Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

Summary

Werkwijze snel scherm waardplant vluchtige door meting van de elektrofysiologische reactie van volwassen navel orangeworm (

Abstract

Plant vluchtige stoffen spelen een belangrijke rol in de plant-insect interacties. Plantenetende insecten gebruik van planten vluchtige stoffen, bekend als kairomonen, hun waardplant vinden. ^1,2 Wanneer een waardplant is een belangrijke grondstof agronomische voeding aantasting door insecten kunnen toebrengen ernstige economische verliezen voor de telers. Bijgevolg kan kairomonen worden gebruikt als lokstof te lokken of te verwarren deze insecten, en dus bieden een milieuvriendelijk alternatief voor pesticiden voor insectenbestrijding. ³ Helaas planten kunnen een groot aantal vluchtige stoffen uit te stoten met verschillende samenstellingen en verhoudingen van de emissies afhankelijk van de fenologie van de goederen of de tijd van de dag. Hierdoor identificatie van biologisch actieve bestanddelen of mengsels van vluchtige componenten een moeizaam proces. Om u te helpen identificeren van de bioactieve componenten van de waardplant vluchtige emissie we gebruiken het laboratorium op basis van screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is een doeltreffend instrument voor het evalueren en record elektrofysiologische reacties van de geur van een insect via hun antennaal receptoren. De EAG screening proces kan bijdragen tot het verminderen van het aantal vluchtige stoffen getest om veelbelovende bioactieve componenten te identificeren. Echter, EAG bioassays alleen informatie over de activering van receptoren. Het geeft geen informatie over het type insect het gedrag van de compound lokt; die zouden kunnen worden als een lokstof, insectenwerende middelen of een ander type van gedrags-respons. Vluchtige stoffen uitlokken van een significante reactie van EAG, ten opzichte van een geschikte positieve controle, worden meestal gemaakt op verder onderzoek van de gedragsreacties van het insect plaag. De experimentele opzet gepresenteerd behandelt in detail de methodologie gebruikt om amandel-based waardplant vluchtige stoffen ^4,5 door meting van de elektrofysiologische antennaal reacties van een volwassen insect plaag navel orangeworm (Amyelois transitella) om afzonderlijke componenten en eenvoudige mengsels van componenten via EAG bioassay te screenen. De methode maakt gebruik van twee excised antennes geplaatst in een "vork" elektrode houder. Het protocol hier aangetoond presenteert een snelle, high-throughput gestandaardiseerde methode voor het screenen van vluchtige stoffen. Elke vluchtige is op een set, constante hoeveelheid met betrekking tot de prikkel niveau dus te standaardiseren en laat antennaal reacties op een aanwijzing van de relatieve chemoreceptivity. De negatieve controle helpt bij het elimineren van de elektrofysiologische reactie op zowel resterende oplosmiddel en mechanische kracht van het bladerdeeg. De positieve controle (in dit geval acetofenon) is een verbinding die heeft geleid tot een consistente reactie van mannelijke en vrouwelijke navel orangeworm (NOW) mot. Een extra feromoon norm consistente reactie levert en wordt gebruikt voor biotoetsen de mannelijke motten NOW is (Z, Z) -11,13-hexdecadienal een aldehyde component van de vrouwelijke geproduceerde sexferomoon. ^6-8

Protocol

1. Voorbereiding van vluchtige stoffen gedetecteerd van de waardplant voor de EAG Screening

1. Na een passend identificatie en authenticatie van alle vluchtige stoffen via GC-MS, uit te voeren EAG bladerdeeg analyse van elk beschikbare volatiel. Eerste screening kan een laag herhaalde aantal antennaal reacties (N = 3-5) voor elk geslacht zijn om een indicatie van de relatieve chemoreceptivity bereiken in een korte tijd (Tabel 1).
2. Een oplossing van elk vluchtige op 5 mg / ml concentratie in pentaan. Goed af, en het monster de koelkast tot ze klaar zijn voor direct gebruik (bijvoorbeeld acetofenon, dichtheid = 1,03 g / mL, volume = (0,005 g/1.03 g / mL) × 1000 = 4,85 ul van acetofenon in een 1,0 ml maatkolf en vul aan tot 1,0 ml met pentaan).
3. Vlak voor EAG analyse verwijderd flacon met 5 mg / ml concentratie van vluchtige te testen en laat kamertemperatuur. Ondertussen bestempelen het juiste aantal Pasteurpipetten aancorreleren met elkaar vluchtig te testen, en wikkel een klein stukje parafilm (ca. 15 × 15 mm) over de top van de pipet. Voor de eerste screening 10 stimulus pipetten (N = 4 voor mannelijke en vrouwelijke) zijn in het geval van slecht bereiden of andere onvoorziene obstakel.
4. Met behulp van een pincet voorzichtig de bioassay schijf vouw in de helft om de plaatsing te vergemakkelijken in de pipet, dan gedeeltelijk plaats de gevouwen schijf in het brede uiteinde van de pipet, zodat ca. 2-3 mm van de schijf zijn blootgesteld. Lijn de gelabeld en klaargestoomd pipetten in een rack houder.
5. Met behulp van een pipet of een spuit, laden 10 pi (50 ug) van vluchtige oplossing op elke schijf en laat 2 minuten duren voordat volledig inbrengen van schijven in de pipet. Eenmaal geladen onmiddellijk afdichten het einde van de pipet met parafilm (ca. 15 x 30 mm). De hoeveelheid vluchtige stimulus te laden en opgeblazen wordt waarschijnlijk variëren insecten soorten.
6. Naar aanleiding van het hetzelfde protocol hierboven voor te bereiden controlesomvatten in elke analyse. Voor de negatieve controle belasting 10 pi van slechts pentaan op elke schijf, wacht 2 minuten, te laden in de gemerkte pipet, en afdichting. Voor de positieve controle, plaats 10 pi (50 ug) op de schijf, wacht 2 minuten, belasting in de gemerkte pipet, en afdichting met parafilm.
7. De levensvatbaarheid van de insect antennaal prep hoogstwaarschijnlijk variëren soorten, maar wij hebben gevonden dat Amyelois transitella antennes typisch en consequente blijven> 30 minuten na excisie met de beschreven protocol. Deze tijd zal in het algemeen kan voor maximaal tot 4-10 vluchtige te evalueren monsters. Tabel 2 geeft een voorbeeld van tijden en sequenties.

2. Voorbereiding van Insect Antennes voor EAG Bioassay

1. De focus van dit experiment is EAG analyse, dus de veronderstelling dat elke onderzoeker toegang zullen hebben tot de juiste gehouden insecten hebben.
2. Voor dit experiment zullen we het bestuderen van 3-4 dagen old, gedekt mannelijke en vrouwelijke motten. Individuele motten worden overgebracht in een kleine, deksels, plastic container de dag van de analyse. Direct voorafgaand aan de bioassay, is de mot te testen head-first omgezet in een holding apparaat (dat wil zeggen, gemaakt van diverse kunststof pipetpunten) en beveiligd van achteren. Manipulatie van het insect kunnen worden bekeken onder een low-power stereo-microscoop om te excisie te vergemakkelijken.
3. Antennes worden gepest met behulp van een draad-tip tool. De vork houder, met een kleine film van de elektrode gel, wordt geplaatst in de nabijheid van voor een snelle overdracht van antennes. De eerste antennestructuur is uitgesneden met behulp van micro schaar en op de vork, zodat de basis van de antenne op de niet-rode deel van de vork (de onverschillig aardelektrode). Een timer voor 10 minuten is gestart en de tweede antenne uitgesneden en naast de eerste antenne met beide bases aan dezelfde zijde van de vork.
4. Alternatief kan de antennes worden gelaten in de beveiligde holding tube, uitgesneden, vervolgens voorzichtig uit tussen de buis en het insect met behulp van een draad-tip tool met een schar van gel op het einde.
5. Antennes worden gecontroleerd of de basis en tip ondergedompeld in elektrode gel en geen luchtbellen in de gel. De uiteinden / tips kunnen worden bijgesneden tot volledige blootstelling aan de elektrode-gel te garanderen. Er moet voor worden gezorgd dat de rest van elke antenne is bedekt met gel, waardoor wordt gewaarborgd maximale antennaal oppervlak wordt blootgesteld aan het bladerdeeg.
6. De geprepareerde vork wordt vervolgens ingebracht in de probe voorversterker en bewaard onder een constante stroom van bevochtigde lucht bij 200 ml / min voor de resterende tijd van de 10 minuten wachttijd. De accijnzen tijd en EAG initiatie tijden worden genoteerd (tabel 2) en 30 seconden voorafgaand aan de eerste stimulus bladerdeeg, de pipet met de positieve controle wordt ontsloten en geplaatst in de houder, die is aangepast aan lucht / puff stroom geleiden 2-3 mm uit het voorbereid antennes.
7. Na elke expertiserimentele worden de test motten gedood in een droog ijs en correct aangebracht.
8. Vrouw motten worden ontleed om de paring te controleren. Samenwonende mannen worden geacht te zijn gedekt.

3. EAG Protocol voor de afzonderlijke onderdelen

1. Antennaal antwoorden worden opgenomen via de AutoSpike software die bij de Syntech EAG instrument. De configuratie in de AutoSpike tabblad Eigenschappen voor het kanaal met de EAG sonde is ingesteld op een sample rate van 106,7, NO om deze te corrigeren en een filter van 0-42 Hz. Voor het filter tabblad, de EAG filter is en of het low-cut-off is ingesteld op 0,1 Hz.
2. Stimulus trekjes zijn 1-2 seconden duren. Een timer in te stellen gedurende 1 minuut wordt gestart na elke inhalatie.
3. De volgende test vluchtige pipet wordt ontsloten en geplaatst in de houder. De volgorde van de test vluchtige stoffen, gerandomiseerd tussen loopt om ervoor te zorgen geen test verbindingen consequent een andere test vluchtige volgen, wordt dan gevolgd (bijv. tabel 2) zorgvuldig allowing 1 minuut tussen trekjes.
4. Om het gemak van het lezen van EAG partijen te vergemakkelijken, worden delen van heersers die op het computerscherm en het basisniveau aan de top van de neerwaartse afbuiging signaal wordt gemeten in mm en is ingelogd op een fiche (dat wil zeggen, voor de 5 mV instelling, 33 mm = 2,5 mV). De software heeft de mogelijkheid van het afspelen van de opgeslagen opnames voor toekomstige analyse. Omzetting van mm ofwel mV of mV amplitude wordt uitgevoerd in latere data-analyse.
5. Na de laatste positieve controle puff (bv, record # 12) wordt toegediend, de antennes worden verwijderd, is de vork gereinigd met een ethanol-verzadigde af te vegen en laten drogen voordat u verder gebruik.
6. Om de doorvoer van testen te verhogen, kan de excisie van de volgende set van antennes worden gestart door een tweede laboratorium personeel van ongeveer 10 minuten voor het einde van het huidige experiment - na de vierde bladerdeeg, de tweede test vluchtige van het huidige experiment, volgens tabel 2. Hierdoor kunnen for het begin van het volgende experiment onmiddellijk na de huidige experiment uiteinden.
7. Groter aantal herhalingen (op verschillende antennes) kan worden uitgevoerd op verbindingen van belang verdere statistische validatie voorzien.

4. Een voorbeeld van EAG Analyse van Blends of andere matrices (tabel 3)

1. Vervolgens worden de verhoudingen en delen van twee tertiaire mengsels (3-component mengsels) berekend om een voorbeeld van het combineren vluchtige opwekken hoge EAG reacties (Tabel 4) voorzien. De berekeningen zijn voor een aantal fundamentele verhoudingen, een 1:1:1 molaire verhouding van α-humuleen: 2-undecanone: 2-fenylethanol en vervolgens te vergelijken met een tweede mengverhouding van 01:02:04.
2. Met behulp van soortgelijke protocollen eerder beschreven, de mengsels worden bereid en gelabeld Pasteurpipetten worden geladen samen met de nodige positieve en negatieve controles.
3. De vluchtige monsters worden opgeblazen tussen mannelijke en vrouwelijke antennes en de antwoorden worden gemeten en geregistreerdeen fiche (Tabel 3).

5. Representatieve resultaten

Voor vrouwelijke navel orangeworm de volgende instellingen gebruikt: 2 seconden soezen, 10 seconden opname tijd, 10 tweede venster, en 5 mV schaal. Een negatieve uitslag is de typische reactie, maar de absolute waarde wordt opgenomen (bijvoorbeeld -3.400 mV doorbuiging wordt als 3400 mV). Een relatief zwakke reactie van de voorbereiding op de positieve controle wordt weggegooid. Figuur 1 geeft een grafische weergave van een slechte reactie op de positieve controle door de navel orangeworm.

Bijvoorbeeld een slechte controleresultaat, de gemiddelde vrouwelijke antennaal reactie acetofenon typisch ca.. 2600 mV (figuur 2), wanneer de prep slechts een reactie van ca. gaf. 1.300 mV zou worden weggegooid en moet een ander paar antennes klaargestoomd. Ook de gemiddelde mannelijke reactie (Z, Z) -11,13-hexadecadienal was typically 3000 mV, dus geen antwoord minder dan 1.500 mV werd meestal weggegooid.

De positieve controle aan het begin en einde van elk experiment biedt tevens informatie over de toestand van de antennes. Een vuistregel volgen we voor een snelle screening is als de antennaal reactie op de bladerdeeg van de nacontrole (record # 12, tabel 2) is ofwel minder dan 75% van de 1 ^e bladerdeeg van de pre-control (record # 1 Tabel 2) of minder dan de ² bladerdeeg van de pre-control (opnemen # 2, tabel 2) dan het experiment wordt niet gebruikt in de data-analyse vanwege mogelijke aantasting van de prep (figuur 3). Een voorbeeld van de eerste regel van de duim zou record # 1 zijn = 2.730 mV en opnemen # 12 = 1680 mV, en de tweede regel van de duim als record # 2 = 2350 mV en opnemen # 12 = 1680 mV, In elk van deze gevallen , zou de prep en experiment de resultaten worden weggegooid.

Eenrepresentatief voorbeeld van het corrigeren van de EAG reactie waarden zoals gemeten aan de positieve controle zou zijn als volgt.

Run #	EAG (mV)	Run # 2	EAG (mV)	Run # 3	EAG (mV)
(+) Ctrl	2800	(+) Ctrl	2420	(+) Ctrl	3030
Cmpnd A	3000	Cmpnd A	2500	Cmpnd A	3440
(-) Ctrl	530	(-) Ctrl	755	(-) Ctrl	910
Cmpnd B	2400	Cmpnd B	2000	Cmpnd B	2560
(+) Ctrl	2770	(+) Ctrl	2400	(+) Ctrl	3020

De waarden boven een N = 3 experiment wordt de negatieve controle reactie afgetrokken elke waarde in elk experiment onder de aanname de negatieve controle is de basislijn antennaal reactie op de mechanische bladerdeeg en restant oplosmiddel.

Run # 1	EAG (mV)	Run # 2	EAG (mV)	Run # 3	EAG (mV)
(+) Ctrl	2270	(+) Ctrl	1665	(+) Ctrl	2120
Cmpnd A	2470	Cmpnd A	1745	Cmpnd A	2530
(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0
Cmpnd B	1870	Cmpnd B	1245	Cmpnd B	1650
(+) Ctrl	2240	(+) Ctrl	1645	(+) Ctrl	2110

De positieve controle voor elk experiment zou dan worden gemiddeld en gecorrigeerd tot 1.000 mV, wijzend op de ratio voor correctie tot 1000 mV. Een data-sheet (bijv. Excel) kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd om de antwoorden om te zetten in bruikbare gegevens.

Run # 1	Gem (mV)	Run # 2	Gem (mV)	Run # 3	Gem (mV)
(+) Ctrl	2255	(+) Ctrl	1655	(+) Ctrl	2115
(+) Ctrl bn.	1000 (0.443)	(+) Ctrl bn.	1000 (0.604)	(+) Ctrl bn.	1000 (0.473)

Vermenigvuldigen met de correctie verhouding in elk experiment de waarden voor verbinding A en verbinding B worden vervolgens aangepast.

Run # 1	Adj. EAG (mV)	Run # 2	Adj. EAG (mV)	Run # 3	Adj. EAG (mV)
Cmpnd A	1094	Cmpnd A	1054	Cmpnd A	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

De gemiddelden (middel) voor elke verbinding worden dan bepaald met andere statistische gegevens en EAG reacties voor de geteste verbindingen kunnen dan geëvalueerdvoor de kandidatuur voor verder onderzoek.

Samenstelling	EAG (mV)	Nee loopt, N =
Een	1115	3
B	787	3

Figuur 1. Vertegenwoordiger EAG voor mannelijke antennaal respons (1180 mV) op de pre-control (1 ^ste positieve controle bladerdeeg), dat zou te wijten aan slechte antennaal reactie worden verwijderd na het waarborgen van de antennes hebben goed contact met de gel. Blauwe balken in de onderste vensters vertegenwoordigen de twee seconden bladerdeeg van vluchtige. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Trong> Figuur 2. vertegenwoordiger EAG voor de vrouwelijke antennaal reactie (3.400 mV) op de 1 ^ste bladerdeeg pre-control die zouden worden geacht. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Vertegenwoordiger EAG voor de vrouwelijke antennaal respons (1680 mV) om de nacontrole (laatste positieve controle voor elk experiment) die zou worden beschouwd als arm, en suggestief van antennes afbraak (<75% van de 1 ^e pre-control of < ^2e bladerdeeg waarde van pre-controle). Voor dit voorbeeld de 1 ^ste pre-control puff was 2.730 mV en 2 ^e pre-control puff was 2350 mV. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

dflinebreak ">
Figuur 4. Vertegenwoordiger EAG voor de vrouwelijke antennaal reactie (3.800 mV) om de trekje van een kandidaat-vluchtige mix en de daarop volgende metingen van de maximale initiële doorbuiging (3.800 mV), het begin van de helling in het bladerdeeg duur (0,3 s/1.2 mV = 0,25 s / mV), en de helling voor de resterende duur van bladerdeeg (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5. Kleine gewijzigd vat met daarin een sample matrix en de bijbehorende vluchtige stoffen moeten worden opgeblazen in A. transitella antennes.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
Tabel 1. In situ vluchtige emissie Nonpareil amandelen (2007) en EAG respons bepaald door een andere, minder gevoelig configuratie in de Autospike programma.

Tabel 2. Voorbeeld van een vorm voor het opnemen mannelijke en vrouwelijke antennaal reacties op afzonderlijke vluchtige componenten.

Tabel 3. Voorbeeld van een formulier voor het opnemen van mannelijke en vrouwelijke antennaal reacties op vluchtige mengsels en / of boeketten.

Tabel 4. Voorbeelden van de bereiding van 10 ml 5 mg / ml oplossing voor twee verschillende verhoudingen van mengsels.

Tabel 5. Voorbeeld van een formulier voor het opnemen van twee opeenvolgende pufjes van enkele vluchtige componenten in mannelijke en vrouwelijke antennes.

Discussion

Gebruik van electroantennogram opnamen een bioassay voor chemoreceptie reactie van een doel insect bepalen is tamelijk veel en diverse onderzoeken waarin EAG een detector voor effluent van een gaschromatogram (GC-EAD) kan worden gevonden in de literatuur. ^9,10 De werkwijze aangetoond zal een snelle screening van equivalente hoeveelheden vluchtige componenten met hoog replicatie voor betrouwbare overdracht van de relatieve reactiviteit. Het AutoSpike programma in de Syntech software een goed programma voor screening vluchtige omdat kan de maximale doorbuiging amplitude signaal van de antennes (figuren 1-3), die we hier te dienen als de "screening" waarde. Bovendien kunnen andere basisinformatie semi-geavanceerd gebruik (zie figuur 4) worden verkregen met AutoSpike afhankelijk van de configuratie en welke de onderzoeker wil afgeleid van het antennaal reactie. De GcEAD of EagPro Syntech programma's zijn appropriate voor meer geavanceerde experimenten of voor wetenschappers bekend zijn met elektrofysiologische respons, omdat daaruit voortvloeiende sporen zorgen voor een grotere detail van het tijdsverloop van antennaal depolarisatie reactie.

Voorafgaand aan de screening van de verbindingen ontdekt van een waardplant, de juiste identificatie van de vluchtige stoffen is belangrijk en moet volgens strikte protocollen. Indien mogelijk, moeten twee GC kolommen van verschillende polariteit (dat wil zeggen, DB-Wax en DB-1) worden gebruikt voor de eerste component identificatie via matching van retentie indices (RIS, zie tabel 1). De beste methode is om de identiteit van elke vluchtige controleren met een standaard geauthenticeerd twee kolommen ^11. Indien de identiteit van enkele van de verbindingen niet mogelijk is, kan verklaring van de bioactiviteit nog worden bereikt door gebruik van GC-EAD ^12. Echter , replicatie van het bioassay kan worden beperkt door de vluchtige verzameling methode zal de hoeveelheid analyt niet reaDily beschikbaar zonder een interne standaard, wordt de verbinding van de identiteit niet onmiddellijk bekend is, en de daarop volgende testen in mengsels zou het niet mogelijk zijn.

Als afgedicht en gekoeld kunnen oplossingen van vluchtige stoffen in pentaan gewoonlijk opgeslagen ongeveer 1 week. Indien de gesloten pipetten met de geplaatste schijf worden geplaatst in een zip-lock zak en gekoeld kunnen worden opgeslagen gedurende 24 uur. Echter, we vonden het best te laden de schijven de ochtend van de EAG analyses en goed van de overgebleven pipetten beschikken aan het einde van de dag. Doseringen voor de gestandaardiseerde soesjes moet experimenteel worden bepaald voor elke insectensoorten als aanverwante literatuur is niet direct beschikbaar.

Het formuleren van mengsels is meestal een moeizaam proces. Hier worden een aantal relatief eenvoudige benaderingen, zij het niet volledig te zijn. Onderzoekers worden gestimuleerd om verder te lezen over verschillende technieken te doen. Na evaluatie van de individuele componenten responses van de waardplant vluchtige stoffen is uitgevoerd, kunnen studies van mengsels worden uitgevoerd. Een voorbeeld is het gebruik van de vluchtige opwekken verhoudingsgewijs hogere reacties van screening. Andere voorbeelden zijn:. Combinaties van uitgezonden relatieve hoeveelheden, ratio's van de relatieve respons versus relatieve hoeveelheden, sorteren per klasse van verbindingen, of vluchtige verschillen in de fenologische stadia of verschillende staten van de matrices (beschadigd vs onbeschadigd) ¹³

Aangetoond De mengsels zijn eenvoudige combinaties van deze verschillende benaderingen. De 01:01:01 een tertiaire mengsel op basis van de relatief hoge respons in de eerste screening, maar dat ook verschillende klassen van verbindingen. Humuleen een sesquiterpeen, 2 undecanone een vetzuur afbraak produkt en 2-fenylethanol een BENZEBOIDE. Deze verbindingen vertegenwoordigen de belangrijkste klassen van vluchtige stoffen typisch gezien in plant-uitstoot. De 01:02:04 verhouding in het tweede mengsel omvat de relatieve verhoudingen van vluchtige gedetecteerd during van de GC-MS-analyse. ⁴ Het gebruik van SPME en GC-MS alleen relatieve verhoudingen en het gebruik van GC-FID analyse in combinatie met ijklijnen van de klassen van verbindingen wordt aanbevolen voor een nauwkeurigere uitgangspunt voor verhoudingen leveren gebaseerd op gedetecteerde vluchtige stoffen.

De vork elektrode EAG techniek is een van de meer eenvoudige methoden die in elektrofysiologische experimenten. ¹⁴ De lezer wordt aangemoedigd om verder literatuur onderzoek uit te voeren voor geavanceerde toepassingen buiten deze methode. Daarnaast kan de screening van ex situ matrices worden uitgevoerd volgens de methode aangetoond, maar gebruik kleine (60 ml) gemodificeerd vaten (figuur 5) met plantendelen (bijvoorbeeld, amandelen). Bij grotere houders (bijvoorbeeld 120 ml deksel vaartuig speciale adapters voor de poffer EAG) wordt aanbevolen om de stroom te verhogen om een ​​goede afvoer van de houder te. Een experiment schouderd worden uitgevoerd als een positieve controle in de container tot de juiste stimulatie bereikt bij de noodzakelijke debiet. Het gebruik van twee seconden bladerdeeg de individuele componenten niet absoluut noodzakelijk is en pufjes de orde van 0,5 tot 1,0 seconden zijn typerend. Echter, het wordt toch mogelijk om gemakkelijker de toekomst vergelijkingen met pufjes van containers vluchtige boeketten, omdat deze doorgaans een langere rookwolk bij hogere stroomsnelheden. Onze labo's maken gebruik van de twee seconden bladerdeeg om het ene onderdeel en / of mix reacties direct te vergelijken met pufjes met behulp van matrices in kleine vaten (zie figuur 5). De twee seconden bladerdeeg op deze kleine schepen zorgt voor een volledige evacuatie van de container als de juiste debiet is ingesteld.

Verder kan verkrijging van een tweede bladerdeeg wordt uitgevoerd, in de tweede bladerdeeg niet absoluut noodzakelijk voor het screenen aangezien de hoeveelheid van de verdampte onderdeel niet meer gehouden op een standaard in (<strong> tabel 5). Echter, deze informatie waardevol te zijn voor eventuele volgende dosis-respons experimenten. ¹⁵ A veel lagere respons kan een verminderde respons op lagere concentraties geven, terwijl voor een consequente aanpak kunnen wijzen op de dosis is de buurt van de drempel voor een hoge respons. Opgemerkt er andere fysiologische verklaringen voor de verandering in respons ¹⁴ de tweede trek, maar de informatie is helpen leiding voor verdere experimenten. Als high-throughput is niet van cruciaal belang, kan het gebruik van een tweede bladerdeeg van elke component informatief zijn.

Als maagdelijke vrouwelijke motten zijn de beoogde exemplaar, NU larven in de laatste instar of poppen kunnen worden gesekst en gescheiden ¹⁶ om vrouwelijke ontstaan ​​voor te komen in aparte containers.

Aanpassing van de schaal kan nodig zijn om de reactie geschikt antennaal langer is dan het huidige schaal. De schubben op de EAG-software scherm can helpen bij het bepalen hoeveel mm per mV respons. Andere insecten kunnen verschillen in hun gevoeligheid.

Aangetoond dat de methode biedt een gemakkelijk te leren, snelle, betrouwbare en high-throughput screening protocol om het aantal vluchtige stoffen voor de bioactiviteit overweging terug te brengen van de complexe samenstelling van de waardplant vluchtige stoffen. Mits de antennes van het monster geschikt zijn de vork EAG methode maakt een snelle beoordeling van verschillende vluchtige componenten, of mengsels van componenten, en vergelijking van de reacties die van een standaard. Uiteindelijk een bioassay dat de activiteit van de component of mengsel van componenten in een gebied omgeving beoordeelt de meest bruikbare methode. Echter, onderzoek in de praktijk vaak veel tijd en arbeid tijdrovend, duur en vereisen meerdere maanden de tijd om de juiste resultaten te verkrijgen.