Summary
一个迅速屏幕寄主植物挥发的成人肚脐orangeworm的电生理反应（测量方法
Abstract
植物挥发物发挥重要作用，在植物，昆虫相互作用。食草昆虫利用植物挥发物，如米蛾利他素，找到他们的寄主植物。1,2当寄主植物是一个重要农艺商品饲养害虫的损害，可以给种植者造成严重的经济损失。因此，米蛾利他素可以被用来作为这些昆虫引诱或混淆，因此，提供一个环境友好的替代杀虫剂控制昆虫的引诱。不幸的是，植物能发出不同的成分和比例的排放量取决于物候的一个巨大的数量挥发商品或一天的时间。这使得生物活性成分的鉴定或一个艰难的过程挥发性成分的混合物。为了帮助确定我们聘请的实验室为基础的筛选生物活性electroantennography（东亚运动会）的寄主植物挥发物的活性成分。东亚运动会是一个有效的工具来评估和recorð电生理通过他们的触角感受器的昆虫的嗅觉反应。东亚运动会的筛选过程，可以帮助减少一些测试，以确定有前途的生物活性成分的挥发。然而，东亚运动会的生物测定只提供有关受体激活的信息。它不提供有关昆虫行为的化合物引起的类型的信息，这可能是作为引诱剂，驱虫剂或其他类型的行为反应。挥发引出由东亚运动会上，相对适当的阳性对照显着的反应，通常采取进一步虫害的行为反应测试。实验设计将详细的方法来筛选基于杏仁寄主植物挥发物的触角电生理反应测量成人虫害肚脐orangeworm（Amyelois transitella）单部件和组件的简单混合物通过东亚运动会的生物活性4,5。该方法利用两个前cised天线置于整个一个“叉”的电极支架。这里展示的协议提出了一种快速，高通量筛选挥发物的标准化方法。每个波动是在一组，固定金额，以规范的刺激水平，从而使触角反应相对chemoreceptivity的指示。阴性对照，有助于消除粉扑残留溶剂和机械力的电生理反应。阳性对照组（在这种情况下苯乙酮）是一个单一的化合物，已引起了男性和女性的肚脐orangeworm（NOW）蛾的一致响应。一个的额外semiochemical标准，提供一致的响应，并用于生物活性的研究与男性现在蛾是（Z，Z）-11,13-hexdecadienal，从女性的生产性信息素醛组件。6-8
Protocol
1。东亚运动会筛选检测寄主植物挥发物的制备
- 适当的标识和认证通过的GC-MS挥发后，执行训练班粉扑每个可用挥发性分析。初步筛选可以是低复制数量为每个性别的触角反应（n = 3-5），以实现在很短的时间量（ 见表1）相对chemoreceptivity的指示。
- 准备在5毫克/毫升戊烷浓度的每一个波动的解决方案。紧紧密封和冷藏直到准备立即使用（例如，苯乙酮，密度= 1.03克/毫升，体积=（0.005 g/1.03克/毫升）×1,000 = 4.85μL到1.0 mL容量瓶苯乙酮和稀释样品用戊烷1.0毫升）。
- 只是之前东亚运动会的分析，取出小瓶含5毫克/毫升的浓度进行测试的挥发，使预热到室温。同时，标签的巴斯德移液器的正确数量相关的挥发性每次进行测试，并超过枪头包装的封口膜小片（约15×15毫米）。对初步筛选的10个刺激移液器（N = 4时为每个男性和女性）都装在一个坏的准备或其他不可预见的障碍事件。
- 使用镊子，轻轻折了一半的生物活性光盘，以便将吸管的位置，然后部分放入大底的吸管折叠，使CA光盘。 2-3毫米的光盘被曝光。在机架支架对齐标记和prepped移液器。
- 使用移液器或注射器，加载到每个盘的挥发性溶液10μL（50微克），并允许2分钟前通过完全插入吸管光碟。一旦加载，立即查封移液器年底，封口膜（约15×30毫米）。要加载和自高自大的挥发性刺激量将最有可能随种昆虫。
- 遵循相同的协议，上面提到的准备控制到包括在每一个分析。负控制负载10μL刚戊烷，到每张光盘，等待2分钟，装入标记移液器，密封。为阳性对照，10μL（50微克）加载到光盘上，等待2分钟，将标记吸管的负载，并用封口膜密封。
- 昆虫触角准备的可行性，将最有可能与物种而有所不同，但我们发现，Amyelois transitella天线通常保持活跃切除后30分钟使用所描述的协议和一致。这段时间内，一般会允许长达4-10挥发性样品进行评估。 表2提供了时间和序列的例子。
2。为筹备东亚运动会的生物活性昆虫触角
- 这个实验的重点是分析东亚运动会，因此，假设每个研究者将有机会获得适当的饲养昆虫。
- 在这个实验中，我们将学习3-4天OLD，交配的雄性和雌性飞蛾。个别飞蛾被转移到一个小的，有盖，塑料容器分析的日子。前夕的生物活性，被测试的蛾被转移到第一头控股仪器（即，从各种塑料移液器提示），从背后担保。昆虫可以被视为低功耗立体声方便切除显微镜下操作。
- 触须梳理出使用电线尖的工具。叉架，用电极胶的小电影，被放置在靠近天线的快速传输。第一天线采用微型剪刀切除，放在叉，叉（漠不关心的接地电极）非红色部分放在确保天线的基础上。一个10分钟的计时器集开始，第二个天线被切除，放在旁边的第一天线上叉同方的两个基地。
- 另外，天线可以离开担保范围内的牵着Ğ管，切除，然后轻轻地从管和昆虫，用导线尖端的工具，民建联上月底的凝胶。
- 触角检查，以确保基地和尖端沉浸在电极胶，无气泡凝胶。可以修剪完/提示，以保证充分暴露了电极凝胶。应谨慎使用，以确保每个天线的其余部分不与凝胶覆盖，从而保证最大触角表面积暴露粉扑。
- prepped叉，然后插入探头前置放大器和下恒定加湿空气流保持在200毫升/分钟的轮候时间为10分钟的剩余时间。指出的消费时间和东亚运动会的起始时间（ 见表2）和30秒之前，首先刺激粉扑，吸管含有阳性对照启封，并放置在持有人调整直接空气/粉扑流2-3毫米prepped触角。
- 经过各experiment，测试飞蛾安乐死在干冰环境，并妥善处理。
- 解剖检查雌蛾交配状态。同居的男性被认为已交配。
3。东亚运动会为单独的组件的议定书
- 触角反应记录通过用包含的Syntech东亚运动会仪器的AutoSpike软件。在与东亚运动会的探头通道的AutoSpike属性“选项卡的配置设置的106.7采样率，无以纠正，0-42赫兹的过滤器。对于“筛选”选项卡，东亚运动会的过滤器是ON和低截止到0.1 Hz。
- 刺激喷1-2秒。 1分钟设置一个定时器启动后，每个噗。
- 接下来的测试挥发性移液器启封，并放置在持有人。测试挥发随机之间的顺序运行，以确保没有测试化合物一贯遵循另一个测试挥发性（例如， 表2），随后仔细allowi纳克之间泡芙1分钟。
- 为了方便易于阅读EAG反应，统治者的部分放置在电脑屏幕上，顶点向下偏转信号的基线水平，以毫米测量和记录数据表（即33毫米为5 mV的设置， = 2.5毫伏）。该软件具有播放保存的录音，供日后分析的能力。 mV或μV的振幅毫米的转换进行分析后的数据。
- 决赛后，积极控制粉扑（例如，记录＃12）管理，被删除的触角，叉饱和乙醇擦拭清洗，并允许晾干后方可后续使用。
- ，以增加检测的吞吐量，可以切除触角下一组开始了第二次的实验室工作人员，目前的实验结束前约10分钟-之后的第四个粉扑;第二次测试，目前的实验中挥发，按表2。这将允许FOr为目前的实验结束后直接下一个实验的开始。
- 可以执行较高的重复数（在不同的天线），感兴趣的化合物，以提供进一步的统计验证。
4。东亚运动会的混合物或其他矩阵的分析为例（见表3）
- 接下来，两个大专混合物（3组分混合物）的比率和数量计算提供了一个例子引出的EAG反应（ 表4）相结合的挥发。计算一些基本比率，α-蛇麻烯摩尔比为1:1:1：2 - 十一酮：2 - 苯乙醇，然后比较第二次混合比例是1:2:4。
- 使用类似的协议中所述的混合物准备和标记巴斯德移液器加载必要的阳性和阴性对照，沿。
- 挥发性样品膨化跨越男性和女性的触角和响应测量和记录数据表（ 表3）。
5。代表结果
对于女性肚脐orangeworm的以下设置：2秒喷，10秒录音时间，10秒的窗口，和5 mV的规模。负偏差是典型的反应，但绝对值记录（如-3,400μV的偏转被记录为3400μV）。阳性对照的一个相对薄弱的准备响应将被丢弃。 图1提供了一个图形表示阳性对照由肚脐orangeworm的反应不佳。
例如，对于一个贫穷的控制效果，平均女性的触角，以苯乙酮的反应通常是CA。 2600μV（ 图2），如果只准备了CA的响应。 1300μV的，它会被丢弃，另一对触角prepped。同样，男性平均响应（z Z）-11,13-hexadecadienal是典型地Ÿ3000μV的;任何回应，因此，低于1500μV的，通常被丢弃。
在每个实验的开始和结束时的阳性对照，也提供了信息触角条件。我们快速筛查遵循一个法则是，如果触角反应后控制（记录＃12， 表2）粉扑或者低于75％的预控第一粉扑（记录＃1 ， 表2），或超过预控（纪录＃2， 表2）实验不使用的数据分析，由于可能退化的准备（ 图3） 第二粉扑。拇指的第一条规则的一个例子将记录＃1 = 2,730μV和记录＃12 = 1,680μV;和拇指的第二条规则，如果记录＃2 = 2350μV和记录＃12 = 1,680μV，在这些案件中的每个，准备和实验的结果将被丢弃。
一纠正EAG反应值作为衡量阳性对照的有代表性的例子如下。
| 运行＃ | 东亚运动会（μV峰） | 运行＃2 | 东亚运动会（μV峰） | 运行＃3 | 东亚运动会（μV峰） |
| （）CTRL | 2800 | （）CTRL | 2420 | （）CTRL | 3030 |
| CMPND一个 | 3000 | CMPND一个 | 2500 | CMPND一个 | 3440 |
| （ - ）CTRL | 530 | （ - ）CTRL | 755 | （ - ）CTRL | 910 |
| CMPND乙 | 2400 | CMPND乙 | 2000 | CMPND乙 | 2560 |
| （）CTRL | 2770 | （）CTRL | 2400 | （）中心升 | 3020 |
对于N = 3的实验上面的值，阴性对照反应在每个实验中减去阴性对照基线触角机械粉扑和溶剂残留的假设下，从每个值。
| 运行＃1 | 东亚运动会（μV峰） | 运行＃2 | 东亚运动会（μV峰） | 运行＃3 | 东亚运动会（μV峰） |
| （）CTRL | 2270 | （）CTRL | 1665 | （）CTRL | 2120 |
| CMPND一个 | 2470 | CMPND一个 | 1745 | CMPND一个 | 2530 |
| （ - ）CTRL | 0 | （ - ）CTRL | 0 | （ - ）CTRL | 0 |
| CMPND乙 | 1870 | CMPND乙 | 1245 | CMPND乙 | 1650 |
| （）CTRL | 2240 | （）CTRL | 1645 | （）CTRL | 2110 |
每个实验的阳性对照，然后将平均和纠正1000μV的，并为修正至1000μV的比例。数据表（如Excel）可以很容易地操纵转换成可用的数据。
| 运行＃1 | AVG（μV峰） | 运行＃2 | AVG（μV峰） | 运行＃3 | AVG（μV峰） |
| （）CTRL | 2255 | （）CTRL | 1655 | （）CTRL | 2115 |
| （+）CTRL形容词。 | 1000（0.443） | （+）CTRL形容词。 | 1000（0.604） | （+）CTRL形容词。 | 1000（0.473） |
校正比率乘以在每个实验中，化合物A和化合物B的值，然后调整。
| 运行＃1 | ADJ。东亚运动会（μV峰） | 运行＃2 | ADJ。东亚运动会（μV峰） | 运行＃3 | ADJ。东亚运动会（μV峰） |
| CMPND一个 | 1094 | CMPND一个 | 1054 | CMPND一个 | 1197 |
| CMPND乙 | 828 | CMPND乙 | 752 | CMPND乙 | 780 |
平均每个化合物（手段），然后确定，然后进行评估与其他相关统计数据和测试化合物的EAG反应候选人作进一步调查。
| 复合 | 东亚运动会（μV峰） | 号运行N = |
| 一 | 1115 | 3 |
| 乙 | 787 | 3 |
图1代表男性的触角反应（1,180μV），预先控制（1 ST阳性对照噗）将被丢弃后，确保触角的由于贫困触角响应东亚运动会与凝胶有良好的接触。在底部窗口的蓝色条代表的挥发性的第二粉扑。 点击这里查看大图 。
（1,680μV），女性的触角反应的控制后（去年为每个实验的阳性对照），将被视为穷人，触角退化（<75％1 日预控或暗示的代表东亚运动会< 图3。 第二预控粉扑值）。对于这个例子中，1 日预控粉扑是2,730μV至2 次，预控粉扑2350μV的。 点击这里查看大图 。
图4。女性的触角反应（3800μV），粉扑候选人挥发性混合，随后测量最大的初始挠度（3800μV），在粉扑时间初步斜率（代表东亚运动会0.3 s/1.2 MV = 0.25 / MV），其余粉扑时间的斜率（1.6 s/1.9 MV = 0.84 S / MV）。 点击这里查看大图 。
图5。小修改含有样品基质及相关挥发的船只，以张狂跨答transitella触角。
表1。 在S国际电联的挥发排放无敌的杏仁（2007年）和在不同的Autospike方案和较不敏感的配置决定EAG反应。
表2。形式记录个别挥发性成分的男性和女性的触角反应的例子。
表3。例如一个记录男性和女性的触角反应挥发性混合物和/或花束的形式。
表4。准备10毫升5毫克/毫升溶液两种不同比例的混纺的例子。
举例记录2 conse的形式表5。男性和女性的触角跨单一的挥发性成分cutive泡芙。
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Discussion
作为一种生物活性，以确定目标昆虫的化学感受反应电位录音使用相当普遍，许多可以利用探测器从气相色谱（GC-EAD）的污水作为东亚运动会的研究在文献中发现。9,10的方法证明将提供等量的挥发性成分与自信分配的相对响应的高重复的快速筛选。 AutoSpike在Syntech软件程序是为筛选挥发好的方案，因为它是能够提供最大挠度从天线的幅度信号（ 图1-3），这是我们这里提出的“筛选”的价值。此外，其他半利用先进的基本信息（ 见图4），可以得到与AutoSpike根据配置设置和研究者希望从触角反应派生。 GcEAD或EagPro Syntech方案是应用程序ropriate，因为由此产生的痕迹提供了更大的触角去极化反应的时间，当然更先进的实验或熟悉电生理反应的科学家。
从寄主植物中发现的化合物的筛选过程之前，挥发物的正确识别是很重要的，并应遵循严格的协议。如果可能的话，两个GC列不同的极性（即DB-WAX和DB-1）应被用于最初的成分标识，通过保留指数（RIS， 见表1）匹配。最好的方法是每个挥发的身份验证与认证标准两列11。如果某些化合物的身份是不可能的，仍然可以达到澄清其生物活性的GC-EAD的使用12。然而复制的生物活性取决于挥发的收集方法可能会受到限制，分析物的量会不会是原因化合物的身份dily没有可用的内部标准，将不会立即知道，和混纺随后的测试将是不可能的。
如果妥善密封和冷藏，戊烷挥发的解决方案通常可以存放1周左右。如果含有装载的光盘密封滴管被放置在自封袋和冷藏，他们可以存储约24小时。然而，我们发现最好加载光盘上午东亚运动会的分析和妥善处置剩余的滴管在这一天结束。标准化喷剂量应确定每个虫种实验，如果没有现成的相关文献。
共混物的配方通常是一个艰苦的过程。这里显示的是一些比较简单的方法，虽然不全面，。鼓励研究人员正在做进一步阅读有关的各种技术。经过评估个别元件反应作者从寄主植物挥发物的ES已被执行，共混物的研究可以进行。一个例子是使用挥发物的筛选征求相对较高的响应。其他的例子是：13。排放相对量的组合，与相 对金额排序类化合物的相对响应，或挥发物候阶段或矩阵的各种状态（损坏与未损坏）的差异比例
共混物显示这些不同方法的简单组合。 1:1:1是在相对较高的反应初步筛选的基础大专院校的混合物，也代表着各阶层的化合物。蛇麻烯是一种倍半萜，2 - 十一酮是一种脂肪酸的分解产物，2 - 苯是一种苯环。这些化合物通常在工厂排放的挥发性物质的主要类别。 1:2:4的比例在第二混合集成检测杜挥发物的相对比率响的GC-MS分析。然而，采用固相微萃取和GC-MS只提供相对比例和更准确的出发点比建议类化合物的校正曲线结合使用GC-FID分析根据检测到的挥发。
叉电极东亚运动会技术是电生理实验中采用的更简单的方法之一。14鼓励读者超出此法的高级应用进行进一步的文学研究。此外， 易地矩阵筛选可以使用的方法证明，但利用小（60毫升）修改后的船只（ 图5）含有植物部分（如杏仁）。当使用较大的容器（如120毫升的有盖容器专用适配器使用与东亚运动会河豚），建议增加流量，以确保适当的容器疏散。一个实验建议立即进行删除ð进行阳性对照，放置在容器中，以确保在必要的流速达到适当的刺激。使用两年的各个组成部分的第二个粉扑是绝对必要的泡芙是比较典型的0.5到1.0秒的顺序。但是，它让未来泡芙与集装箱挥发花束比较容易，因为这些通常需要较长的粉扑在较高的流速。我们的实验室中，利用两个粉扑，以比较单一的组件和/或混合反应，直接喷在小型船只使用的矩阵（ 见图5）。这些小型船只上的两个第二粉扑确保完整的容器，设置适当的流量时疏散。
此外，收购第二个粉扑可以执行，但是第二粉扑是绝对必要的不挥发成分的量自筛选不再被保存在一个严格的标准（<强见表5）。然而，这些信息可能是有价值的任何后续的剂量-反应实验15低得多的反应可能表明低浓度的反应减弱，而一致的响应可能表明高反应的阈值附近的剂量。应当指出的是在14日至第二次吞云吐雾的反应的变化等生理解释，但信息并协助指导未来的实验。如果高通量也不是绝对关键的，每个组件的第二粉扑的使用信息。
如果处女雌蛾是有针对性的标本，现在可以在最后龄幼虫或蛹性别鉴定和分离16让女性出现在单独的容器发生。
规模的调整可能是必要的，如果它超出了目前的规模，以适应触角反应。东亚运动会的软件屏幕CA尺度列印协助确定每μV的反应多少毫米。其他昆虫的敏感性可能会有所不同。
证明该方法提供了一种简单易学，快速，可靠，高通量筛选协议的寄主植物挥发物的成分复杂，以减少挥发物的生物活性考虑。提供试样的触角是合适的，叉东亚运动会的方法允许大量的挥发性成分或混合组件，标准的反应比较快速评估。最终，评估活动在现场设置组件的组件或混合的生物活性，是最有效的方法。然而，实地考察往往是非常耗费时间和劳力费时，昂贵的，需要多个月，以获得正确的结果。
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Disclosures
笔者派拉蒙养殖公司，Suterra有限责任公司的关系公司与现有的合作研究和开发协议。
Acknowledgments
根据美国农业部CRIS软件项目5325-42000-037-00D与CRADA 58-3K95-7-1198和TFCA 58-5325-8-419的结果进行了这项研究。作者感谢Suterra的礼物（z，z）-11,13-hexadecadienal，希格比B.富有成效的讨论，提供技术援助和J.贝克。
References
- Bruce, T. J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Insect host location: a volatile situation. Trends in Plant Sci. 10, 1360-1385 (2005).
- Unsicker, S. B., Kunert, G., Gershenzon, J. Protective perfumes: the role of vegetative volatiles in plant defense against herbivores. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 479-485 (2009).
- Norin, T. Semiochemicals for insect pest management. Pure Appl. Chem. 79, 2129-2136 (2007).
- Beck, J. J., Merrill, G. B., Higbee, B. S., Light, D. M., Gee, W. S. In situ seasonal study of the volatile production of almonds (Prunus dulcis) var. 'nonpareil' and relationship to navel orangeworm. J. Agric. Food Chem. 57, 3749-3753 (2009).
- Beck, J. J., Higbee, B. S., Gee, W. S., Dragull, K. Ambient orchard volatiles from California almonds. Phytochem. Lett. 4, 199-202 (2011).
- Coffelt, J. A., Vick, K. W., Sonnet, P. E., Doolittle, R. E. Isolation identification, and synthesis of a female sex pheromone of the navel orangeworm, Amyelois transitella (Lepidoptera: Pyralidae). J. Chem. Ecol. 5, 955-933 (1979).
- Leal, W. S., Parra-Pedrazzoli, A. L., Kaissling, K. -E., Morgan, T. I., Zalom, F. G., Pesak, D. J., Dundulis, E. A., Burks, C. S., Higbee, B. S. Unusual pheromone chemistry in the navel orangeworm: novel sex attractants and a behavioral antagonist. Naturwissenschaften. 92, 139-146 (2005).
- Kanno, H., Kuenen, L. P. S., Klingler, K. A., Millar, J. G., Carde, R. T. Attractiveness of a four-component pheromone blend to male navel orangeworm moths. J. Chem. Ecol. 36, 584-591 (2010).
- Takacs, S., Gries, G., Gries, R. Semiochemical-mediated location of host habitat by Apanteles carpatus (Say) (Hymenoptera: Braconidae), a parasitoid of cloths moth larvae. J. Chem. Ecol. 23, 459-472 (1997).
- Karimifar, N., Gries, R., Khaskin, G., Gries, G. General food semiochemicals attract omnivorous German cockroaches, Blattella germanica. J. Agric. Food Chem. 59, 1330-1337 (2011).
- Molyneux, R. J., Schieberle, P. Compound identification: a Journal of Agricultural and Food Chemistry perspective. J. Agric. Food Chem. 55, 4625-4629 (2007).
- Marion-Poll, F., Thiery, D. Dynamics of EAG responses to host-plant volatiles delivered by a gas chromatograph. Entomol. Exp. Appl. 80, 120-123 (1996).
- Beck, J. J., Higbee, B. S., Merrill, G. B., Roitman, J. N. Comparison of volatile emissions from undamaged and mechanically damaged almonds. J. Sci. Food Agric. 88, 1363-1368 (2008).
- Lucas, P., Renou, M., Tellier, F., Hammoud, A., Audemard, H., Descoins, C. Electrophysiology and field activity of halogenated analogs of (E,E)-8-10-dodecadien-1-ol, the main pheromone component in codling moth (Cydia pomonella L.). J. Chem. Ecol. 20, 489-503 (1994).
- Rodriguez-Saona, C., Poland, T. M., Miller, J. R., Stelinski, L. L., Grant, G. G., de Groot, P., Buchan, L., MacDonald, L. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-86 (2006).
- Burks, C. S., Brandl, D. G. Seasonal abundance of navel orangeworm (Leipidoptera: Pyralidae) in figs and effect of peripheral aerosol dispensers on sexual communication. J. Insect Sci. 4, 1-8 (2004).
