Summary
一个肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的小鼠模型研究,临床和行为。作为一个伴随的免疫组织化学分析的前提下编制的脊髓详细描述。
Abstract
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)是一种致命的神经退行性疾病导致运动神经元逐渐退化。零星的疾病,约50多年的家族性疾病的发病高峰是60岁。由于它的前进方向,50%的患者症状发作后30个月内死亡。为了评估这种疾病的新型治疗方案,基于对人类家族中的超氧化物歧化酶基因突变的SOD1(G93A)突变,如ALS的遗传小鼠模型已产生。最重要的方面,必须评估模型是整体存活率,临床过程和运动功能。在这里,我们证明了临床评价,显示两种行为的电机测试的传导,并提供所有参数的定量评分系统。因为在ALS小鼠模型的深入分析,通常需要的脊髓免疫组化检查,我们展示了其应用做准备详细RSAL椎板方法。模范病理结果证实。 ALS小鼠模型的研究中描绘的检查方法的综合应用,将使研究人员能够可靠地测试未来的治疗方案,它可以提供一个为以后的人体临床试验的基础上。
Protocol
动物购自杰克逊实验室(#002726)1。他们在临床上得分和遭受的运动功能(旋转试验),肌力(悬丝试验)测试。所有这些测试,并以准备脊髓后杀害动物已按照非常接近当地的指引适当进行动物实验。
1。临床评分
除了 体重小鼠的评估检查以下4点计分制2电机赤字的迹象:
4分:正常(无运动功能障碍的迹象)
3点:后肢震颤是显而易见的,当尾巴暂停
2分:步态异常是目前
1点:至少有一个后肢拖
0点:对称瘫痪,不能以自己的权利或损失最大体重的20%;在这种情况下,立即安乐死动物实验终止
2。运动功能和肌肉力量的测试
吊线
这个测试是用来评估肌力3,4。所有的动物进行旋转试验后,至少有一至两天的测试。每个鼠标被放置在一个0.8厘米的间隔定制丝盖和谨慎天翻地覆,60厘米以上的稻草覆盖的底部。经过培训至少180秒连续三次下降的延迟测量。每个鼠标三次尝试举行倒盖一个180秒的最高和最长记录。
旋转试验
3,4。良好的性能,需要高度的感觉协调。本机应放置在一个平静和非令人不安的环境,以避免对试验动物的牵张刺激。它由计算机控制的电动机驱动旋转主轴和五鼠五车道。小鼠的瀑布是在底部的塑料板自动检测压力。培训后连续三年至少有180秒的时间,在15转的时间,动物可以保持旋转杆的恒定速度进行了测量。每个动物都经历了三个试验和最长潜伏期,没有下降记录。被选为截止时间180秒的时间,在这段时间内检测,因为大多数的动作协调性的显着性差异。
3。脊髓制备
- 动物被杀害的CO 2气腹,根据当地的指引立即transcardially灌注4%多聚甲醛溶液PBS溶液。
- 为了准备牺牲鼠标的脊髓,动物被放置到一个操作表和四肢上侧固定,为了揭露鼠标的背面。
- 一个短洗了70%的乙醇溶液清洗清扫现场,平坦的被毛。
- 用锋利的手术刀在中线皮肤切开。为了方便切割皮肤向两侧伸展。如果腿部肌肉应做好准备,他们的皮肤也被切开。
- 皮肤切口完成后,被拉到一边,一个镊子,暴露身体的底层浅筋膜。
- 颈部肌肉和颈部韧带被删除,是CArefully准备。要小心,不要切开深入病灶脊髓。肩膀肌肉也可以被删除,以便更好地暴露脊柱。
- 然后从整个脊柱椎旁肌。
- 为了打开脊柱几个laminectomies必须执行。每个人都应该从颅上的部分,在寰枕关节部位。
- 这是最简单的删除上两肢固定和量力的颈部,能够更好地执行第一腰椎椎板。这些被拉走,而不触及暴露的脊髓型颈椎病。
- 更多的椎骨被删除第一横断直角剪刀两侧椎拱门,然后拉背进程。应删除余下的椎骨的侧部,便于以后的脊髓完全去除。
- 腰脊柱的解剖标志升线是在颈髓,这也是目前的肿大。
- 说完整个脊髓椎板,确保你也横切所有腹侧根和释放脑膜脊髓硬膜。
- 然后颅颈脊髓被切断,你开始清除脊髓。
- 最后在远端马尾,马尾也切断脊髓完全释放。
- 最终,脊髓被放置到postfixating解决方案(如4%多聚甲醛)过夜,并可以进一步处理。我们通常冰冻切片脊髓免疫组织化学分析准备。
4。代表结果
脊髓制备技术代表本视频文章的重点。这是一个必不可少的先决条件,为以后的组织切片和免疫组化分析,最终为脊柱升线部分。作为最终结果的一个例子,鼠标的前角区域的鼠标一个野生的脊柱脊髓腰(WT)和免疫组化的SOD G93A转基因(TG)相关检验证明。运动神经元,可确定一个主抗胆碱抗体和随后的次要Cy3标记抗体荧光标记。此外,用DAPI(4,6-diamidino-2-苯基)核反污渍已完成( 图1)。
可视化与抗胆碱抗体(红色)和反染色细胞的细胞核用DAPI(蓝色)的野生型(WT)鼠标腰脊髓前角(左)和运动神经元的免疫检测的荧光显微图1。 G93A转基因是一种SOD(TG)(右)在130天的年龄鼠标。比例尺:40微米。
由于免疫组化分析G93A小鼠的超氧化物歧化酶是不是这篇文章的主要范围,请咨询原始出版物在这些转基因小鼠已特点和治疗方法的研究进一步参考文献1,5,6最近的。如果治疗效果,应区分明确了免疫组化水平定量评估算法应适用于支持由体视软件(例如见7)。
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Discussion
的SOD1(G93A)基因小鼠模型是一个有价值的动物模型,研究病程渐进的运动神经元的损失相比,人类肌萎缩性侧索硬化症8。在这个模型中,各种不同的治疗模式已被评估,并表示以后在人类的临床研究8-10测试的基础上。为了能够检测这些小鼠的实验治疗研究中的显着性差异,这是著名的重要性,包括至少24产仔匹配的性别平衡相同的遗传背景的小鼠和遵循双盲设计8。媲美人体临床研究,一个统一的端点标准应选择。这里,最常用的是动物不能在30秒后,被放置在其一侧权利本身。如果达到这个标准,动物被牺牲和它的续航时间记录的生存时间。
treatmeNT的研究,可以在1临床症状前的状态(例如,在开始一天的生活(DOL)的50元甚至上劳工部30日)当动物不表现出任何运动功能障碍的迹象,并会打进4点在我们的临床评分系统。另一种可能性,包括在对症治疗的方法,应该启动时首次出现临床症状和动物的尾巴被暂停时,后肢震颤明显。这被定义为发病和这个初始的疾病阶段评分与临床评分3。运动功能和肌肉力量测试的重大障碍,大多只有超过两到四个星期后发生。动物平均达到约劳工部80第一临床疾病的阶段,一些研究者开始对所有动物的对症治疗,他们在这个时间点在一个简化的方法。在这两个设置,它是强制性的,以监测疾病的进展。这应开始在开始治疗的时间为presymptomatically治疗为对症治疗的动物,动物(50劳工部或劳工部30,分别)或劳工部70。监测疾病的进展,包括体重,临床神经功能评分和运动功能的测试和肌肉力量,每周两次的决心。如果动物达到临床1分(至少一个后肢拖),我们建议进行每日测定体重和临床监测,以便不要错过临床得分0点(对称瘫痪,无法自己的权利或损失20 %最大体重)时,动物,必须立即实施安乐死和实验终止。据建议,第一次的考官是谁也有助于检测微妙的临床症状进展的一个经验丰富的动物研究员的指导下。临床4点得分后,Weydt 等 2系统以及建立在该领域,是一个可靠的系统,使用可明显区分的标准。一更微妙的临床症状的分化将是不太清楚,高度依赖考官。
为了检测行为赤字各种测试范例。大多数学者主张旋转试验,评估动物的能力,运行在一个旋转的11缸4。在评价意义的SOD1 G93A小鼠模型的行为测试研究旋转试验证明是在11日早从16岁周检测野生型和转基因小鼠之间的显着差异非常敏感。可能的修改包括运行在一个恒定的速度或加速运行。在任何情况下,动物训练之前的第一个有效的测试,因为有些人可能需要比别人更多的培训,取得了运动协调的基本水平。代表不同的动机动物的限制,来执行这项任务。然而,这可以补偿由日至少重复测试每次考试当天稀土元素倍。另一个电机行为测试,这是非常敏感的检测早期运动障碍是足迹分析11。然而,这是相当艰苦的,因为动物要积极地跑过来后,他们的脚蘸油漆水库跳板。足迹的质量在很大程度上可以改变和软件辅助分析是困难的。因此,我们更喜欢的运动协调性的评价旋转试验。
挂线测试评估四肢肌力。这是一个相当粗略的测试,最好的检测早期肌肉赤字,几个星期后引发的疾病4。但是,它是很容易执行,整个测试仪器可以很容易地构建。一个更详细的测试,肌肉力量,是一个力传感器12。在这里,鼠标提示抓住后腿或者其脱颖而出的力传感器连接到一间酒吧爪子。必须考虑到其他功能测试包括的运行轮距离的测量,甚至开3场活动的评价,13。然而,在我们的经验rotarod和悬丝试验的组合被证明是最敏感,最容易可行和时间效率的评价G93A SOD1的老鼠。总体而言,在动物的临床前研究,应非常仔细地设计和应遵循的人体临床试验的基本原则CONSORT指南( www.consort statement.org )14。只有到那时,对动物的临床前研究使用,可以合理的,最终的结果可能导致进入人体临床应用的成功翻译。
这些临床和行为的结果,应始终与神经肌肉单位的病理分析,包括脊髓摩托神经元,轴突和神经肌肉交界处14。在这里,高品质的中枢神经系统脊柱脊髓病理分析是为生存或疾病进展的影响解释的一个先决条件。由于彻底的组织固定是关键,动物灌注4%多聚甲醛PBS的解决方案应该是标准化。为了能够小心地取出脊髓,应一次解剖表一起安装有一个固定的手术显微镜和精细的手术器械必须是可用(见下面的手术器械清单)。整个脊髓后已被删除,它可以处理,以适当的切片技术(如vibratome或cryotome),终于可以受到免疫组织化学分析。在这里,基本评价参数是脊髓运动神经元和胶质细胞激活或浸润,10,15的数字。根据原始研究的问题,增加免疫米如超氧化物歧化酶聚集arkers或中枢神经系统血管内皮细胞的完整性进行评估。此外,周围神经系统疾病的病理,可以由周围神经轴突和神经肌肉接头的检查评估。只有CNS和PNS的临床和免疫组织化学分析相结合,提供了一个彻底的整体ALS的病理与临床结果相关。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
审裁处已收到来自中医药大学哥廷根Forschungsförderungsprogramm的资金支持。 PL和MB分别由东风集团的大脑(郊野公园及海岸公园委员会),哥廷根大学分子生理学研究中心的支持。作者感谢录像和比吉特Liebau的援助,音频和视频编辑的帮助医生拉尔斯Tatenhorst。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
Hanging wire device | Custom Made | ||
Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
“Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
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