Summary
成人臍orangeworm（の電気生理学的応答の測定による急速に画面宿主植物揮発性物質の方法
Abstract
植物揮発性物質は、植物 - 昆虫の相互作用において重要な役割を果たしている。草食性の昆虫は、宿主植物を見つけるためにkairomonesとして知られている植物の揮発性物質を、使用しています。1,2宿主植物が害虫による重要な農業商品食害が農家に深刻な経済的損失を与えることがあるとき。したがって、kairomonesはルアーまたは混乱させるこれらの昆虫を、従って、昆虫制御のための農薬への環境に優しい代替を提供する誘引として使用することができます。3残念なことに、植物は季節に依存して排出量の組成物との比率を変化させた膨大な数の揮発性物質を放出することができます商品や一日の時間の。これは、揮発性成分の生物学的活性成分または混合物の識別困難なプロセスになります。宿主植物揮発性の排出量の生物活性成分を識別するために我々は、実験室ベースのスクリーニングアッセイelectroantennography（EAG）を採用しています。 EAGの評価およびrecorするための効果的なツールです。dの電気生理学的に彼らの触角の受容体を介して、昆虫の嗅覚応答。 EAGスクリーニングプロセスは、有望な生物活性成分を識別するためにテストされ揮発性物質の数を減らすことができます。しかし、EAGバイオアッセイは、受容体の活性化に関する情報を提供します。それは化合物が誘発する昆虫行動のタイプに関する情報を提供していません。行動反応の誘引、忌避剤または他のタイプのようになります。 EAGにより、大幅な応答を誘発する揮発性物質は、適切な陽性対照に比べて、一般的に害虫の行動反応の更なる試験へ取得されます。実験デザインは提示します詳細単一のコンポーネントとバイオアッセイをEAGによるコンポーネントの単純なブレンドに成人害虫へそorangeworm（Amyelois transitella）の電気生理学的触角応答の測定による4,5アーモンドベースのホスト植物の揮発性物質をスクリーニングするために採用の方法論。方法は2つの元を利用してcisedアンテナは "フォーク"電極ホルダーの両端に配置。ここで示したプロトコルでは、スクリーニングの揮発性のための迅速、高スループットの標準化手法を提案する。刺激レベルを標準化し、したがって、触角応答が相対chemoreceptivityを示すことができるようにするために、各揮発性のセット、一定量である。ネガティブコントロールは、パフの両方残留溶媒及び機械的な力への電気生理学的反応をなくすことができます。ポジティブコントロール（このインスタンスのアセトフェノンの）男性と女性のへそorangeworm（NOW）蛾から一貫した応答を誘発した単一化合物である。男性NOW蛾で一貫した応答を提供し、バイオアッセイ研究のために使用される追加セミオケミカル標準では（Z、Z）-11,13-hexdecadienal、女性生産さフェロモンからアルデヒド成分6-8です。
Protocol
1。スクリーニングEAGのために宿主植物から検出された揮発性物質の調製
- GC-MSを介してすべての揮発性物質の適切な識別と認証した後、各利用可能な揮発性のEAGパフ分析を実行します。最初のスクリーニングでは、短時間で相対chemoreceptivity（ 表1）の指標を達成するためには、それぞれの性別のために触角応答の低複製数（N = 3-5）にすることができます。
- ペンタンで5 mg / mLの濃度で各揮発性の溶液を調製します。しっかりと密封して冷蔵し、サンプルをすぐに使用できる（例えば、アセトフェノン、密度= 1.03 g / mLで、体積=（0.005 g/1.03 g / mL）を1.0 mLのメスフラスコにアセトフェノンの×1,000 = 4.85μLまで、に希釈ペンタン1.0）を添加した。
- 直前EAG分析に、テストされる揮発性物質の5 mg / mLの濃度を含むバイアルを削除し、室温まで昇温することができます。一方、にパスツールピペットの適切な数のラベルを付けるテストするそれぞれの揮発性と相関し、ピペットの先端を上にパラフィルムの小片（約15×15 mm）をラップします。最初のスクリーニングのための10の刺激ピペット（それぞれ男性と女性のためのN = 4）が悪いPREPまたは他の予期しない障害が発生した場合にロードされます。
- ピンセットを使用して、静かにピペットに配置を容易にするために半分にバイオアッセイディスクを折り、その後部分的にカリフォルニアようにピペットの大きい方の端に折り畳まれたディスクを配置します。ディスクの2-3 mmで公開されています。ラックホルダーで標識し、整形処理ピペットの位置を合わせます。
- 、ピペットまたはシリンジを使用して、各ディスクに揮発性の溶液10μL（50μg）をロードし、2分が完全にピペットにディスクを挿入する前に渡すことができます。一度読み込まれると、すぐにパラフィルム（約15×30 mm）でピペットの端をシールします。ロードされ、チヤホヤされる揮発性の刺激の量が最も可能性が高い昆虫種によって異なります。
- 同じプロトコルに従えば、上述のようにコントロールを準備するそれぞれの分析に含まれています。各ディスク上にだけペンタンの負の制御負荷10μLのために、2分、標識されたピペットにロードし、シールを待ちます。陽性コントロールについては、ディスクに10μL（50μg）を読み込む2分待って、標識されたピペットにロードし、パラフィルムでシール。
- 昆虫触角準備の生存可能性が最も高い種によって異なりますが、我々はAmyelois transitellaアンテナは一般的に記述されたプロトコルを使って切除した後> 30分間アクティブで、一貫性を保つことを発見した。この時間は、一般的に評価される4月10日、揮発性サンプルに用にできるようになります。 表2は、時間とシーケンスの例を示します。
2。バイオアッセイをEAGのために昆虫触角の準備
- この実験の焦点は、分析をEAGされ、したがって、各研究者が適切に飼育昆虫へのアクセス権を持っていると仮定して。
- この実験のために私たちはオール3-4日を勉強されます。dは、雄と雌蛾を交配。個々の蛾は、分析の日、小さな蓋、プラスチック容器に転送されます。バイオアッセイの直前に、テストする蛾は、保持装置（すなわち、様々なプラスチックピペットチップから作られた）と、背後から担保に頭から転送されます。昆虫の操作は切除を容易にするために、低消費電力ステレオ顕微鏡下で観察することができます。
- アンテナは、ワイヤ先端のツールを用いてからかわれています。電極ゲルの小さなフィルムとフォークホルダーは、アンテナの迅速な転送のために近接して配置されます。最初のアンテナは、マイクロはさみを使って切り出し、フォークに配置し、アンテナのベースはフォーク以外の赤い部分（無関心接地電極）上に配置されたことを確認されています。 10分に設定されたタイマーが起動され、2番目のアンテナは、フォークの同じ側の両方の拠点を持つ最初のアンテナの隣に摘出して配置されます。
- また、アンテナはholdinの内に固定残ることがありますgのチューブは、摘出し、その後ゆっくりとチューブとエンドでのゲルのDABとワイヤ先端ツールを使用して、昆虫の間から削除されます。
- アンテナは、ベースと先端が電極ゲルを浸漬されず、泡がゲル中に存在しないようにチェックされます。終了/ヒントは、電極ゲルへの完全露出を保証するためにトリミングすることができます。ケアは、各アンテナの残りの部分は、このようにパフにさらされている最大の触角表面の面積を保証し、ゲルで覆われていないことを確認するために使用されるべきである。
- フォークは、プローブのプリアンプに挿入されている整形処理と10分間の待機期間の残り時間は200 mL / minで加湿空気の一定の流れの下で続けた。空気/パフフローの2〜3ミリメートルを向けるように調整されている物品、時間と開始時間をEAGは、記載されています（ 表2）、最初の刺激パフの前に30秒は、ポジティブコントロールを含むピペットは、封印されていないとホルダーに配置されアンテナを整形処理。
- 各exper後imentは、テスト蛾は、ドライアイスの環境で安楽死させ、適切に配置されている。
- 雌成虫は、交尾の状態を確認するには解剖されています。同居人の男性が交配したと想定されます。
3。個々のコンポーネントのEAGプロトコル
- 触角応答がSyntech EAG機器に付属してAutoSpikeソフトウェアを介して記録されます。 EAGのプローブを用いたチャネルのAutoSpikeのプロパティ]タブでの設定は、106.7のサンプリング·レート、NO修正し、0から42 Hzのフィルタに設定されています。 [フィルタ]タブでは、EAGフィルタがONになって、低カットオフを0.1 Hzに設定されています。
- 刺激パフは、持続時間1〜2秒です。 1分間のタイマーセットが各パフ後に開始されています。
- 次のテスト揮発性のピペットは、封印されていないとホルダーに配置されます。テストの揮発性の順序、ない試験化合物が一貫して別のテストでは、揮発性続かないことを確認するために実行する間にランダム化され、その後続いている（例えば、 表2）慎重にallowiパフの間にNG 1分。
- EAG応答の読み取りを容易にするため、定規の部分は、コンピュータの画面上に配置され、下方に偏向信号の頂点にベースラインレベルは、mm単位で測定され、5 mVの設定用データシート（すなわち、33ミリメートルで記録されます。 = 2.5 mV）で。ソフトウェアは、将来の分析のために保存された録音の再生能力を持っています。 mVまたはμVの振幅のいずれかにmmの変換後のデータ解析で実行されます。
- 最終的に陽性対照パフ（例えば、記録＃12）を投与された後、アンテナが削除され、フォークはエタノール飽和拭き洗浄およびその後の使用前に乾燥させる。
- アッセイのスループットを向上させるには、アンテナの次のセットの切除は、約10分現在の実験の終了前に第二研究室の担当者が開始することができます-第4パフした後、現在の実験の第二の試験は、揮発性は、 表の通り2。これは、foを許可するrを直接現在の実験の終了後、次の実験開始。
- 複製の数が多いが（別のアンテナの場合）、さらに統計的検証を提供するために、関心のある化合物で実行することができます。
4。ブレンドまたはその他の行列のEAGの分析の例（表3）
- 次に、二つの高等ブレンド（3成分混合物）の比とボリュームが高いEAG応答（ 表4）を誘発する揮発性物質の組み合わせ例を提供するために計算されます。 1時02分04秒の第二のブレンド比と比較して2 - フェニルエタノールとその後：2 - ウンデカノン：計算では、いくつかの基本的な比は、α-フムレンの1:1:1のモル比のためのものです。
- 類似したプロトコルは前述した使用して、混合物が調製され、標識されたパスツールピペットは、必要なポジティブコントロールとネガティブコントロールと一緒にロードされます。
- 揮発性の試料は、男性と女性のアンテナ全体でチヤホヤされ、応答を測定し、ログオンしているデータシート（ 表3）。
5。代表的な結果
女性のへそorangewormについては、以下の設定が使用されています。2秒のパフ、10秒の録音時間は、10番目のウィンドウ、5 mVのスケールを。負偏差は、典型的な応答ですが、まだ絶対値（例えば、-3400μVのたわみが3400μVとして記録されている）が記録されます。ポジティブコントロールの準備の比較的弱い応答は破棄されます。 図1は、へそorangewormによる陽性対照にレスポンスが悪いのグラフィカル表現を提供しています。
コントロール不良の結果の例については、アセトフェノンへの平均女性の触角応答は、通常はCAです。 2600μV（ 図2）、準備だけで、CAの応答を与えた場合。 1300μV、それは破棄され、アンテナの別のペアが整形処理されるだろう。同様に、平均的男性の応答は、（Z、Z）-11,13-hexadecadienalはtypicallでしたY 3000μVは、したがって、任意の応答未満1500μVは、通常は破棄されました。
各実験の開始と終了時にポジティブコントロールは、アンテナの状態に関する情報を提供します。ポスト·コントロール（レコード＃12、 表2）のパフに触角応答は、事前制御の第1回パフ（レコード＃1の75％未満のいずれかである場合、我々は迅速なスクリーニングについては、以下の経験則です。 、 表2）またはプリコントロール（レコード＃2、 表2）の第2パフ未満は、その後の実験準備の可能性劣化（ 図3）によるデータ解析に使用されていません。親指の最初のルールの例としては、レコード＃1になります= 2730μVとレコード＃12 = 1680μV、と親指の二番目のルールであればこれらのケースのそれぞれのレコード＃2 = 2350μVとレコード＃12 = 1680μV、 、準備、実験の結果は破棄されます。
Aとして陽性対照に測定EAG応答値を補正の代表的な例は次のようになります。
| ＃実行 | EAG（μV） | ＃2を実行します。 | EAG（μV） | ＃3を実行します。 | EAG（μV） |
| （+）Ctrlキー | 2800 | （+）Ctrlキー | 2420 | （+）Ctrlキー | 3030 |
| Cmpnd | 3000 | Cmpnd | 2500 | Cmpnd | 3440 |
| （ - ）Ctrlキー | 530 | （ - ）Ctrlキー | 755 | （ - ）Ctrlキー | 910 |
| Cmpnd B | 2400 | Cmpnd B | 2000 | Cmpnd B | 2560 |
| （+）Ctrlキー | 2770 | （+）Ctrlキー | 2400 | （+）コンベンションセンターリットル | 3020 |
N = 3の実験のために上記の値を使用して、負の制御応答は負の制御は機械的なパフと残留溶媒にベースライン触角の応答であるという仮定の下、各実験内のすべての値から減算されます。
| ＃1を実行します。 | EAG（μV） | ＃2を実行します。 | EAG（μV） | ＃3を実行します。 | EAG（μV） |
| （+）Ctrlキー | 2270 | （+）Ctrlキー | 1665 | （+）Ctrlキー | 2120 |
| Cmpnd | 2470 | Cmpnd | 1745 | Cmpnd | 2530 |
| （ - ）Ctrlキー | 0 | （ - ）Ctrlキー | 0 | （ - ）Ctrlキー | 0 |
| Cmpnd B | 1870 | Cmpnd B | 1245 | Cmpnd B | 1650 |
| （+）Ctrlキー | 2240 | （+）Ctrlキー | 1645 | （+）Ctrlキー | 2110 |
各実験のポジティブコントロールは、その後の平均値および1,000μVに補正のための比率に注目し、1,000μVに修正されるでしょう。データシート（例えば、Excelは）簡単に使用可能なデータへの応答を変換するために操作することができます。
| ＃1を実行します。 | 平均（μV） | ＃2を実行します。 | 平均（μV） | ＃3を実行します。 | 平均（μV） |
| （+）Ctrlキー | 2255 | （+）Ctrlキー | 1655 | （+）Ctrlキー | 2115 |
| （+）押しADJ。 | 1000（0.443） | （+）押しADJ。 | 1000（0.604） | （+）押しADJ。 | 1000（0.473） |
各実験の中で補正率を乗じて、化合物および化合物Bの値は、調整されます。
| ＃1を実行します。 | ADJ。 EAG（μV） | ＃2を実行します。 | ADJ。 EAG（μV） | ＃3を実行します。 | ADJ。 EAG（μV） |
| Cmpnd | 1094 | Cmpnd | 1054 | Cmpnd | 1197 |
| Cmpnd B | 828 | Cmpnd B | 752 | Cmpnd B | 780 |
各化合物の平均（手段）をして評価することができ、テスト化合物の他の関連する統計データとEAG応答と一緒に決定されますさらなる調査のための候補のために。
| 化合物 | EAG（μV） | いいえ、実行し、N = |
| A | 1115 | 3 |
| B | 787 | 3 |
図1のアンテナを確認した後、貧しい触角応答のために破棄される前の制御（第1回ポジティブコントロールパフ）オス触角応答（1,180μV）の代表EAGはゲルとの良好な接触を持っています。下部のウィンドウにある青いバーは、揮発性の2つの第2パフを表しています。 拡大図を見るにはここをクリック 。
図3女性の触角悪いと見なされるポスト·制御への応答（1,680μV）（各実験の最後のポジティブコントロール）と、アンテナの劣化（<75第1回前の制御の％または<を示唆するための代表EAGプリコントロールの第2パフ値）。この例では、第1回前の制御パフは、2730μVと2回前の制御パフは、2350μVであった。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
dflinebreak "> 
パフ期間中候補者揮発性のブレンドと最大初期たわみ（3,800μV）、初期勾配のその後の測定値のパフメス触角応答（3,800μV） 図4。代表EAG（0.3 s/1.2 MV = 0.25秒/ MV）、残りのパフ期間の傾き（1.6 mVのs/1.9 = 0.84秒/ MV）。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5。A.全体でチヤホヤされるサンプルマトリックスと関連した揮発性物質を含む小変更された容器transitellaアンテナ。
表1。s のAutospikeプログラムで異なると影響を受けにくい構成によって決定さノンパレルアーモンド（2007年）とEAG応答のITU揮発性放射。
表2。個々の揮発性成分にオスとメス触角応答を記録するためのフォームの例。
表3揮発性の混合物および/ または花束にオスとメス触角応答を記録するためのフォームの例。
表4。ブレンドの二つの異なる比率を5 mg / mLの溶液10 mLの調製の例。
表5。2 conseを記録するためのフォームの例男性と女性のアンテナにまたがる単一の揮発性成分のcutiveパフ。
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Discussion
標的昆虫の化学受容応答を決定するためのバイオアッセイとして電図の記録を使用するには、ガスクロマトグラム（GC-EAD）からの流出の検出器としてEAGを活用した研究は文献に記載されていますかなり一般的であり、数多くのです。9,10方法が示され相対的反応性を確信して割り当ての高い複製の揮発性成分に相当する量の迅速なスクリーニングを提供します。それは我々が"スクリーニング"の値としてここで紹介するアンテナ（ 図1-3）から、最大偏向振幅信号を提供することができるので、SyntechソフトウェアのAutoSpikeプログラムでは、スクリーニングの揮発性物質に適したプログラムです。さらに、半高度な使用のための他の基本的な情報（ 図4を参照）AutoSpikeコンフィギュレーション設定とどのような研究者が触角応答から派生したいに応じてで得ることができます。 GcEADまたはEagPro Syntechプログラムはアプリです。得られたトレースは、触角の脱分極応答の時間経過のより詳細を提供するので、より高度な実験のためにまたは電気生理学的応答に精通して科学者のためのropriate。
宿主植物から検出された化合物のスクリーニングプロセスに先立って、揮発性物質の適切な識別は重要であり、厳密なプロトコルに従ってください。可能であれば、異なる極性（すなわち、DB-WAXとDB-1）の2つのGCカラムは（RIS、 表1を参照）保持指標の一致を経由して最初のコンポーネントの識別に使用する必要があります。最良の方法は、2つの列に標準の認証と各揮発性の身元を確認することである11は、化合物のいくつかの識別が不可能な場合は、それらの生物活性の解明がまだGC-EADの使用によって達成することができます。ただし、12 、バイオアッセイのレプリケーションが揮発性の収集方法に応じて制限されることがあり、検体の量は、REAはありません内部標準なしdily利用可能な化合物のアイデンティティはすぐに知られていません。また、ブレンドの後続のテストは可能ではありません。
適切に密封して冷蔵する場合は、ペンタンの揮発性物質のソリューションは、通常約1週間保存することができます。ロードされたディスクを含む密閉されたピペットは、ジップロック袋に入れ、冷蔵されている場合、それらは約24時間保存することができます。しかし、我々はそれが最高のEAG分析の朝ディスクをロードし、適切に一日の終わりに残ってピペットを処分しました。関連文献が容易に利用できない場合に標準化されたパフのための用量は、それぞれの昆虫種に対して実験的に決定する必要があります。
ブレンドの配合は、一般的に骨の折れるプロセスです。包括的ではありませんとはいえ、いくつかの比較的単純なアプローチは、ここに示されています。研究者は様々なテクニックについてのさらなる読書を行うことをお勧めします。個々のコンポーネントresponsの評価後宿主植物の揮発性物質からのESが実行された、ブレンドの研究は実施することができます。一例としては、スクリーニングから、より高い相対的な応答を誘発する揮発性物質を使用しています。他の例は、次のとおりです。化合物、または生物季節ステージや行列のさまざまな状態（破損対破損していない）の揮発性の違いのクラスでソート放出される相対的な量で組み合わせが、相対的な反応に対する相対的な量の比率は、13。
実証ブレンドは、これらの様々なアプローチの単純な組み合わせです。 1時01分01秒は、初期スクリーニングで相対的に高い応答に基づいて第三の混合物であるだけでなく、化合物の様々なクラスを表しています。フムレンは、セスキテルペン、2 - ウンデカノンは、脂肪酸の分解産物であり、2 - フェニルエタノールはベンゼンである。これらの化合物は、一般的に植物の排出量で見られる揮発性物質の主要なクラスを表します。第二のブレンドで1時02分04秒の比率は、duを検出した揮発性成分の相対比が組み込まれていますリングGC-MS分析を。4しかしながら、SPMEおよびGC-MSの使用が唯一の相対比を提供し、化合物のクラスの検量線と一緒にGC-FID分析の使用は、比率のより正確な出発点とすることをお勧めします検出された揮発性物質に基づいています。
フォーク電極EAG技術は、電気生理学的実験に採用さより単純な方法の一つである14読者は、このメソッドを超えた高度なアプリケーションのためにさらに文献調査を行うために奨励されています。さらに、 域外行列のスクリーニングが実証方法を用いて行うが、（60mL）に小変更された容器（ 図5）を含む植物の部分（例えば、アーモンド）を利用することができます。大きな容器（例えば、EAGフグと併用するための特殊なアダプタを備えた120mLの蓋付き容器）を使用する場合は、コンテナの適切な避難を確保するため、流量を増やすことをお勧めします。実験shoulポジティブコントロールは、適切な刺激が必要な流量で達成されていることを確認するためにコンテナに配置されますここで、dを実行することができます。個々のコンポーネントの2つの第2パフの使用は絶対に必要なものではなく、0.5秒から1.0秒のオーダーのパフは、より典型的である。しかし、これらは通常より高い流量で長いパフを必要とするので、コンテナ揮発性の花束のパフで簡単に将来の比較のために許可しない。私たちのラボでは、小血管の行列（ 図5を参照）を使用して、パフに直接、単一の成分および/ またはブレンドの応答を比較するために2秒のパフを使用しています。これらの小型船舶に2秒のパフは、適切な流量が設定されているコンテナの完全な避難を確保します。
また、第パフの買収は、揮発成分の量は、厳密な規格（<で保管されなくなりましたので、しかし、二番目のパフは、スクリーニングのために絶対に必要ではありませんが、実行することができます強い>表5）。ただし、この情報は、後続の用量反応実験のために貴重かもしれません。一貫性のある応答は線量が高く応答のしきい値の近くにあることを示すかもしれないが15より低い応答は、低濃度まで減少した応答を示すことがあります。それは第二パフ〜14応答の変化の他の生理学的説明があるに留意すべきであるが、情報は今後の実験のための指導を助けるん。高スループットが絶対に重要でない場合は、各コンポーネントの第二のパフの使用が有益であることができます。
処女雌蛾が標的試料であれば、今すぐ最後の幼虫または蛹の幼虫は、性欲を刺激すると女性の出現は別々の容器で発生することができるように、16を分離することができます。
スケールの調整は、現在のスケールを超えた場合に触角応答に対応するために必要があるかもしれません。 EAGソフトウェア画面CA上のスケールnはμV応答ごとにどのように多くのミリメートルを決定する際に役立ちます。他の昆虫は、その感度が異なる場合があります。
実証方法は、宿主植物の揮発性物質の複雑な組成物から生物活性の検討のための揮発性物質の数を減らすために、習得が容易、迅速かつ信頼性の高い、ハイスループットスクリーニングプロトコルを提供します。に適した試験片のアンテナを提供し、フォークEAG方法は、多数の揮発性成分やコンポーネントのブレンド、および標準のそれへの応答の比較を迅速に評価可能になります。最終的に、フィールドの設定で、コンポーネントまたはコンポーネントのブレンドの活性を評価するバイオアッセイが最も有効な方法です。ただし、フィールドの研究では、多くの場合、高価で非常に時間と労力がかかる上に、適切な結果を得るために数ヶ月必要があります。
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Disclosures
著者は、パラマウント農業会社、Suterra LLCとのつながりを持つ企業との既存の共同研究開発契約を締結している。
Acknowledgments
本研究では、USDA-ARS CRISプロジェクト5325から42000-037-00Dの下とCRADA 58-3K95-7から1198とTFCA 58-5325-8-419の結果と実施した。作者は感謝して技術支援のために（Z、Z）-11,13-hexadecadienal、生産的な議論のためのB.ヒグビー、およびJ.ベイカーの贈り物にSuterraを認める。
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