Summary
השיטה המוצגת כאן מתארת assay לעקוב אחר ההפעלה של RhoA ספציפיים GDP / GTP גורמים חליפין (GEFs) בתאים בתרבית על ידי שימוש בחלבון RhoA GST היתוך מוטציה שיש לו זיקה גבוהה עבור GEFs מופעל. GEFs הם זירז מ lysates סלולריים, שזוהו על ידי סופג המערבי לכמת ידי צפיפות.
Abstract
חלבונים ממשפחת Rho של GTPases קטנים הם הרגולטורים המרכזיים של cytoskeleton, ולשלוט מגוון רחב של תהליכים תאיים, כולל נדידת תאים, ביטוי גנים, מחזור התפתחות התא הידבקות התא 1. חלבונים Rho הם מתגים מולקולריים הפועלים GTP הנכנס ללא פעילות במדינה תוצר הנכנס. ההפעלה שלהם מתווכת על ידי משפחה של גואנין נוקלאוטיד-פקטור חליפין (GEF) חלבונים. Rho-GEFs מהווים משפחה גדולה, עם חפיפה ספציפיות 2. למרות הרבה הושגה התקדמות בזיהוי GEFs מופעל על ידי אותות ספציפיים, יש עדיין הרבה שאלות שנותרו לגבי רגולציה מסלול ספציפי של חלבונים אלו. מספר Rho-GEFs עולה על 70, ואת כל תא מבטא יותר חלבון GEF. בנוסף, רבים של חלבונים אלה להפעיל לא רק רו, אבל בני משפחה אחרים, שמוסיפים למורכבות של רשתות רגולטוריות. חשוב לציין, לחקוראיך GEFs מוסדרים דורש שיטה כדי לעקוב אחר הבריכה פעילה של GEFs בודדים בתאים מופעל על ידי גירויים שונים. כאן אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד בשיטה שנועדה לבחון ולכמת את הזמינות פעילים Rho-ספציפיים GEFs באמצעות assay משקעים זיקה. Assay זו פותחה לפני שנים אחדות במעבדה Burridge 3,4 ו השתמשנו בו צינורי בכליות שורות תאים 5,6,7. Assay מנצל "נוקלאוטיד חינם" RhoA מוטציה, עם זיקה גבוהה GEFs פעילים. מוטציה (G17A) הופך את החלבון מסוגל להיקשר, או מהתמ"ג GTP וזה המדינה מחקה את מצב ביניים זה חייב GEF. גרסה GST-מתויג של חלבון זה מוטציה באה לידי ביטוי מטוהרים מן ה coli, המאוגדים חרוזים גלוטתיון sepharose ולהשתמש בהם כדי להאיץ GEFs פעילים מ lysates של תאים שלא טופלו ולא מגורה. כמו רוב GEFs מופעלים באמצעות שינויים posttranslational או שחרור מעכבות כריכות, המדינה הפעילהנשמרת lysates סלולריים, והם יכולים להיות מזוהים על ידי assay זה 8. חלבונים שנתפסו יכול להיות נחקר על GEFs מוכרים על ידי זיהוי עם נוגדנים ספציפיים באמצעות סופג המערבי, או מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה לזהות GEFs ידוע מופעל על ידי גירויים מסוימים.
Protocol
1. טרנספורמציה של E. coli עם pGEX-RhoA (G17A) Construct
- הכן LB-אגר ידי המסת 2.5 גרם ו 1.5 LB אגר גרם 100 מ"ל DH 2 א ' החיטוי ו מגניב משוער 50-55 מעלות צלזיוס, אשר ככלל אצבע, כאשר הבקבוק ניתן לקיים בנוחות.
- הכן ampicillin (AMP) מניות על ידי המסת 50 מ"ג / מ"ל ב DH 2 א ' מזרק מסנן ולהקפיא aliquots שאינם בשימוש. הוסף 100 μl של המניה Amp (הריכוז הסופי 50 מיקרוגרם / מ"ל) ל-אגר LB מ 1.1. מערבולת לערבב ולשפוך לתוך 10 ס"מ צלחות חיידקים (15-20 מ"ל / צלחת). לאפשר לו לגבש (15-30 דקות). ולאחסן צלחות הפוכות שאינם בשימוש ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שבועות.
- כדי להפוך את ה קולי, במהירות להפשיר aliquot של תאים המוסמכות DH5α באמבט קרח. הוסף 1 μl של ה-DNA (G17A) pGEXRhoA מדולל ל 25-50 ng / μl. קפיצי צינור לערבב דגירה על קרח במשך 30 דקות. חום הלם על 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ומניחים חזרה על קרח במשך 2 דקות. הוספת 900 & mu, אני SOC בינוני לגדול במשך שעה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
- מורחים 50-100 μl של חיידקים שהפכו בצלחת אגר LB--AMP בעזרת פיפטה פסטר כפוף סטרילית. דגירה בצד הצלחת ישר ב 37 מעלות צלזיוס בחממה במשך 5 דקות ואז להפוך לגדול בין לילה.
- מושבה אחת יהיה נטל מהצלחת להכנת חלבונים GST-מתויג (שלב 2.1). לשימוש עתידי, צלחות לעטוף ולאחסן הפוך על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 3 שבועות. בנוסף, מניות חיידקיים יכולים להיות מוכנים אחסון ממושך יותר על ידי מושבות בודדים גדל ב 2 מ"ל סטרילי Amp-LB לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. מערבבים aliquot עם גליצרול 80% סטרילי ביחס 1:1 ו ההקפאה ב -80 ° C.
2. הכנת GST-RhoA (G17A) חרוזי
- הכן LB על ידי הוספת 25 LB גרם עד 1 L DH 2 0 ו מעוקר. כאשר קריר, הוסף 50 μl Amp ממלאי כדי LB 50 מ"ל (50 מיקרוגרם / מ"ל בריכוז הסופי). לחסן עם col מבודדים היטבony של חיידקים שהפכו בן לילה לגדול ב 37 ° C בהתרגשות. כאשר בצפיפות מלאה (600 OD> 1.0) לדלל עם 450 מ"ל LB-Amp ולגדול למשך 30 דקות נוספות ב 37 ° C.
- הכן את 100 המניות mM הפתרון של איזופרופיל BD-thiogalactopyranoside (IPTG) על ידי המסת 0.238 גרם ב 10 מ"ל DH 2 א ' חנות aliquots ב -20 ° C. לגרום לחיידקים לייצר חלבון Rho על ידי הוספת 500 μl 100 מ"מ IPTG לתרבות 500 מ"ל (ריכוז סופי של 100 מיקרומטר). להפחית את הטמפרטורה ל 22-24 מעלות צלזיוס ולגדול על ~~~HEAD=NNS 16 שעות ש.
- ספין התרבות ב 3600 גרם במשך 10 דקות 4 ° C. במידת הצורך, תרבות 500 מ"ל ניתן לחלק 50 מ"ל צינורות עבור צנטריפוגה. הקפאת גלולה (ים) לפחות שעה 1 (או לילה רצוי) ב -80 ° C.
- הכן 200 מ"ל תמוגה מאגר המכיל 20 HEPES מ"מ (0.95 גר ') /-pH 7.5, 150 מ"מ NaCl (1.75 גרם) 5 מ"מ MgCl 2 (0.203 גרם); 1% TX-100 (2 מ"ל). להכין פתרונות המניות של 1M DTT (1.542 גרם 10 מ"ל DH 2 O) ו - 100 מ"מ PMSF (0.174 g/10 EtOH מ"ל). להכין מאגר + תמוגה, להשלים עם 10 מ"ל 1 מ"מ DTT (10 μl המלאי) ו 1 mM PMSF (100 μl המלאי) ואחד מיני השלם פרוטאז Tablet אינהיביטור.
- עבודה על הקרח, מוסיפים 10 מ"ל + תמוגה חיץ על כדורי משלב 2.3. Resuspend באופן יסודי על ידי vortexing עדין pipetting. הימנע קצף. Sonicate על קרח דקה 1 על הגדרת 4 עם דופק 50%. ספין lysate sonicated ב 15,000-20,000 גרם במשך 15 דקות 4 ° C, ולהסיר sonicate הבהיר (supernatant) אל צינור סטרילי 15 כתרים מ"ל.
- הכן Sepharose גלוטתיון ידי ערבוב בעדינות צינור המקורי המכיל slurry 75% ו 335 μl העברת לתוך צינור 15 מ"ל. השתמש קצה נשא רחב פיפטה חרוזים. הוסף 10 מ"ל קר PBS, ומסובב 500 גרם במשך 5 דקות על 4 ° C. מחק supernatant, להוסיף 1 תמוגה מ"ל + חוצץ על חרוזים מסתובבים כמו לשטוף הקודם. מחק למאגר supernatant ולהוסיף תמוגה + לעשות slurry 50%.
- הוסף 250 μl של equilibrated slurry חרוז כדי supernatant משלב 2.5. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
- הכן 500 מ"ל בהרוורד המכיל 20 HEPES מ"מ (2.38 גר ') / pH 7.5 ו 150 מ"מ NaCl (4.38 גר') ב DH 2 א ' להכין פתרונות המניות של MgCl 1M 2 (0.952 גרם ב 10 מ"ל DH 2 O) 1M DTT (1.542 גרם ב 10 מ"ל DH 2 O). להכין בהרוורד +, להשלים 100 מ"ל רק לפני חיבורו 5 מ"מ MgCl 2 (50 μl ממלאי) ו 1 mM DTT (100 μl ממלאי).
- לסובב את החרוזים משלב 2.7 ב 500 גרם במשך 5 דקות על 4 ° C. מחק את החרוזים supernatant ולהתרחץ פי 2 עם 10 + תמוגה מ"ל חיץ, ועל פי 2 עם 10 מ"ל + בהרוורד. לאחר שטיפה של דבר, להפוך את slurry 50% על ידי resuspending את החרוזים ב בהרוורד + השלימו עם BD BaculoGold מעכב פרוטאז (20 μl של 50x BD BaculoGold / ml).
- לדלל 10 μl של הכנת חרוזים הסופי עם חיץ Laemmli מדגם 2x המכילה β-mercaptoethanol. הפוך את שור אלבומין בסרום (BSA) סטנדרטים. השתמש 2 מ"ג / מ"ל מניות (0.02 גר 'של ארגון ה-BSA ב 10 מ"ל DH 2 O). מערבבים 10 μl של המניה עם 10 Laemmli μl (20 מיקרוגרם הסופי); 5 μl של המניה עם μl 5 של DH 2 O ו - 10 Laemmli μl (10 מיקרוגרם הסופי); ו -2.5 מניות μl עם 7.5 μl DH 2 O ו - 10 Laemmli μl (5 מיקרוגרם הסופי). מרתיחים את כל דגימות (5 דקות). ספין מדגם חרוז ולהפעיל supernatant לתקני BSA סמנים משקל מולקולרי על ג'ל SDS-polyacrylamide 10%.
- מכינים את הכתם הכחול Comassie (0.1 גרם חומצה אצטית 10 מ"ל, 40 מ"ל מתנול ו 50 מ"ל DH 2 O) והפתרון destain (500 מ"ל DH 2 O, מתנול 400 מ"ל ו 100 מ"ל חומצה אצטית). אחסן בטמפרטורת החדר. כתם ג'ל למשך 20-30 דקות, להסיר את הצבע (הוא יכול לעשות בה שימוש חוזר מספר פעמים) ולשטוף עם פתרון destain פעמיים. המשך destain עם הרעידות עדינה במשך כמה שעות עד להקות גלויים לעין.
- להעריך את ריכוז GST-RhoA (G17A) מצמידים את החרוזים באמצעות סטנדרטים BSA כהפניה (איור 2). Aliquot נפח שווה של חרוזים המכילים ~ 10-15 מיקרוגרם חלבון לתוך צינורות 1.5 מ"ל צנטריפוגות מיקרו. חנות חרוזים על 4 מעלות צלזיוס להשתמש תוך יום. להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס בהרוורד + / גליצרול ביחס 3:01 להשתמש תוך מספר ימים.
3. GEF Assay הנפתח עם נוקלאוטיד ללא RhoA (G17A) חרוזי
- לגדל תאים 10 מנות ס"מ עד המפגש. סרום לשלול לפחות 3 שעות וטיפול כנדרש.
- הכינו מאגר תמוגה + כמו בשלב 2.4. הכינו מספיק חיץ תמוגה עבור μl 700 / צלחת בתוספת כמה סכום נוסף כדי לאפשר pipetting שגיאות. מוסיפים את מעכבי הפרוטאז רק לפני השימוש.
- עבודה על הקרח, הסר בינוני תרבות מן הכלים ולשטוף עם קר כקרח בהרוורד. הסר את כל בהרוורד ולהוסיף 700 + μl חיץ תמוגה על כל מאכל. צלחות עיטורים כדי לכסות את כל האזורים, לגרד ולאסוף lysates לתוך צינורות ממוספרת 1.5 מ"ל. מסובבים גרם 15000 דקות 1 ב 4 ° C. Supernatant ישמש assay.
- אם מספר הסלולרי שלך שווה הכלהמנות נבדקות, ניתן להשמיט עושה assay חלבון, ועבור לשלב 3.5. אחרת למדוד את ריכוז החלבון של supernatant זה באמצעות ביו רד assay חלבון מהיר להשוות supernatant עבור נפח וריכוז. כמות החלבון הכולל תלוי בסוג התא בשימוש (בדרך כלל 1-1.5 מ"ג חלבון עבור LLC-PK1 תאים).
- הסרה של 30 μl של supernatant כל ומערבבים עם 2x 30 μl צמצום מאגר Laemmli המדגם, לרתיחה ומניחים בצד לצעד 3.7. הוסף supernatants הנותרים aliquots של GST-RhoA (G17A) חרוזים משלב 2.12. סובב במשך 45 דקות 4 ° C.
- ספין חרוזים ב 6800 גר 'למשך 10 שניות ב 4 ° C. מחק supernatant ולשטוף את החרוזים פי 3 עם חיץ תמוגה, ספינינג באותו אופן בין הכביסות. להסיר לחלוטין את הכביסה הסופי באמצעות מזרק 1 סמ"ק מצויד במחט G 30 ולהוסיף 20 2x μl צמצום מאגר Laemmli המדגם. מרתיחים במשך 5 דקות. ספין כדי חרוזים גלולה ואו להפעיל supernatant מיד (עדיף) או לשמור אותוt -80 ° C לצורך ניתוח מאוחר יותר.
- הפעלה 20 lysates μl סלולריים סך כל דגימות חלבון שזירזו על ג'ל המתאים אחוז SDS-polyacrylamide בגודל של GEF אתה לומד. זיהוי GEF שלך של בחירה על ידי המערבי סופג באמצעות נוגדן ספציפי.
4. נציג תוצאות
חלק 1 ו -2 לפרוטוקול מתאר הכנת GST-RhoA (G17A) מצמידים את GSH-sepharose חרוזים בדיקה על ידי SDS-PAGE (ראו תיאור כללי של הפרוטוקול על איור 1). ג'ל צבעונית טיפוסית Coomassie מוצג באיור 2. המדגם עם חלבון eluted יכילו פס יחיד על כ 50 kDa (איור 2, ליין 6). הריכוז של החלבון ניתן להעריך באמצעות דגימות התייחסות BSA. בדוגמה על איור 2, ריכוז של RhoA (G17A) מוערך 15 μg/10 μl. לכן, aliquots של μl 10 / צינור מוכנים. תשואה אופיינית ביד שלנו הוא 15-20 מיקרוגרם חלבון מן תמוגה 10 מ"ל חיידקים. חלק 3 של הפרוטוקול מתאר את המשקעים זיקה assay (ראה סקירה על איור 1). Assay מוצלח GEF גילוי ההפעלה של גורם החליפין GEF-H1 מוצג איור 3. חלבון (G17A) RhoA כבשו חלק GEF-H1 מהשלט (ללא טיפול) lysates התא, דבר המצביע על כך GEF-H1 יש פעילות הבסיס. כמות זירז עם זאת עולה בתאים שטופלו נמק הגידול ציטוקינים דלקתיים Factor-α (TNF-α), עולה בקנה אחד עם הרעיון TNF-α מפעילה GEF-H1 5,7. חשוב לציין, את lysates סלולריים בסך הכל להראות כמויות דומות של GEF-H1 בשליטה ו מדגם מטופלים, טוען כי הטיפול לא שינה GEF-H1 רמות קלט בשימוש assay שווה.
באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול.
איור 2. התוצאה נציג פרוטוקול הכנת חרוז. ג'ל צבעונית Coomassie עם הכנה מוצלחת GST-RhoA חרוז (G17A) מוצג. מדגם ביד סטנדרטים BSA חלבון הופרדו על ידי-SDS באמצעות ג'ל acrylamide 10%. כדי לבדוק את החרוזים, 10 μl של slurry חרוז הסופי המכיל GST-RhoA (G17A) מדוללת 1:01 עם צמצום מאגר Laemmli מדגם מבושל במשך 5 דקות. החרוזים היו הסתובב לרגע supernatant טעון על ג'ל. דגימות הבאים היו עמוסים: ליין 1: סמן משקל מולקולרי (MW) (FroggaBio BLUeye prestained הסולם חלבון); Lanes 2-4: 5, 10 ו - 20 מיקרוגרם אלבומין סרום שור (BSA), ליין 5 הוא ריק; ליין 6: 10 μl של שזה עתה הוכנו RhoA (G17A) חרוזים. לאחר ההפרדה הושלמה, ג'ל מוכתם באמצעות Coomassie כחול ולאחר מכן destained לגלות חלבונים. משקל מולקולרי של חלבון (G17A) GST-RhoA הוא בערך 50 kDa והוא פועל סביב רמה של הסמן 48 kDa. הריכוז של חלבון GST-Rho במדגם המסוים הזה מוערך סביב slurry μg/10 15 μl.
3. איור נציג ההפעלה GEF assay מראה TNF-α-Induced ההפעלה של GEF-H1. Confluent LLC-PK1 התאים טופלו 10 ng / ml TNF-α במשך 5 דקות. לאחר הטיפול התאים היו lysed ו GEFs פעילים נתפסו באמצעות GST-RhoA (G17A) חרוזים קשורים. הנוכחות של GEF-H1 של חלבונים שזירזו (כתם למעלה) סך הכל lysate דגימות תאים (כתם למטה) זוהה באמצעות סופג המערבי עם נוגדנים נגד GEF-H1 (איתות Cell). נא לשים לב לכמות מוגברת של זירז GEF-H1 ב TNF-α-מטופלים לעומת לא מטופלים התאים ביחס התשומות מקבילים, מה שמעיד על תוצאה מוצלחת.
3932/3932fig4.jpg "/>
איור 4. "תוצאה גרועה". למרות assay הנפתח GEF המוצג כאן הביא כמה GEF-H1 בשבי החרוזים, הסכומים זירז מ מלאה TNF-α שטופלו תאים זהים. כך TNF-α, activator מכיר GEF-H1 במקרה זה לא לגרום ההפעלה. לפתרון בעיות הניסוי הזה בפרט לאחר הציע TNF-α בשימוש לא היה טרי מספיק מושפל כנראה.
Discussion
השיטה המוצגת כאן היא זמינה רק שאינו רדיואקטיבי assay הפעלה עבור GEFs שיכולים לעקוב הבריכה פעילה של GEFs בתאים. Assay דומה מבחני משקעים המשמשים ההפעלה הבאה של GTPases קטנים, כמו גם GEFs נגד RAC ו Cdc42. מבחני אלה להשתמש שונים GST-מתוייגים חלבונים ישנם הבדלים קטנים בין 1 המתואר כאן, לעומת זאת השלבים הבסיסיים זהים. כך, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאמים עבור GTPase קטן אחר מבחני GEF ההפעלה.
Assay הציג GEF שונה לאחרונה בקשה שברים גרעיני 9,10. עם שינויים נוספים, בדיקה של הפעלת GEF בתאים subcellular אחרים יכול להיות גם אפשרי.
אנו משתמשים בשיטה הציג ללמוד הפעלת GEFs של שורות תאים אפיתל 5,6,7. עם אופטימיזציה כלשהי, assay זה צריך להיות מספיק כדי לזהות GEFs מקו כל תא. כאשר adapting לסוג תא מסוים, למצוא את מספר הנייד האופטימלי, מאגר נפח תמוגה, ואת שיטת הזיהוי של GEF להיבדק (נוגדן טוב המערבי סופג זה חשוב). על ההגדרה הראשונית של assay מומלץ להשתמש גירוי ידוע להפעיל GEF של עניין. בעת שימוש גירוי לא ידוע, תמיד להשתמש שליטה חיובית כדי לוודא assay שלך עובד. Assay זה יכול לשמש כדי לזהות הפעלת GEFs הידועים סופג המערבי. עם זאת, היא גם מספקת לזהות GEFs לא ידועים. לשם כך, GEFs שנתפסו מתוך מלאה דוגמאות מגורה יש לנתח על ג'ל Coomassie מוכתם. להקות שמופיעות רק דגימות מגורה עשוי להכיל GEFs מופעל ניתן לשלוח לזיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה (למשל 5).
לבסוף, הערה אזהרה. Assay מבוססת על ההנחה כי שינויים posttranslational עיבוד GEFs פעילים נשמרים לאחר תמוגה התא. אכן, מדובר בבירור CASE במשך מספר GEFs, ומאז המפעלים שלה, assay זה נוצל בעבר על ידי קבוצות שונות כדי לזהות הפעלת GEFs שונים, כולל GEF-H1, p115RhoGEF ו XPLN (למשל 5,11,12,13). שימור מצב פעיל אבל לא יכול לקרות במקרה של GEFs כל, ולכן מתקבל על הדעת כי assay זה לא יעבוד עבור כל GEFs. כמו כן, יש לציין, כי GEFs רבים מפעילים פעילות לכיוון אחד או יותר GTPases קטנים. לכן, כאשר GEF ספציפית נלמדת, מומלץ להשלים את assay עם מבחני GEF משקעים עבור GTPases קטנים אחרים, כמו גם מחקרים שבחנו RhoA תפקודית, Rac1 ו Cdc42.
צעדים קריטיים פרוטוקול:
מושבות של חיידקים שהפכו יש לקח מ, צלחות טריים שהוכנו כראוי על מנת להבטיח מבחר הולם של מגבר, תוצאה תשואה טובה. שינוי תנאים של תאים המוסמכות ממקורות אחרים עשויה להשתנות ויש להתייעץ. כל השלבים של הכנת פרוטוקול חלבון (משלב 2.3) ו assay (משלב 3.2) יש לבצע על 4 מעלות צלזיוס עם פתרונות התקרר צנטריפוגות.
תמוגה חיידקי (שלב 2.5) צריך להיות יסודי ושלם על מנת לקבל השעיה הומוגנית. כאשר lysing חיידקים, מערבולת ו פיפטה lysate לסירוגין, תוך שמירה על אותו 4 ° C ולהבטיח sonication נעשה על קרח כדי למנוע denaturing חלבון. אם באמצעות מודל אחר של sonicator, תנאי ייתכן שיהיה צורך להתאים. הדגירה של sonicate עם החרוזים תמיד צריך להיעשות 4 ° C על הכתף כדי להבטיח מחייב מספיק, יש להקפיד לשמור על תזמון עקבי.
GST-Rho מוטציות אינם יציבים במידה מסוימת כאשר לידי ביטוי חיידקים, לכן עדיף להשתמש חרוזים מוכנים מיד או בתוך ימים ספורים.
Assay משקעים (חלק 3) הוא זמן רגיש טמפרטורה,מכלל GEFs פעילים יכול ללכת לאיבוד בקלות lysate התא, כך צעדים יש לבצע מהר ככל האפשר.
הסעיף הבא מכיל כמה בעיות הטיפים.
לא או כמות נמוכה מאוד של חלבון Rho מוטציה לקראת החרוז האחרון: זו עשויה להיגרם על ידי גיוס יעיל, תמוגה מספקת של חיידקים, או הפסד של החלבון בתהליך ההכנה או אחסון. כדי לסייע בפתרון חלק מן האפשרויות הללו, דגימות של חיידקים ניתן לנתח לפני ואחרי הגיוס. אם יש אינדוקציה ירודה של חלבון לחזור על התהליך באמצעות המושבה מהצלחת מפוספס טרי או טרנספורמציה מחדש תאים המוסמכות. ריכוזים IPTG שונים ושעות אינדוקציה צריך גם להיבדק. אם תמוגה אינו מספיק (כלומר חלבון נשאר גלולה במקום supernatant) משתנה מלח בריכוז חומר ניקוי במאגר תמוגה אפשר להעמיד לדין. Sonication פעמים חלופיהגדרות יש לשקול, דגימות לפני ואחרי sonication ניתן לבדוק על ידי מיקרוסקופ כדי לקבוע את היעילות של תמוגה.
לא זירז GEF, למרות GST-חלבון קיים החרוזים: זה יכול להיות בגלל בעיות טכניות במהלך assay רטיבות, או על ידי היעדר אמיתי של הפעלת GEF למד באמצעות גירוי מיושם. השתמש תמיד גירוי המכונה בקרה חיובית כדי לוודא assay שלך עובד. השתמש חרוזים מוכנים תוך מספר ימים. אם assay משקעים לוכדת כמויות לגילוי של GEF הנלמדים בכל מצב, ודא GEF שלך הוא ההווה ניתן לזהות היטב supernatant לאחר צנטריפוגה זה לשמש assay (שלב 3.3). ודא שכל מאגרים מעכבי פרוטאז טריים, ולבצע את כל הפעולות על הקרח מהר ככל האפשר. להגדיל את כמות החלבון קלט (למשל, באמצעות lysates מ 2 צלחות / לדוגמה). אם assay משקעים מראה precipi הבסיססימטרייה של GEF שלך, אבל אין הבדל בין שליטה נתפסת דגימות מגורה (איור 4), להתחיל פתרון בעיות על ידי אימות כי גירוי להחיל עבד באמצעות אפקטים ידועים אחרים (למשל על ידי איתור ההפעלה של מסלולי איתות אחרים). לשקול לשנות את תנאי הטיפול ו / או ריכוזי. להסתמך על נתוני דיווח בספרות כיצד הגירוי שלך מפעילה רו או אותות אחרים לחזות פעמים נוטים וריכוזים. כאשר אופטימיזציה של זמן טיפול, להשתמש בשתי נקודות זמן קצרות וארוכות, כמו הפעלת GEF עשוי להתגלות הטוב ביותר בנקודת הזמן לפני הפעלת Rho להבחין היטב. לבסוף, אותו גירוי יכול לגרום במידה משתנה של הפעלת עקב שינוי התגובה לתאים הנגרם מספר המעבר, תא confluency וכו '
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (MOP-97774) ואת מדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר בקנדה (NSERC, מענק ע"נ: 480619). KS הוא חתן פרס החוקר KRESCENT חדש (פרס משותף של קרן הכליות של קנדה, קנדי נפרולוגיה חברה קנדית המכון לחקר הבריאות) לבין פרס חוקר מוקדמת ממשרד אונטריו של מחקר וחדשנות. FW נתמך על ידי מלגה לי קה שינג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
| DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
| SOC medium | BioShop Canada | SOC001.10 | |
| LB | BioShop Canada | LBL407.1 | Keep sterile |
| Glycerol | BioShop Canada | GLY002.1 | |
| Ampicillin | BioShop Canada | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
| Agar | BioShop Canada | AGR001.500 | |
| IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbiochem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
| Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD001.10 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-9272 | Add just before use |
| TX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| DTT | OmniPur, EMD Millipore | 3860 | Add just before use |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P-7626 | Add just before use |
| Protease Inhibitor 50x | BD Biosciences | 51-21426Z | Add just before use |
| Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche Group | 11 836 170 001 | Add just before use |
| Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Add just before use |
| Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
| Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
| Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
| BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Table 1. Reagents used | |||
| RC-5B centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
| Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
| Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
| Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
| Table 2. Specific equipments used | |||
References
- Jaffe, A. B., Hall, A. R. ho GTPases: biochemistry and biology. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).
- Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC. J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).
- Garcia-Mata, R. Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates. Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).
- Kakiashvili, E. GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability. J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).
- Waheed, F. Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase. Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).
- Kakiashvili, E. The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium. J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).
- Garcia-Mata, R., Burridge, K. Catching a GEF by its tail. Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).
- Dubash, A. D. The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals. PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).
- Guilluy, G., Dubash, A. D., García-Mata, R. Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus. Nature Protocols. , (2011).
- Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).
- Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin. J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).
- Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC. J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).
