Summary
الطريقة المعروضة هنا يصف فحص لمتابعة تفعيل العوامل الخاصة بكل RhoA تبادل الناتج المحلي الإجمالي / GTP (GEFs) في الخلايا المزروعة، عن طريق الاستفادة من البروتين RhoA متحولة الانصهار ضريبة السلع والخدمات التي لديها قابلية عالية للGEFs تفعيلها. وعجلت GEFs من lysates الخلية، الكشف عنها بواسطة النشاف الغربية وكميا عن طريق قياس كثافة.
Abstract
البروتينات للأسرة رو من GTPases الصغيرة هي المنظمين المركزية للالهيكل الخلوي، ومراقبة مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك الهجرة الخلية، والتعبير الجيني، وتقدم دورة الخلية والتصاق الخلية 1. البروتينات رو هي مفاتيح الجزيئية التي تنشط في GTP محدد وغير نشطة في الناتج المحلي الإجمالي متجهة دولة. ويتمثل الوسيط في تنشيط من قبل عائلة من البروتينات تبادل جوانين-النوكليوتيدات (GEF) عامل. رو، GEFs تشكل عائلة كبيرة، مع تداخل الخصوصيات 2. رغم إحراز الكثير من التقدم في تحديد GEFs تفعيلها من خلال اشارات معينة، لا يزال هناك العديد من الأسئلة المتبقية بشأن تنظيم مسار محدد من هذه البروتينات. عدد رو-GEFs يتجاوز 70 سنة، ويعبر عن كل خلية أكثر من مرفق البيئة العالمية من البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من هذه البروتينات بتنشيط ليس فقط رو، ولكن أعضاء آخرين في الأسرة، ويسهم في زيادة تعقيد شبكات تنظيمية. الأهم من ذلك، واستكشافكيف يتم تنظيم GEFs يتطلب طريقة لمتابعة تجمع نشط من GEFs الفردية في الخلايا تفعيلها من خلال محفزات مختلفة. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة عن الطريقة المستخدمة لتقييم وتحديد ما هو متاح نشط رو محددة GEFs باستخدام فحص الهطول تقارب. وقد تم تطوير هذا الفحص قبل بضع سنوات في المختبر بوريدج 3،4 وليس لدينا استخدامها في خطوط الكلى خلية أنبوبي 5،6،7. الفحص يستفيد من "النوكليوتيدات الحرة" RhoA متحولة، مع قابلية عالية للGEFs نشط. الطفرة (G17A) يجعل بروتين قادر على الربط الناتج المحلي الإجمالي أو GTP والدولة هذا يقلد الدولة الوسيطة التي لا بد أن مرفق البيئة العالمية. وأعرب عن نسخة ضريبة السلع والخدمات الموسومة هذا البروتين الطافر وتنقيته من E. كولاي، منضما إلى حبات sepharose و الجلوتاثيون واستخدامها ليعجل GEFs نشط من lysates من الخلايا غير المعالجة، وحفز. كما يتم تنشيط معظم GEFs عبر تعديلات posttranslational أو إطلاق سراح من الارتباطات المثبطة، دولتهم نشطيتم الاحتفاظ في lysates الخلية، ويمكن الكشف عنها بواسطة هذا الاختبار 8. ويمكن القبض على البروتينات وبحث عن GEFs معروفة من قبل اكتشاف أجسام مضادة محددة مع استخدام النشاف الغربية، أو تحليلها بواسطة الطيف الكتلي لتحديد GEFs غير معروف تفعيلها من خلال مثيرات معينة.
Protocol
1. التحول من E. القولونية مع كونستركت (G17A) pGEX-RhoA
- إعداد LB-آجار عن طريق إذابة 2.5 و 1.5 رطل ز ز آجار في 100 مل O. 2 درهم الأوتوكلاف وبارد لدرجة C المقدرة 50-55، والتي كما كقاعدة عامة، هو متى يمكن أن تعقد القارورة بشكل مريح.
- إعداد أمبيسيلين (AMP) الأوراق المالية عن طريق إذابة 50 ملغ / مل في DH 2 O. حقنة مرشح وتجميد aliquots غير المستخدمة. أضف 100 ميكروليتر من الأوراق المالية الأمبير (تركيز نهائي 50 ميكروغرام / مل) للآجار-LB من 1.1. دوامة لخلط وتصب 10 سم الأطباق البكتيرية (15-20 مل / طبق). السماح لها لترسيخ (15-30 دقيقة) وتخزين لوحات غير مستخدمة معكوسة عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع.
- لتحويل E. كولاي، ذوبان الجليد بسرعة 1 قسامة من الخلايا المختصة DH5α في حمام جليدي. إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي (G17A) pGEXRhoA تخفيفه إلى 25-50 نانوغرام / ميكروليتر. نفض الغبار عن أنبوب لخلط واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية والمكان مرة أخرى على الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 900 و مو؛ ل SOC المتوسط وتنمو لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
- نشر 50-100 ميكروليتر من البكتيريا تتحول على لوحة LB-أجار الأمبير باستخدام عازمة معقم ماصة باستير. احتضان الجانب لوحة الحق حتى في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعكس ذلك الحين وتنمو بين عشية وضحاها.
- وسيتم اختيار مستعمرة واحدة من لوحة لإعداد بروتين ضريبة السلع والخدمات الموسومة (الخطوة 2.1). لاستخدامها في المستقبل، والتفاف ومخزن لوحات مقلوبة في 4 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون على استعداد أسهم البكتيرية للتخزين لفترة طويلة أكثر من المستعمرات الفردية المتزايدة في 2 مل العقيمة الأمبير-LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز. مزيج 1 قسامة مع معقم الجلسرين 80٪ في نسبة 1:1 وتجميد عند -80 درجة مئوية.
2. إعداد الخرز (G17A) ضريبة السلع والخدمات، RhoA
- إعداد LB بإضافة 25 ز LB إلى 1 L 0 2 درهم وجهاز الأوتوكليف. عندما تبرد، بإضافة 50 أمبير ميكرولتر من الأوراق المالية إلى LB 50 مل (50 ميكروغرام / مل تركيز نهائي). تطعيم مع العقيد معزولة تمامابنيويورك من البكتيريا تتحول وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الإثارة. عندما في كثافة كامل (OD 600> 1.0) تمييع مع 450 مل LB-AMP وتنمو لمدة 30 دقيقة إضافية في 37 درجة مئوية.
- تعد الأوراق المالية 100 ملم حل الآيزوبروبيل BD-thiogalactopyranoside (IPTG) عن طريق إذابة 0.238 غرام في 10 مل O. 2 درهم متجر في aliquots عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. حمل البكتيريا لانتاج بروتين رو بإضافة 500 ميكروليتر 100 ملي مول IPTG إلى ثقافة 500 مل (تركيز النهائي من 100 ميكرون). خفض درجة الحرارة إلى 22-24 درجة مئوية وتنمو لساعات ~ ح 16.
- تدور الثقافة في ز 3600 لمدة 10 دقائق في درجة مئوية 4 إذا لزم الأمر، يمكن تقسيم الثقافة 500 مل إلى 50 مل لأنابيب الطرد المركزي. تجميد بيليه (ق) ما لا يقل عن 1 ساعة (أو بين عشية وضحاها ويفضل) في -80 درجة مئوية.
- إعداد 200 العازلة التي تحتوي على 20 مل تحلل HEPES ملم (0.95 غ) / 7.5 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم (1.75 ز)؛ 5 مم MgCl 2 (0،203 ز)؛ 1٪ TX-100 (2 مل). إعداد حلول الأوراق المالية من DTT 1M (1.542 غرام في 10 مل O 2 درهم) و 100 ملي PMSF (0.174 مل g/10 EtOH). لإعداد تحلل + العازلة، وتكملة 10 مل مع DTT 1MM (10 ميكرولتر من الأسهم) و1 ملم PMSF (100 ميكرولتر من الأسهم) والبروتياز البسيطة اكتمال قرص المانع.
- العمل على الجليد، وإضافة 10 مل + العازلة تحلل لكريات من الخطوة 2.3. Resuspend بشكل دقيق من قبل vortexing لطيف وpipetting. تجنب الرغوة. يصوتن على الجليد لمدة 1 دقيقة في تحديد 4 مع نبض 50٪. تدور المحللة sonicated في 15،000-20،000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية، وإزالة يصوتن أوضح (طاف) إلى عقيم توج أنبوب 15 مل.
- إعداد sepharose و الجلوتاثيون عن طريق خلط بلطف الأنبوب الأصلي الذي يحتوي على 75٪ من الطين ونقل 335 ميكروليتر في أنبوب 15 مل. استخدام معلومات سرية واسعة تتحمل إلى ماصة الخرز. إضافة 10 مل الباردة في برنامج تلفزيوني، وتدور 500 غ لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، إضافة 1 العازلة تحلل + مل إلى الخرز وتدور كما لغسل السابقة. تجاهل المخزن المؤقت تحلل طاف والوظائف + لجعل الطين 50٪.
- إضافة 250 ميكرولتر من equilibrated الطين حبة لطاف من الخطوة 2.5. تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
- تحضير 500 مل تحتوي على 20 HBS HEPES ملم (2.38 غ) / 7.5 درجة الحموضة و150 مم كلوريد الصوديوم (4.38 ز) في DH 2 O. إعداد حلول الأوراق المالية من MgCl 1M 2 (0.952 غرام في 10 مل O 2 درهم) و1M DTT (1.542 غرام في 10 مل O 2 درهم). لإعداد HBS +، تكملة 100 مل فقط قبل استخدامها مع 5 مم MgCl 2 (50 ميكرولتر من الأوراق المالية) و 1 DTT ملي (100 ميكروليتر من الأسهم).
- تدور حبات من الخطوة 2.7 في 500 غ لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل الخرز طاف وغسل 2X مع 10 مل + تحلل العازلة، و2X مع HBS مل 10 +. بعد غسل النهائي، وجعل الطين 50٪ بحلول resuspending حبات في HBS + تستكمل مع البروتيني دينار بحريني المانع BaculoGold (20 ميكرولتر من 50X دينار بحريني BaculoGold / مل).
- تمييع 10 ميكرولتر من إعداد حبات نهائي مع 2X العازلة التي تحتوي على عينة Laemmli β-المركابتويثانول. جعل مصل البقر (BSA) المعايير. استخدام 2 ملغ / مل الأوراق المالية (0.02 غرام من جيش صرب البوسنة في 10 مل درهم 2 O). خلط 10 ميكرولتر من الأوراق المالية مع 10 Laemmli ميكروليتر (20 ميكروغرام النهائي)؛ 5 ميكرولتر من الأوراق المالية مع 5 ميكرولتر من DH 2 O و 10 Laemmli ميكروليتر (10 ميكروغرام النهائي)؛ و 2.5 سهم ميكرولتر مع 7،5 ميكروليتر O 2 درهم و 10 Laemmli ميكرولتر (5 ميكروغرام النهائي). تغلي جميع العينات (5 دقائق). تدور عينة حبة وتشغيل طاف مع المعايير جيش صرب البوسنة وعلامات الوزن الجزيئي على هلام SDS-بولكرلميد 10٪.
- إعداد الأزرق Comassie صمة عار (0.1 غرام في حمض الخليك 10 مل و 40 مل من الميثانول و 50 مل درهم O 2) وحل يزيل اللون (500 مل درهم 2 O، و 400 مل من الميثانول و 100 مل من حمض الخل). تخزن في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار في هلام لمدة 20-30 دقيقة، وإزالة الصبغة (يمكن إعادة استخدامها عدة مرات)، وشطف مع حل يزيل اللون مرتين. تواصل يزيل اللون مع الهز لطيف لعدة ساعات حتى العصابات هي واضحة للعيان.
- ويقدر تركيز ضريبة السلع والخدمات، RhoA (G17A) بالإضافة إلى الخرز باستخدام معايير BSA كمرجع (الشكل رقم 2). أليكوتي حجم مساو من الخرز التي تحتوي على البروتين ~ ميكروغرام 10-15 إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة. الخرز مخزن في 4 درجات مئوية لاستخدام في غضون يوم. تجمد عند -80 درجة مئوية في HBS + / الجلسرين في نسبة 03:01 لاستخدامها في غضون بضعة أيام.
3. مرفق البيئة العالمية الفحص المنسدلة مع النكليوتيد خالية من الخرز (G17A) RhoA
- زراعة خلايا في أطباق 10 سم إلى نقطة التقاء. مصل تحرم ما لا يقل عن 3 ساعات وعلاج على النحو المطلوب.
- إعداد العازلة تحلل + كما في الخطوة 2.4. إعداد ما يكفي من عازلة تحلل مقابل 700 ميكروليتر / طبق بالإضافة إلى بعض كمية اضافية للسماح لpipetting الأخطاء. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني فقط قبل الاستخدام.
- العمل على الجليد، وإزالة ثقافة المتوسط من الصحون وغسل مع المثلج HBS. إزالة كافة HBS وإضافة 700 العازلة تحلل ميكرولتر + على كل طبق. لوحات دوامة لتغطية جميع المناطق، وكشط وجمع lysates في أنابيب مرقمة 1.5 مل. تدور في 15000 ز ل 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. وسوف تستخدم وطاف للفحص.
- إذا كان رقمك الخليوي، هو ما يعادلها في جميعيجري اختبار أطباق، يمكنك تجاهل القيام فحص البروتين، والانتقال إلى الخطوة 3.5. قياس تركيز البروتين وإلا فإن كل من طاف باستخدام بيو راد فحص بروتين سريع وتحقيق المساواة في طاف للحجم وتركيز. كمية البروتين الكلي يعتمد على أنواع الخلايا المستخدمة (وعادة ما 1-1،5 بروتين ملغ للخلايا PK1 ذ م م).
- إزالة 30 ميكرولتر من كل طاف وتخلط مع 30 2X ميكرولتر تقليص Laemmli عينة العازلة، ويغلي ويترك جانبا لخطوة 3.7. إضافة إلى aliquots supernatants المتبقية من الخرز (G17A) ضريبة السلع والخدمات، RhoA من الخطوة 2.12. تناوب لمدة 45 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- تدور الخرز في 6800 جرام لمدة 10 ثانية عند 4 درجة مئوية. تجاهل طاف وتغسل حبات 3x مع عازلة تحلل، والغزل في نفس الطريق بين يغسل. تماما إزالة غسيل نهائي باستخدام حقنة سم مكعب 1 مزودة إبرة G 30، وإضافة 20 2X ميكرولتر تقليص Laemmli العازلة عينة. يغلي لمدة 5 دقائق. تدور على حبات بيليه وإما تشغيل طاف على الفور (الأفضل) أو تخزينه 1تي -80 درجة مئوية لتحليلها لاحقا.
- تشغيل 20 ميكرولتر lysates الخلية الكلي وجميع العينات من البروتين المترسبة على جل المناسبة SDS-بولكرلميد النسبة المئوية لحجم مرفق البيئة العالمية الذي تدرسه. كشف مرفق البيئة العالمية التي تختارها من قبل الغرب النشاف باستخدام الاجسام المضادة المحددة.
4. ممثل النتائج
جزء 1 و 2 من بروتوكول يصف تحضير من ضريبة السلع والخدمات، RhoA (G17A) بالإضافة إلى GSH-sepharose و الخرز وتجاربها بواسطة SDS-PAGE (انظر الخطوط العريضة للبروتوكول بشأن الشكل 1). ويرد الملون Coomassie نموذجي جل في الشكل 2. ينبغي للعينة مع بروتين مزال تحتوي على شريط واحد على ما يقرب من 50 كيلو دالتون (الشكل رقم 2، لين 6). ويمكن تقدير تركيز البروتين باستخدام عينات مرجعية جيش صرب البوسنة. في المثال في الشكل 2، ويقدر تركيز RhoA (G17A) لتكون 15 μg/10 ميكرولتر. وبالتالي، تم إعداد aliquots من 10 ميكروليتر / أنبوب. العائد نموذجي في يدنا هو بروتين 15-20 ميكروغرام من تحلل 10 مل البكتيرية. جزء 3 من بروتوكول يصف فحص الهطول تقارب (انظر نظرة عامة على الشكل 1). ويبين فحص الكشف عن مرفق البيئة العالمية الناجحة تفعيل عامل تبادل GEF-H1 في الشكل 3. القبض على (G17A) RhoA بروتين بعض GEF-H1 من سيطرة (غير المعالجة) lysates الخلية، مما يشير إلى أن مرفق البيئة العالمية H1 لديه نشاط القاعدية. عجلت المبلغ لكن الزيادات في الخلايا تعامل مع نخر الورم خلوى التهابات عامل-α (TNF-α)، بما يتفق مع فكرة أن TNF-α ينشط GEF-H1 5،7. الأهم من ذلك، وlysates خلية إظهار مجموع كميات مماثلة من مرفق البيئة العالمية H1 في مراقبة ومعالجة العينة، مما يشير إلى أن العلاج لم يغير من مرفق البيئة العالمية H1 المستويات والمدخلات المستخدمة في فحص هي على قدم المساواة.
الشكل 1. نظرة عامة للبروتوكول.
الشكل 2. نتيجة الممثل للبروتوكول إعداد حبة. ويرد جل ملون Coomassie مع نجاح ضريبة السلع والخدمات، RhoA إعداد حبة (G17A). تم فصل عينة حبة والمعايير بروتين BSA بواسطة SDS-PAGE باستخدام هلام الأكريلاميد بنسبة 10٪. لاختبار الخرز، ويتم تخفيف 10 ميكرولتر من الطين وحبة نهائي يتضمن ضريبة السلع والخدمات، RhoA (G17A) 1:1 مع تقليص Laemmli العازلة عينة ويغلى لمدة 5 دقائق. وقد نسج الخرز لفترة وجيزة، وطاف تحميلها على هلام. العينات التي تم تحميلها التالية: لين 1: الوزن الجزيئي علامة (MW) (FroggaBio BLUeye prestained سلم بروتين)؛ انز 2-4: 5 و 10 و 20 ميكروغرام البقري ألبومين المصل (BSA)، لين 5 هو فارغ، لين 6: 10 ميكرولتر من الخرز الطازجة (G17A) RhoA. بعد اكتمال الانفصال، واتسخت الجل باستخدام Coomassie الأزرق وdestained في وقت لاحق للكشف عن البروتينات. الوزن الجزيئي للبروتين (G17A) ضريبة السلع والخدمات، RhoA هو ما يقرب من 50 كيلو دالتون ويدور حول مستوى 48 علامة كيلو دالتون. ويقدر تركيز بروتين ضريبة السلع والخدمات، رو في هذه العينة خاص لتكون حول الطين μg/10 15 ميكرولتر.
الشكل 3. تفعيل مرفق البيئة العالمي الممثل الفحص تبين TNF-α التي يسببها تفعيل GEF-H1. وعولج متموجة LLC-PK1 الخلايا مع 10 نانوغرام / مل TNF-α لمدة 5 دقائق. علاج التالية هي lysed الخلايا وأسروا GEFs النشطة باستخدام ضريبة السلع والخدمات، RhoA (G17A) حبات ملزمة. تم الكشف عن وجود مرفق البيئة العالمي H1 في البروتينات المترسبة (وصمة عار أعلى) ومجموع العينات المحللة خلية (لطخة أسفل) باستخدام النشاف الغربية مع الأجسام المضادة لمكافحة GEF-H1 (الخلايا مما يشير). يرجى ملاحظة زيادة كمية عجلت GEF-H1 في TNF-α المعاملة مقابل غير المعالجة الخلايا بالنسبة للمدخلات ما يعادلها، مشيرا إلى نتيجة ناجحة.
3932/3932fig4.jpg "/>
الشكل 4. "نتيجة سيئة". على الرغم من أن فحص المنسدلة مرفق البيئة العالمية هو موضح هنا أدى في بعض GEF-H1 التي استولت عليها الخرز، وعجلت في كميات من السيطرة وTNF-α المعالجة الخلايا هي نفسها. وبالتالي TNF-α، لم منشط نعرف من مرفق البيئة العالمية H1 في هذه الحالة لا تتسبب في تنشيط. في هذه التجربة مخرج خاص لاحقة اقترح أن TNF-α المستخدمة ليست جديدة بما فيه الكفاية وربما المتدهورة.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا هو متاح فقط فحص التنشيط غير المشعة لGEFs التي يمكن أن تتبع تجمع نشط من GEFs في الخلايا. الفحص مشابه لفحوصات هطول الأمطار تستخدم لتنشيط التالية من GTPases الصغيرة وكذلك GEFs ضد طلب وCdc42. هذه المقايسات استخدام مختلف ضريبة السلع والخدمات الموسومة البروتينات وبيننا اختلاف طفيف من واحد وصفها هنا، ولكن الخطوات الأساسية هي نفسها. وبالتالي، يمكن بسهولة هذا البروتوكول يمكن تكييفها لGTPase الصغيرة الأخرى والمقايسات تفعيل مرفق البيئة العالمية.
تعديل لمرفق البيئة العالمية مؤخرا الفحص المقدمة للتطبيق للكسور النووية 9،10. مع مزيد من التعديلات، قد اختبار تفعيل مرفق البيئة العالمية في مقصورات التحت خلوية أخرى يكون من الممكن أيضا.
نحن نستخدم طريقة عرض لدراسة تفعيل GEFs في خطوط الخلايا الظهارية 5،6،7. مع بعض التحسين، وهذا ينبغي أن تكون كافية لفحص الكشف عن GEFs من أي خط الخلية. عندما adaptiنانوغرام إلى نوع من الخلايا المحددة، والعثور على عدد الخلايا الأمثل، وتحلل حجم العازلة، وطريقة الكشف عن مرفق البيئة العالمية لفحصها (الأجسام المضادة جيدة للغرب النشاف هو المهم). من أجل الإعداد الأولي للفحص فإنه من المستحسن استخدام التحفيز ما هو معروف لتفعيل مرفق البيئة العالمية من اهتمام. عند استخدام الحوافز غير معروف، ودائما استخدام عنصر تحكم إيجابي للتحقق من أن الفحص الخاص بك يعمل. ويمكن استخدام هذا الفحص للكشف عن تفعيل GEFs معروفة من قبل النشاف الغربية. ومع ذلك، فإنه هو أيضا مناسبة للتعرف على GEFs غير معروف. لهذا، ينبغي تحليل GEFs تم الاستيلاء عليها من مراقبة وعينات حفز على مادة هلامية Coomassie الملطخة. قد العصابات التي تظهر فقط في عينات تحتوي على حفز GEFs تفعيلها، ويمكن أن ترسل لتحديد الهوية بواسطة الطيف الكتلي (على سبيل المثال 5).
وأخيرا، هناك ملاحظة تحذيرية. ويستند الفحص على افتراض أن يتم الاحتفاظ التعديلات posttranslational تقديم GEFs نشط بعد تحلل الخلية. في الواقع، وهذا هو واضح في كاليفورنياسراج الدين لعدد من GEFs، ومنذ إنشائها، وقد استخدم هذا الاختبار من قبل مختلف المجموعات للكشف عن تفعيل GEFs مختلفة، بما في ذلك مرفق البيئة العالمية-H1، p115RhoGEF وXPLN (على سبيل المثال 5،11،12،13). المحافظة على حالة نشطة لكن قد لا يحدث في حالة جميع GEFs، وبالتالي فإنه من الممكن تصور أن هذا الاختبار لن تعمل لجميع GEFs. كما أن لديها الجدير بالذكر، أن العديد من GEFs بذل نشاط نحو أكثر من واحد GTPases الصغيرة. وبالتالي، عندما يتم درس مرفق معين، فمن المستحسن لاستكمال هذا الاختبار مع المقايسات هطول الأمطار مرفق البيئة العالمية للGTPases الصغيرة الأخرى، فضلا عن الدراسات الفنية بدراسة RhoA، Rac1 وCdc42.
خطوات حاسمة في البروتوكول:
وينبغي أن ينتبه مستعمرات من البكتيريا تحول من لوحات، طازجة أعدت بشكل صحيح لضمان الاختيار الملائم من قبل أمبير، ثمرة جيدة والعائد. قد تحول الظروف للخلايا المختصة التي تم الحصول عليها من مصادر أخرى تختلف وينبغي استشارة. يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات من البروتين إعداد بروتوكول (من الخطوة 2.3) وفحص و(من الخطوة 3.2) في 4 درجات مئوية مع حلول تبريد وأجهزة الطرد المركزي.
وينبغي أن تحلل الجرثومي (الخطوة 2.5) تكون شاملة وكاملة من أجل الحصول على تعليق متجانسة. عندما lysing للبكتيريا، ودوامة ماصة للالمحللة بالتناوب، مع الحفاظ عليه في درجة مئوية (4) وضمان ان يتم صوتنة على الجليد لمنع تبديل طبيعة البروتين. إذا باستخدام نموذج مختلف من sonicator، قد الظروف هناك حاجة الى تعديلها. وينبغي دائما حضانة يصوتن مع حبات ينبغي القيام به في 4 درجات مئوية على محور دوار لضمان ملزم كاف، وينبغي توخي الحذر للحفاظ على توقيت ثابت.
ضريبة السلع والخدمات، رو المسوخ غير مستقرة إلى حد ما عندما أعرب في البكتيريا، ولذلك فمن الأفضل استخدام الخرز معدة على الفور أو في غضون بضعة أيام.
الفحص هطول الأمطار (الجزء 3) هو وقت حساس ودرجة الحرارة، وهوويمكن S GEFs نشط خسر بسهولة من المحللة خلية، ينبغي القيام بالخطوات ذلك في أسرع وقت ممكن.
المقطع التالي يحتوي على بعض النصائح حل المشاكل.
لا أو كمية قليلة جدا من البروتين رو متحولة في إعداد حبة النهائي: قد يكون سبب هذا الاستقراء غير فعال، تحلل كافية من البكتيريا، أو فقدان للبروتين أثناء عملية الإعداد أو التخزين. للمساعدة في استكشاف بعض من هذه الاحتمالات، يمكن تحليل عينات من البكتيريا قبل وبعد الاستقراء. إذا كان هناك تحريض الفقراء من البروتين تكرار هذه العملية باستخدام مستعمرة من لوحة يشوبه طازجة أو من إعادة تحويل خلايا المختصة. وينبغي أيضا تركيزات IPTG وأوقات مختلفة الاستقراء يتم اختبارها. ويمكن إذا ما تحلل ليست كافية (أي البروتين يبقى في بيليه بدلا من طاف) متفاوتة الملح والمنظفات تركيزات في المخزن المؤقت تحلل يحاكم. مرات صوتنة المناوبين ووينبغي النظر في الضبط، ويمكن التحقق من العينات قبل وبعد صوتنة بواسطة الفحص المجهري لتحديد كفاءة تحلل.
عجل لا مرفق البيئة العالمية، على الرغم من أن ضريبة السلع والخدمات من البروتين موجود على حبات: قد يكون هذا بسبب مشاكل تقنية خلال فحص هطول الأمطار، أو من خلال غياب حقيقي لتفعيل مرفق البيئة العالمية درست باستخدام التحفيز تطبيقها. استخدم دائما حافزا يعرف باسم مراقبة إيجابية للتحقق من أن الفحص الخاص بك يعمل. استخدام الخرز المعدة في غضون بضعة أيام. إذا كان فحص ترسيب يلتقط كميات لا يمكن اكتشافها من مرفق البيئة العالمية دراسة في جميع الأحوال، تحقق من أن مرفق البيئة العالمي الخاص موجودا وقابلا للاكتشاف بئر في طاف بعد الطرد المركزي التي يتم استخدامها لفحص (الخطوة 3.3). تأكد من أن جميع المخازن ومثبطات الأنزيم البروتيني هي جديدة، وتنفيذ كافة الخطوات على الجليد في أسرع وقت ممكن. زيادة كمية البروتين المدخلات (على سبيل المثال من خلال استخدام لوحات lysates في الفترة من 2 / عينة). إذا كان فحص ترسيب يظهر precipi القاعديةإتباع ذلك مرفق البيئة العالمية، ولكن ينظر لا فرق بين الرقابة وعينات حفز (الشكل 4)، وبدء استكشاف الأخطاء وإصلاحها من خلال التحقق من أن تطبيق حافز يعمل باستخدام غيرها من الآثار المعروفة (على سبيل المثال عن طريق الكشف عن تنشيط المسارات الأخرى مما يشير). النظر في تغيير شروط العلاج و / أو تجمعات. تعتمد على بيانات من التقارير الأدب كيفية التحفيز الخاص ينشط رو أو إشارات أخرى للتنبؤ مرات على الأرجح وتركيزات. عندما تحسين وقت العلاج، واستخدام كل نقاط زمنية قصيرة وطويلة، ومرفق البيئة العالمية التنشيط قد يكون أفضل للكشف في وقت لوقت قبل تفعيل رو اكتشاف جيد. أخيرا، يمكن أن يؤدي إلى تحفيز نفسه درجة مختلفة من التنشيط بسبب تغيير في استجابة الخلية الناجمة عن عدد مرور، خلية confluency، الخ.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) (MOP-97774)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC، ومنحة NR: 480619). كانساس هو حاصل على جائزة محقق جديد KRESCENT (جائزة مشتركة لمؤسسة الكلى من كندا، والكندي جمعية أمراض الكلى والمعهد الكندي للبحوث الصحية)، وجائزة الباحث في وقت مبكر من وزارة أونتاريو للبحوث والابتكار. معتمد من قبل مهاجم شينغ لي كا منحة دراسية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
| DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
| SOC medium | BioShop Canada | SOC001.10 | |
| LB | BioShop Canada | LBL407.1 | Keep sterile |
| Glycerol | BioShop Canada | GLY002.1 | |
| Ampicillin | BioShop Canada | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
| Agar | BioShop Canada | AGR001.500 | |
| IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbiochem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
| Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD001.10 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-9272 | Add just before use |
| TX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| DTT | OmniPur, EMD Millipore | 3860 | Add just before use |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P-7626 | Add just before use |
| Protease Inhibitor 50x | BD Biosciences | 51-21426Z | Add just before use |
| Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche Group | 11 836 170 001 | Add just before use |
| Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Add just before use |
| Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
| Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
| Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
| BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Table 1. Reagents used | |||
| RC-5B centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
| Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
| Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
| Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
| Table 2. Specific equipments used | |||
References
- Jaffe, A. B., Hall, A. R. ho GTPases: biochemistry and biology. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).
- Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC. J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).
- Garcia-Mata, R. Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates. Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).
- Kakiashvili, E. GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability. J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).
- Waheed, F. Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase. Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).
- Kakiashvili, E. The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium. J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).
- Garcia-Mata, R., Burridge, K. Catching a GEF by its tail. Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).
- Dubash, A. D. The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals. PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).
- Guilluy, G., Dubash, A. D., García-Mata, R. Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus. Nature Protocols. , (2011).
- Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).
- Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin. J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).
- Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC. J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).
