.
- Remover o pré-filtro do cartucho de habitação e colocá-lo em um "x 6" 15 saco zip-lock.
- Verter 200 mL de extracto de carne estéril de 3% em 0,05 M glycine com um pH de 9,5 para dentro do saco e selar de forma segura com o zip-lock.
- Inverta a pré-filtro ensacado várias vezes para assegurar a totalidade da superfície entra em contacto com o extracto de carne de vaca.
- Espere 15 minutos, invertendo e massageando o pré-filtro ensacado.
- Abra o zip-lock. Segure o saco em torno do pré-filtro com força para espremer como extrato de carne tanto quanto possível e puxe o pré-filtro estéreis com as mãos enluvadas.
- Verter o eluato extracto de carne dentro de uma garrafa de polipropileno.
- Ajustar o pH eluato entre 7,0 e 7,5 com HCl 1M.
- Eluato Armazenar a 4 ° C durante até 24 horas ou à temperatura de -20 ° C durante períodos de tempo mais longos. O eluato de pré-filtro pode ser analisada separadamente para agentes patogénicos ou combinado com o eluato de filtro de lã de vidro.
5. Os resultados representativos
| Patógeno | Nível de Água de Turbidez (NTU) uma | Quantidade Seeded / L b, c, d | Recuperação% ± 1 DP | Ensaios número independente |
| Enterovirus poliovirus Sabin-III | 0,5 | 500 | 81% ± 11 | 7 |
| Enterovírus Poliovírus-Sabin III | 0,5 | 5000 | 67% ± 12 | 8 |
| Enterovirus poliovirus Sabin-III | 215 | 500 | 59% ± 32 | 7 |
| Enterovirus poliovirus Sabin-III | 215 | 5000 | 38% ± 22 | 6 |
| Enterovirus poliovirus Sabin-III | 447 | 500 | 56% ± 18 | 8 |
| Enterovirus poliovirus Sabin-III | 447 | 5000 | 63% ± 37 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 5 | 38% ± 14 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 50 | 53% ± 19 | 8 |
| Chorarptosporidium parvum | 215 | 5 | 40% ± 16 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 50 | 30% ± 6 | 6 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 5 | 33% ± 13 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 50 | 28% ± 11 | 8 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 5 | 29% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 500 | 56% ± 16 | 8 |
| Salmonella enterica | 215 | 5 | 32% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica 215 | 500 | 34% ± 11 | 6 | |
| Salmonella enterica | 447 | 5 | 34% ± 18 | 8 |
| Salmonella enterica | 447 | 500 | 31% ± 24 | 8 |
- Unidade de Turbidez nefelometria
- Enterovírus enumerados por qPCR como cópias de DNA genômico / L
- C. parvum enumerados por imunofluorescência como oocistos
- S. entérica enumerados por cultura como formadoras de colónias-unidades
Tabela 1. Concentração de lã de vidro com turbidez da água e densidades diferentes patógenos.
| Patógeno | Localização amostra de água | Valor Seeded / L a | Reco% muito |
| Avian Influenza H5N2 | Sundi Lake, Anchorage Borough | 2500 | 42,9% |
| Avian Influenza H5N2 | Minto Flats, Fairbanks North Star Borough | 2500 | 36,7% |
| Avian Influenza H5N2 | Portage Valley, Anchorage Borough | 2500 | 7,8% |
| Avian Influenza H5N2 | Potter Marsh, Anchorage Borough | 2500 | 41,5% |
| Avian Influenza H5N2 | Willow Lake, Borough Yukon-Koyukuk | 2500 | 15,5% |
- Medido por qPCR como cópias de DNA genômico / L
Tabela 2. Concentração de lã de vidro de vírus da gripe aviária usando água de cinco sítios no Alasca.
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Figura 1. Diagrama de máquina de lavar lã de vidro. Isto pode ser usado em vez de um balde, poupando tempo de lavagem. O conceito é semelhante a uma anilha pipeta de vidro.
Figura 2. Filtração lã de vidro com injecção de ácido por meio de bomba peristáltica. Observe o "T" conector onde a tubulação da bomba apresenta ácido para a linha de amostra entre a torneira da água e filtro de lã de vidro. o ajuste do pH é necessária apenas se a água amostrada tem um pH> 7,5.
Os filtros de lã de vidro são eficazes na concentração agentes patogénicos a partir de água com uma ampla gama de níveis de turvação e densidades patógeno (Tabela 1). Para testar isto, 20 litros de água declorada foi misturada com o solo seco lodo marga (0, 1,27, ou 2,75 g / L) para atingir o nível desejado de turvação e, em seguida, semeada com agentes patogénicos em várias densidades. A águafoi passado através de um filtro de lã de vidro, os agentes patogénicos concentradas no eluato foram enumerados, e este valor foi o numerador no cálculo de recuperação por cento. A quantidade de agentes patogénicos semeadas em água, isto é, o denominador do cálculo de recuperação por cento, foi determinada por primeiro semeando os agentes patogénicos em um eluato negativo, então enumerar os agentes patogénicos. O eluato negativo foi preparado pela passagem de uma amostra de 20 litros unseeded através de um filtro e de eluição. A quantificação dos agentes patogénicos semeadas em um eluato negativo evita diferenças na enumeração patógeno que poderiam resultar das diferenças matriz criada pelo filtro de lã de vidro. A importância deste passo na hora de quantificar patógenos por qPCR é discutido em Lambertini et al. 3. Uma amostra de controlo 20 litros negativo foi concentrada através de filtração em lã de vidro para determinar havia nenhum presente patógenos nativo que pudessem confundir o cálculo de recuperação por cento. A 10 uM nominal de poro de tamanho pré-filtro wtal como utilizado quando o nível de turbidez foi ≥ 215 NTU.
Poliovírus foi quantificada por tempo real qPCR utilizando a concentração secundária e procedimentos de extracção de ácidos nucleicos e os iniciadores e sonda descrita no Lambertini et al. 3. Cryptosporidium parvum foi quantificada no volume de amostra final concentrado (FCSV) criado pelo procedimento de concentração secundária para poliovírus . Oocistos foram visualizadas por imunofluorescência (MeriFluor Cryptosporidium e Giardia Detecção Kit, Life Science Meridian, Inc., Cincinnati, OH). Salmonella entérica foi quantificada no FCSV por plaqueamento em agar XLD (Remel, Lenexa, KS) e contando colónia-forming- unidades.
Os filtros de lã de vidro são eficazes na concentração de vírus da influenza aviária (Tabela 2). Baixa patogenicidade do vírus da gripe aviária (H5N2) foi semeado em água a partir de vários locais do Alasca e do percentual de recuperação calculado conforme descrito Above. Concentração secundária e procedimentos de ácidos nucleicos foram realizados como para o poliovírus, o vírus foi quantificada por qPCR utilizando os primers e sondas descritas no Spackman et al 4.
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Discussion
Os filtros de lã de vidro têm sido usadas por vários grupos de pesquisa 3,5,6 a concentrar-se humanos vírus entéricos de uma variedade de fontes de água, tais como água potável terminado 7, a água subterrânea 8,9, água de superfície 10, a água do mar 11, as águas residuais 12, e escoamento agrícola 13. Relatamos aqui os filtros são também eficazes na concentração de vírus de influenza aviária, bem como os agentes patogénicos bacterianos e protozoários Salmonella entérica (serovar Typhimurium) e Cryptosporidium parvum, respectivamente. Deboosere et al. Concentração de lã também informou recentemente copo de vírus da gripe aviária 14.
Os filtros são vantajosos na medida em que eles são baratos, altamente portátil, utilizáveis em uma grande variedade de matrizes de água, e eficaz para a concentração de muitos tipos de agentes patogênicos. Eles podem ser construídas em qualquer tamanho, dependendo das necessidades de investigação. Depois de desinfectarion, carcaças de filtros são reutilizáveis.
Filtros de lã de vidro, no entanto, têm limitações. Tal como acontece com qualquer método concentração de vírus que se baseia em meios electropositively carregadas para a absorção do vírus (por exemplo, 1MDS filtro, CUNO Inc., Meriden, CT), a eficácia do filtro depende do pH da água ambiente. No nosso laboratório temos seleccionado pH 7,5 como o cut-off, acima do qual o pH da água é ajustada para baixo por continuamente bombagem 0,25 M de HCl para a linha de entrada do filtro durante a amostragem. Águas de pH mais elevados podem ser amostrados sem ajustamento de pH, mas à custa da eficácia do filtro 3. Outra limitação é vida de prateleira. Nós mostramos para filtros armazenados a 4 ° C durante seis semanas de que a eficácia concentração patógeno não diminuir (dados não publicados). No entanto, maior tempo de armazenamento não foram testados de modo, de forma conservadora, para garantir a qualidade dos dados, não use filtros com mais de 30 dias. Normalmente, os filtros são feitas como se necessário. Outro obstáculo potencial em alguns countries é a obtenção de lã de vidro a partir da fonte francesa especificado nos documentos anteriores. Recentemente, foi demonstrado padrão de isolamento de fibra de vidro unfaced é igualmente eficaz, e isso está prontamente disponível em lojas de hardware ou casa melhoria (ver Materiais lista online).
Para todas as experiências, é importante para executar dois conjuntos de controlos, um branco equipamento para assegurar filtros de lã de vidro não estavam contaminadas durante a construção e um controlo de recuperação para garantir os filtros funcionar como desenhado. Esses controles são necessários para qualquer método de concentração via aquática patógeno.
Usando um filtro de lã de vidro pode ser tão simples quanto ligá-la a uma torneira e ligar a torneira ou tão complicada como a amostragem de sedimentos de um rio carregado de em um local remoto, exigindo bombas, ajuste de pH e um pré-filtro para evitar entupimento. Para o nosso grupo de pesquisa, o maior benefício do uso de filtros de lã de vidro é a capacidade de coletar e analisar milhares de amostra de águas para patógenos humanos e animais, produzindo dados sobre a abundância e distribuição do patógeno no ambiente que não teria sido tão viável com mais dispendiosos, complicados métodos 13,15.
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Disclosures
Não há conflitos de interesses declarados.
Acknowledgments
Agradecemos William T. Eckert para narrar o vídeo. Desenvolvimento do protocolo de lã de vidro fez parte da água Wisconsin e Julgamento de Saúde para Riscos entéricos (WAHTER Study), financiado pela EPA dos EUA ESTRELA Grant R831630. Alaska amostras foram coletadas por A. Reeves, A. Ramey e Meixell B. com apoio financeiro do USGS. Qualquer utilização dos nomes de comércio, produto ou empresa é apenas para fins descritivos e não implica o endosso pelo governo dos EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrochloric acid |  Fisher Scientific |
A144-500 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific |
BP359-212 | |
| Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic | Fisher Scientific |
BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Sodium hypochlorite i.e., household bleach | Clorox |
||
| Sodium thiosulfate, anhydrous | Fisher Scientific |
S 475-212 | |
| Beef extract, desiccated | BD Biosciences |
211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific |
G46-500 | |
| Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation | Johns Manville |
Bourre 725 QN | |
| Polypropylene mesh | Industrial Netting |
xN4510 | |
| 2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple | Grainger |
6MW35 | |
| 2" Sch 40 PVC cap | Grainger |
5WDW3 | |
| Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") | US Plastic Corp. |
62178 | |
| Sample bottles for eluate- 1 liter | Fisher Scientific |
03-313-4F | |
| 60 mL syringe | Fisher Scientific |
NC9661991 | |
| pH strips | Whatman, GE Healthcare |
2614 991 | |
| Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 μm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Prefilter housing | Cole-Parmer | S-29820-10 |
References
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