Summary
यहां प्रस्तुत पद्धति एक उत्परिवर्ती RhoA जीएसटी संलयन प्रोटीन है कि उच्च सक्रिय GEFs के लिए संबंध है का उपयोग करने द्वारा RhoA विशिष्ट सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) / GTP संवर्धित कोशिकाओं में विनिमय कारक (GEFs) के सक्रियण का पालन करने के लिए एक परख का वर्णन करता है. GEFs सेल lysates, के पश्चिमी सोख्ता और densitometry द्वारा मात्रा से पता लगाया से उपजी है.
Protocol
1. ई. के परिवर्तन pGEX RhoA निर्माण (G17A) के साथ कोलाई
- 100 मिलीलीटर DH 2 ओ में 2.5 जी लेग और 1.5 जी अगर भंग द्वारा लेग अगर तैयार आटोक्लेव और एक अनुमान के अनुसार 50-55 डिग्री सेल्सियस, जो अंगूठे का एक नियम के रूप में है, जब कुप्पी आराम से आयोजित किया जा सकता है शांत.
- 50 / में DH 2 ओ मिलीग्राम मिलीग्राम घुला देनेवाला द्वारा तैयार एम्पीसिलीन स्टॉक (एएमपी) फिल्टर सिरिंज और अप्रयुक्त aliquots फ्रीज. लेग अगर 1.1 से 100 Amp स्टॉक की μl (अंतिम 50 एकाग्रता / μg एमएल) जोड़ें. ज़ुल्फ़ मिश्रण और 10 बैक्टीरियल व्यंजन के सेमी (15-20 मिलीग्राम / पकवान) में डालना. यह कठियाना करने के लिए (15-30 मिनट) और 2-3 हफ्तों के लिए अप्रयुक्त प्लेटें 4 में उलटा डिग्री सेल्सियस की दुकान की अनुमति दें.
- ई. को बदलने कोलाई, जल्दी से एक बर्फ स्नान में DH5α सक्षम कोशिकाओं के एक नि: शेष भाजक पिघलना. 1 pGEXRhoA (G17A) 25-50 एनजी / μl पतला डीएनए के μl जोड़ें. मिश्रण और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं ट्यूब झटका. 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड और 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह के लिए गर्मी झटका. जोड़ें 900 और म्यू, मैं समाज के मध्यम और 37 ° C पर एक घंटे के लिए झटकों के साथ बढ़ने की
- लेग अग्रवाल-amp एक तुला बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग कर प्लेट पर बदल बैक्टीरिया के 50-100 μl बिखरा हुआ है. सेते हैं थाली दाईं ओर एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए और फिर से पलटना और रात में हो जाना.
- एक एकल कॉलोनी प्रोटीन जीएसटी टैग (2.1 कदम) की तैयारी के लिए थाली से उठाया जाएगा. भविष्य में उपयोग के लिए लपेटो और दुकान प्लेटों के बारे में 3 सप्ताह के लिए डिग्री सेल्सियस 4 पर उलटा. इसके अलावा, जीवाणु स्टॉक 2 मिलीलीटर बाँझ मिलाते हुए साथ में रात भर लेग 37 ° C-amp में बढ़ते व्यक्तिगत कालोनियों से अधिक लंबे समय तक भंडारण के लिए तैयार किया जा सकता है. एक 1:1 अनुपात और फ्रीज में बाँझ 80% ग्लिसरॉल के साथ -80 में एक नि: शेष भाजक मिश्रण डिग्री सेल्सियस
2. जीएसटी के RhoA (G17A) मोती की तैयारी
- 1 एल DH 2 0 25 जी लेग जोड़ने और वाष्पदावी विसंक्रण के पौंड तैयार करते हैं. जब शांत, स्टॉक से 50 मिलीलीटर पौंड (50 μg / एमएल अंतिम एकाग्रता) 50 μl एम्प जोड़ें. एक अच्छी तरह से अलग कर्नल के साथ टीका लगानाबदल बैक्टीरिया के ony और 37 ° C पर आंदोलन के साथ रात में हो जाना. ° पूर्ण घनत्व (600 आयुध डिपो 1.0) में 450 मिलीलीटर LB-amp के साथ पतला और 37 पर एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए विकसित सी.
- 10 मिलीलीटर DH 2 ओ में 0.238 ग्राम भंग द्वारा बी.डी. thiogalactopyranoside (IPTG) इसोप्रोपाइल 100 मिमी स्टॉक समाधान की तैयारी Aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर बैक्टीरिया उत्पन्न करने के लिए 500 μl 100 मिमी 500 मिलीलीटर संस्कृति (100 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता) IPTG जोड़कर रो प्रोटीन का उत्पादन. 22-24 के लिए तापमान को कम डिग्री सेल्सियस और ~ 16 घंटे घंटे के लिए हो जाना.
- 3600 जी में संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए स्पिन यदि आवश्यक हो, 500 मिलीलीटर संस्कृति centrifugation के लिए 50 मिलीलीटर ट्यूब में विभाजित किया जा सकता है. रुक कम से कम 1 घंटे के (या अधिमानतः रातोंरात) के लिए (ओं) -80 में गोली ° सी.
- 200 मिलीलीटर lysis बफर युक्त 20 मिमी (0.95 छ) HEPES / 7.5 पीएच की तैयारी, 150 मिमी (1.75 छ) NaCl, 5 मिमी MgCl 2 (.203 छ), 1% TX - 100 (2 मिलीग्राम). 1M डीटीटी (10 मिलीलीटर DH ओ 2 में 1.542 ग्राम स्टॉक समाधान तैयार) और 100 मिमी PMSF (0.174 g/10 मिलीलीटर EtOH) के. Lysis बफर से अधिक तैयार करने के लिए, 1mm डीटीटी (स्टॉक के 10 μl) और 1 मिमी (शेयर के 100 μl) PMSF और एक पूरी मिनी protease अवरोध करनेवाला गोली के साथ 10 मिलीग्राम के पूरक.
- बर्फ पर कार्य करना, 2.3 कदम से छर्रों से 10 मिलीलीटर lysis बफर + जोड़ने. कोमल vortexing और pipetting द्वारा अच्छी तरह से Resuspend. झाग से बचें. 1 मिनट के लिए बर्फ पर 50% की नाड़ी के साथ 4 स्थापित करने में Sonicate. 15,000-20,000 जी 4 ° सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए sonicated lysate, स्पिन और एक बाँझ छाया 15 मिलीलीटर ट्यूब स्पष्ट sonicate (सतह पर तैरनेवाला) को हटाने.
- धीरे से मूल ट्यूब से युक्त एक 75% और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण 335 μl घोल मिश्रण Glutathione Sepharose द्वारा तैयार करें. मोती विंदुक एक विस्तृत बोर टिप का उपयोग करें. 10 मिलीलीटर ठंड पीबीएस जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 4 पर 500 जी स्पिन डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला त्यागें, मोतियों के लिए 1 मिलीग्राम lysis बफर + जोड़ सकते हैं और पिछले धोने के लिए के रूप में स्पिन. सतह पर तैरनेवाला और ऐड lysis बफर के लिए एक 50% घोल बनाने + त्यागें.
- Equil की 250 μl जोड़ें2.5 कदम से सतह पर तैरनेवाला मनका घोल ibrated. 45 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 4 पर घुमाएँ.
- 500 मिलीलीटर 20 मिमी HEPES के (2.38 छ) युक्त HBS / पीएच 7.5 और DH 2 ओ में 150 मिमी NaCl (4.38 छ) तैयार 1M 2 MgCl (10 मिलीलीटर DH 2 हे में .952 छ) और 1M डीटीटी (10 मिलीलीटर 2 हे DH में 1.542 ग्राम) का स्टॉक समाधान तैयार. HBS + को तैयार करने के लिए, 100 मिलीग्राम के पूरक सिर्फ 5 मिमी 2 MgCl (शेयर से 50 μl) और 1 मिमी डीटीटी (स्टॉक से 100 μl) के साथ उपयोग करने से पहले.
- 500 जी में 2.7 कदम से मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्पिन सतह पर तैरनेवाला और धोने के 10 मिलीलीटर lysis बफर + के साथ 2x मोती त्यागें, और 10 मिलीलीटर + HBS के साथ 2x. अंतिम धोने के बाद, HBS में मोती + बी.डी. BaculoGold protease अवरोध करनेवाला (से 50x बी.डी. BaculoGold / एमएल की 20 μl) के साथ पूरक resuspending द्वारा एक 50% घोल कर.
- 2x Laemmli नमूना बफर β-mercaptoethanol युक्त के साथ अंतिम मोती तैयारी की 10 μl पतला. गोजातीय सीरम albumin (BSA) के मानकों करें. 2 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक (1 में 0.02 BSA के जी का प्रयोग करें0 मिलीलीटर DH 2 हे). DH 2 हे और 10 μl Laemmli (10 μg अंतिम) के 5 μl के साथ शेयर के 5 μl, और 7.5 μl DH 2 हे और 10 μl Laemmli के साथ 2.5 μl स्टॉक 10 μl (20 अंतिम μg) Laemmli के साथ शेयर की 10 μl मिश्रण (अंतिम 5 μg). सभी नमूने (5 मिनट) को उबाल लें. मनका नमूना घुमाओ और BSA 10% एसडीएस polyacrylamide जेल पर और मानकों आणविक वजन मार्करों के साथ सतह पर तैरनेवाला चलाने के.
- और destain समाधान (500 मिलीलीटर DH 2 हे, 400 मिलीग्राम मेथनॉल और 100 मिलीलीटर एसिटिक एसिड) (10 मिलीलीटर एसिटिक एसिड, 40 मिलीग्राम मेथनॉल और 50 मिलीलीटर 2 हे DH में 0.1 ग्राम) Comassie ब्लू दाग तैयार. स्टोर कमरे के तापमान पर. 20-30 मिनट के लिए जेल दाग, डाई हटाने के (यह कई बार reused किया जा सकता है) और दो बार destain समाधान के साथ कुल्ला. जारी रखें जब तक बैंड को स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं कई घंटे के लिए कोमल झटकों के साथ destain.
- मोती BSA मानकों एक संदर्भ के रूप में (चित्र 2) का उपयोग करने के लिए मिलकर जीएसटी RhoA (G17A) की एकाग्रता का अनुमान है. Aliquo1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में ~ 10-15 μg प्रोटीन युक्त मोतियों की एक बराबर मात्रा. दुकान मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर एक दिन के भीतर का उपयोग करने के लिए. -80 में रुक ° HBS में कुछ दिनों के भीतर का उपयोग करने के लिए एक 3:1 अनुपात में सी + / ग्लिसरॉल.
3. जीईएफ nucleotide मुक्त RhoA मोती (G17A) के साथ pulldown परख
- संगम के लिए 10 सेमी बर्तन में कोशिकाओं को विकसित. सीरम कम से कम 3 घंटे के लिए वंचित और इलाज के रूप में आवश्यक है.
- Lysis बफर तैयार + 2.4 चरण में है. पर्याप्त lysis बफर 700 μl / पकवान के साथ साथ कुछ अतिरिक्त राशि लिए त्रुटियों pipetting के लिए अनुमति के लिए तैयार करते हैं. बस का उपयोग करने से पहले protease inhibitors जोड़ें.
- बर्फ पर कार्य करना, बर्तन संस्कृति के माध्यम से हटाने और बर्फ की ठंड HBS से धो. सभी HBS निकालें और प्रत्येक पकवान 700 μl lysis बफर अधिक जोड़ें. भंवर प्लेटें परिमार्जन करने के लिए सभी क्षेत्रों को कवर, और गिने 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में lysates लेने. 1 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 15,000 जी पर स्पिन सतह पर तैरनेवाला परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- यदि सभी में अपने सेल नंबर बराबर हैव्यंजन परीक्षण किया जा रहा है, तो आप एक प्रोटीन परख कर छोड़ देते हैं, कर सकते हैं और चरण से 3.5 चाल. अन्यथा प्रत्येक जैव रेड त्वरित प्रोटीन परख का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला के प्रोटीन एकाग्रता को मापने और मात्रा और एकाग्रता के लिए सतह पर तैरनेवाला बराबर. कुल प्रोटीन की मात्रा इस्तेमाल किया (आमतौर पर LLC PK1 - कोशिकाओं के लिए 1-1.5 मिलीग्राम प्रोटीन) सेल प्रकार पर निर्भर करता है.
- 30 μl 2x Laemmli नमूना बफर फोड़ा, कम करने के साथ प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला और मिश्रण के 30 μl निकालें और 3.7 कदम के लिए अलग सेट. जीएसटी RhoA 2.12 कदम से (G17A) मोती की aliquots शेष supernatants जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए घुमाएँ
- 6800 जी में मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के लिए स्पिन सतह पर तैरनेवाला त्यागें और lysis बफर के साथ 3x मोती धोने, washes के बीच एक ही रास्ता में कताई. पूरी तरह से अंतिम धोने के 1 सीसी एक 30 जी सुई के साथ फिट सिरिंज का उपयोग कर हटाने और 20 μl Laemmli नमूना बफर को कम करने 2x जोड़ें. 5 मिनट के लिए उबाल लें. गोली मोती स्पिन करने के लिए और या तो सतह पर तैरनेवाला तुरंत चला (बेहतर) या यह दुकान एकटी -80 ° सी बाद में विश्लेषण के लिए.
- 20 μl कुल सेल जीईएफ के आकार आप का अध्ययन कर रहे हैं के लिए उपयुक्त प्रतिशत एसडीएस polyacrylamide जेल पर और lysates उपजी प्रोटीन के नमूने के सभी चलाएँ. पश्चिमी सोख्ता एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके अपनी पसंद की जीईएफ का पता लगाने.
4. प्रतिनिधि परिणाम
प्रोटोकॉल के भाग 1 और 2 (G17A) जीएसटी RhoA एसडीएस पृष्ठ (1 चित्र पर प्रोटोकॉल की रूपरेखा देख) GSH sepharose मोती और इसके परीक्षण के लिए युग्मित की तैयारी का वर्णन करता है. एक ठेठ Coomassie दाग जेल 2 छवि पर दिखाया जाता है. नमूना eluted प्रोटीन के साथ लगभग 50 केडीए (2 अंजीर, लेन 6) पर एक एकल बैंड शामिल करना चाहिए. प्रोटीन की एकाग्रता बीएसए संदर्भ नमूने का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है. 2 छवि पर उदाहरण में, RhoA (G17A) की एकाग्रता 15 μg/10 μl होने का अनुमान है. इस प्रकार, 10 μl / ट्यूब की aliquots तैयार थे. ठेठ उपज हमारे हाथ में 10 मिलीलीटर बैक्टीरियल सेल से 15-20 μg प्रोटीन है. प्रोटोकॉल के भाग 3 संबंध तेज़ी परख (1 छवि पर अवलोकन देखें) का वर्णन करता है. एक सफल जीईएफ परख विनिमय कारक जीईएफ-H1 के सक्रियण का पता लगाने के 3 चित्र पर दिखाया गया है. RhoA प्रोटीन (G17A) नियंत्रण (इलाज) सेल lysates से कुछ जीईएफ-H1 पर कब्जा कर लिया, सुझाव है कि जीईएफ-H1 बेसल गतिविधि है. राशि लेकिन कोशिकाओं में वृद्धि भड़काऊ cytokine ट्यूमर परिगलन फैक्टर α (TNF-α) के साथ इलाज किया, धारणा है कि TNF-α 5,7 जीईएफ-H1 सक्रिय के साथ संगत उपजी. महत्वपूर्ण बात, कुल सेल lysates नियंत्रण और इलाज के नमूने में जीईएफ-H1 की समान मात्रा में दिखाने के लिए, सुझाव है कि उपचार जीईएफ-H1 के स्तर को बदल नहीं किया था और परख में इस्तेमाल किया इनपुट बराबर है.
चित्रा 1 प्रोटोकॉल का अवलोकन.
चित्रा 2 मनका तैयारी प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि परिणाम. एक Coomassie दाग जेल सफल जीएसटी RhoA मनका (G17A) के तैयारी के साथ दिखाया गया है. मनका नमूना और BSA प्रोटीन मानकों एसडीएस पृष्ठ एक 10% acrylamide जेल का उपयोग कर से अलग हो गए थे. मोती परीक्षण करने के लिए, अंतिम मनका जीएसटी RhoA (G17A) युक्त घोल का 10 μl 5 मिनट के लिए Laemmli नमूना बफर और उबला हुआ कम करने के साथ 1:1 पतला है. मोती संक्षिप्त काता गया है और सतह पर तैरनेवाला जेल पर भरा हुआ है. निम्नलिखित नमूने गया लोड: लेन 1: आणविक वजन (मेगावाट) मार्कर (FroggaBio BLUeye प्रोटीन सीढ़ी prestained है), 2-4 लेन: 5, 10 और 20 μg गोजातीय सीरम albumin (BSA) के, लेन 5 खाली है, 6 लेन: 10 हौसले से तैयार RhoA मोती (G17A) की μl. जुदाई के बाद पूरा हो गया है, जेल Coomassie ब्लू का उपयोग सना हुआ और बाद में प्रोटीन प्रकट destained. जीएसटी - RhoA प्रोटीन (G17A) की आणविक भार लगभग 50 केडीए और 48 केडीए मार्कर के स्तर के आसपास चलाता है. इस विशेष नमूना में प्रोटीन की एकाग्रता जीएसटी - रो 15 μg/10 μl घोल के आसपास होने का अनुमान है.
चित्रा 3. प्रतिनिधि जीईएफ सक्रियण परख जीईएफ H1 के सक्रियण TNF-α प्रेरित दिखा. TNF-α 10 एनजी / एमएल के साथ मिला हुआ LLC-PK1 कोशिकाओं के 5 मिनट के लिए इलाज किया गया. इलाज के बाद कोशिकाओं lysed और थे सक्रिय GEFs के (G17A) जीएसटी RhoA बाध्य मोती का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. उपजी (ऊपर धब्बा) प्रोटीन और कुल सेल lysate नमूने के (तल धब्बा) में जीईएफ-H1 की उपस्थिति के विरोधी जीईएफ-H1 प्रतिरक्षी (सेल संकेतन) के साथ पश्चिमी सोख्ता प्रयोग पाया गया. कृपया ध्यान दें गैर इलाज बराबर जानकारी के लिए सापेक्ष कोशिकाओं बनाम TNF-α इलाज में उपजी जीईएफ - एच 1 की वृद्धि हुई राशि, एक सफल परिणाम का संकेत है.
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चित्रा 4 एक "बुरा परिणाम". हालांकि जीईएफ लटकती परख यहाँ दिखाया कुछ मोती द्वारा कब्जा कर लिया जीईएफ-H1 के परिणामस्वरूप मात्रा में नियंत्रण से उपजी और TNF-α का इलाज कोशिकाओं को एक ही हैं. इस प्रकार TNF-α, इस मामले में जीईएफ-H1 पता उत्प्रेरक सक्रियण के लिए प्रेरित नहीं किया. यह विशेष रूप से प्रयोग बाद में समस्या निवारण में सुझाव दिया है कि इस्तेमाल किया TNF-α काफी ताजा और शायद अपमानित नहीं था.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि केवल उपलब्ध गैर रेडियोधर्मी GEFs है कि कोशिकाओं में GEFs के सक्रिय पूल का पालन कर सकते हैं के लिए सक्रियण परख है. परख तेज़ी छोटे GTPases के निम्नलिखित सक्रियण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आरएसी और Cdc42 के खिलाफ GEFs के लिए इस्तेमाल किया assays के लिए इसी तरह की है. उन assays अलग जीएसटी टैग प्रोटीन का उपयोग करें और से यहाँ वर्णित एक मामूली अंतर है, लेकिन बुनियादी कदम वही कर रहे हैं. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य छोटे GTPase और जीईएफ सक्रियण assays के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
प्रस्तुत जीईएफ परख हाल ही में परमाणु 9,10 भिन्न के लिए आवेदन के लिए संशोधित किया गया था. आगे के संशोधनों के साथ, अन्य subcellular डिब्बों में जीईएफ सक्रियण के परीक्षण भी संभव हो सकता है.
हम प्रस्तुत करने के लिए उपकला कोशिका लाइनों में 5,6,7 GEFs के सक्रियण अध्ययन विधि का उपयोग करें. कुछ अनुकूलन के साथ, इस परख के लिए किसी भी कोशिका लाइन से GEFs का पता लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. जब adaptiएक विशेष सेल प्रकार, इष्टतम सेल संख्या, lysis बफर आयतन, और जीईएफ के लिए विधि का पता लगाने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए एनजी मिल (पश्चिमी सोख्ता लिए एक अच्छा प्रतिरक्षी महत्वपूर्ण है). परख की प्रारंभिक सेटअप के लिए यह एक प्रेरणा है कि ब्याज की जीईएफ को सक्रिय करने के लिए जाना जाता है का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है. जब एक अज्ञात प्रेरणा का उपयोग कर, हमेशा की एक सकारात्मक नियंत्रण के उपयोग के लिए सत्यापित करें कि आपके परख काम कर रहा है. इस परख पश्चिमी सोख्ता द्वारा ज्ञात GEFs के सक्रियण पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह भी पर्याप्त लिए अज्ञात GEFs की पहचान है. इस के लिए, नियंत्रण और प्रेरित नमूनों से कब्जा कर लिया GEFs Coomassie से सना हुआ एक जेल पर विश्लेषण किया जाना चाहिए. बैंड है कि केवल उत्तेजित नमूनों में दिखाई में सक्रिय GEFs हो और पहचान के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री (5 उदाहरण के लिए) द्वारा भेजा जा सकता है हो सकता है.
अंत में, एक सजग नोट. परख धारणा है कि posttranslational सक्रिय GEFs प्रतिपादन संशोधनों सेल के बाद संरक्षित कर रहे हैं पर आधारित है. दरअसल, यह स्पष्ट रूप से है क्षमताओंसे GEFs की एक संख्या के लिए, और अपने प्रतिष्ठानों के बाद से, इस परख विभिन्न समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है जीईएफ H1, p115RhoGEF और XPLN (जैसे 5,11,12,13) सहित विभिन्न GEFs के, की सक्रियता का पता लगाने. सक्रिय राज्य के संरक्षण लेकिन सभी GEFs के मामले में नहीं होता है, और इसलिए यह बोधगम्य है कि इस परख सभी GEFs के लिए काम नहीं करेगा हो सकता है. यह भी ध्यान दिया जाना है, कि कई GEFs एक से अधिक छोटे GTPases की ओर गतिविधि डालती है. इस प्रकार, जब एक विशिष्ट जीईएफ अध्ययन किया है, यह में जीईएफ अन्य छोटे GTPases, के रूप में के रूप में अच्छी तरह कार्यात्मक अध्ययन RhoA, Rac1 और Cdc42 की जांच के लिए तेज़ी assays के साथ इस परख पूरक की सिफारिश की है.
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम:
बदल बैक्टीरिया की कालोनियों ताजा, ठीक से तैयार प्लेट से उठाया amp, अच्छा परिणाम उपज और पर्याप्त चयन सुनिश्चित किया जाना चाहिए. सक्षम अन्य स्रोतों से प्राप्त कोशिकाओं के लिए परिवर्तन की स्थिति भिन्न है और परामर्श किया जाना चाहिए सकता है. प्रोटीन तैयारी (2.3 कदम से) प्रोटोकॉल और परख (3.2 कदम से) के सभी चरणों ° ठंडा समाधान और centrifuges के साथ सी 4 बजे किया जाना चाहिए.
बैक्टीरियल सेल (2.5 कदम) व्यापक और पूर्ण आदेश में एक सजातीय निलंबन प्राप्त करना चाहिए. जब बैक्टीरिया lysing भंवर, और lysate एकांतर पिपेट, जबकि यह 4 ° सेल्सियस पर बनाए रखने और सुनिश्चित sonication प्रोटीन denaturing रोकने के लिए बर्फ पर किया जाता है. यदि sonicator की एक अलग मॉडल का उपयोग कर, स्थितियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. मोतियों के साथ sonicate की ऊष्मायन हमेशा एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जा करने के लिए पर्याप्त बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए, और देखभाल करने के लिए लगातार समय रखने के लिए लिया जाना चाहिए.
जीएसटी - रो म्यूटेंट को कुछ हद तक अस्थिर कर रहे हैं जब बैक्टीरिया में व्यक्त की, तो यह सबसे अच्छा है सही दूर या कुछ दिनों के भीतर तैयार मोती का उपयोग करें.
तेज़ी परख (भाग 3) समय और तापमान संवेदनशील है,सक्रिय GEFs आसानी सेल lysate से खो किया जा सकता है, तो चरण में जल्दी के रूप में के रूप में संभव है किया जाना चाहिए.
निम्न खंड कुछ मुसीबत शूटिंग युक्तियाँ शामिल हैं.
नहीं या अंतिम मनका तैयारी में उत्परिवर्ती रो प्रोटीन की बहुत कम राशि: यह अक्षम प्रेरण, बैक्टीरिया की अपर्याप्त lysis, या तैयार करने की प्रक्रिया या भंडारण के दौरान प्रोटीन का एक नुकसान के कारण हो सकता है. इन संभावनाओं के कुछ समस्या निवारण में मदद करने के लिए, बैक्टीरिया के नमूने से पहले और बाद में शामिल विश्लेषण किया जा सकता है. अगर वहाँ प्रोटीन एक नया रेखादार थाली से या फिर बदल सक्षम कोशिकाओं से एक कॉलोनी का उपयोग इस प्रक्रिया को दोहराने के गरीब शामिल है. अलग IPTG सांद्रता और प्रेरण बार भी परीक्षण किया जाना चाहिए. अगर सेल (यानी प्रोटीन सतह पर तैरनेवाला के बजाय गोली में रहता है) अपर्याप्त lysis बफर में नमक और डिटर्जेंट के अलग सांद्रता है की कोशिश की जा सकती है. वैकल्पिक sonication बार औरसेटिंग्स, विचार किया जाना चाहिए और सेल की क्षमता निर्धारित करने के लिए पहले और बाद sonication नमूनों माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच की जा सकती है.
नहीं जीईएफ उपजी है, भले ही जीएसटी प्रोटीन मनकों पर मौजूद है: यह तेज़ी परख के दौरान तकनीकी मुद्दों के कारण हो सकता है, हो सकता है या अध्ययन जीईएफ की सक्रियण लागू प्रेरणा का उपयोग का एक वास्तविक अनुपस्थिति द्वारा. हमेशा सत्यापित करें कि आपके परख काम करता है के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जाना जाता है उत्तेजना का उपयोग करें. कुछ दिनों के भीतर तैयार मोतियों का प्रयोग करें. यदि तेज़ी परख जीईएफ की undetectable मात्रा में सभी परिस्थितियों में अध्ययन कब्जा, सत्यापित करें कि आपके जीईएफ मौजूद और centrifugation कि परख (3.3 कदम) के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है के बाद अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला में detectable है. सुनिश्चित करें कि सभी buffers और protease inhibitors के ताजा कर रहे हैं, और संभव के रूप में उपवास के रूप में बर्फ पर सभी चरणों का पालन करें. इनपुट प्रोटीन (2 प्लेटें / नमूना से lysates का उपयोग करके जैसे) की मात्रा बढ़ाएँ. है यदि वर्षण परख बेसल precipi से पता चलता हैआपके जीईएफ tation, लेकिन नियंत्रण और उत्तेजित नमूने (चित्र 4) के बीच कोई अंतर नहीं देखा है, पुष्टि है कि लागू उत्तेजना अन्य ज्ञात प्रभाव (अन्य संकेत दे रास्ते की सक्रियता का पता लगाने के द्वारा उदाहरण के लिए) का उपयोग कर काम कर समस्या निवारण शुरू करते हैं. उपचार शर्तों और / या सांद्रता को बदलने पर विचार करें. डेटा साहित्य रिपोर्टिंग से आपके प्रोत्साहन रो या अन्य संकेतन सक्रिय करने की संभावना समय और सांद्रता भविष्यवाणी पर भरोसा करते हैं. जब इलाज समय अनुकूलन, दोनों कम और लंबे समय के अंक का उपयोग करने के लिए, के रूप में जीईएफ सक्रियण एक समय अच्छी तरह से detectable रो सक्रियण से पहले बिंदु पर सबसे अच्छा detectable हो सकता है. अंत में, एक ही उत्तेजना बीतने संख्या की वजह से सेल प्रतिक्रिया में परिवर्तन की वजह से सक्रियण के एक चर डिग्री, confluency सेल, आदि में परिणाम सकता है
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा संस्थान (CIHR) (एमओपी 97,774) और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा (480,619 NSERC अनुदान एन.आर.) द्वारा वित्त पोषित किया गया. एस एक KRESCENT नई अन्वेषक पुरस्कार (कनाडा, कनाडा के नेफ्रोलोजी सोसायटी और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान की किडनी फाउंडेशन के संयुक्त पुरस्कार) और ओंटारियो मंत्रालय के अनुसंधान और अभिनव से एक प्रारंभिक शोधक पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है. परिवार कल्याण ली का शिंग छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
| DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
| SOC medium | BioShop Canada | SOC001.10 | |
| LB | BioShop Canada | LBL407.1 | Keep sterile |
| Glycerol | BioShop Canada | GLY002.1 | |
| Ampicillin | BioShop Canada | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
| Agar | BioShop Canada | AGR001.500 | |
| IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbiochem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
| Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD001.10 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-9272 | Add just before use |
| TX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| DTT | OmniPur, EMD Millipore | 3860 | Add just before use |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P-7626 | Add just before use |
| Protease Inhibitor 50x | BD Biosciences | 51-21426Z | Add just before use |
| Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche Group | 11 836 170 001 | Add just before use |
| Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Add just before use |
| Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
| Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
| Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
| BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Table 1. Reagents used | |||
| RC-5B centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
| Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
| Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
| Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
| Table 2. Specific equipments used | |||
References
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- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).
- Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC. J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).
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- Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).
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