Summary
Amyotrophic पार्श्व काठिन्य (ए एल एस) के लिए एक माउस मॉडल चिकित्सकीय और behaviorally जांच की है. एक साथ immunohistological विश्लेषण के लिए एक शर्त के रूप में रीढ़ की हड्डी की तैयारी में विस्तार से दर्शाया जाता है.
Abstract
Amyotrophic पार्श्व काठिन्य (ए एल एस) एक घातक neurodegenerative विकार motoneurons के प्रगतिशील अध: पतन में जिसके परिणामस्वरूप है. चोटी शुरुआत की छिटपुट रोग के लिए और पारिवारिक रोग के लिए 50 साल के आसपास 60 वर्ष के आसपास है. अपनी प्रगतिशील पाठ्यक्रम के कारण रोगियों का 50% लक्षण शुरू होने के 30 महीने के भीतर मर जाते हैं. आदेश में इस रोग के लिए उपन्यास उपचार के विकल्प का मूल्यांकन करने के लिए ALS का आनुवंशिक माउस मॉडल वतन जीन में मानव पारिवारिक SOD1 उत्परिवर्तन (G93A) के रूप में, परिवर्तन के आधार पर उत्पन्न किया गया है. सबसे महत्वपूर्ण पहलू है कि मॉडल में मूल्यांकन किया जाना है समग्र अस्तित्व, नैदानिक पाठ्यक्रम और मोटर समारोह कर रहे हैं. यहाँ, हम नैदानिक मूल्यांकन का प्रदर्शन, दो व्यवहार मोटर के परीक्षण के प्रवाहकत्त्व दिखा और सभी मापदंडों के लिए मात्रात्मक स्कोरिंग प्रणाली प्रदान करते हैं. क्योंकि ए एल एस माउस मॉडल का गहराई से विश्लेषण में एक आम तौर पर रीढ़ की हड्डी के एक immunohistochemical परीक्षा के की आवश्यकता है, हम करते हैं लागू करने के विस्तार में अपनी तैयारी का प्रदर्शनrsal laminectomy विधि. अनुकरणीय ऊतकीय निष्कर्ष प्रदर्शन कर रहे हैं. ए एल एस के माउस मॉडल पर अध्ययन में दर्शाया परीक्षा तरीकों की व्यापक आवेदन के शोधकर्ता मज़बूती से भविष्य चिकित्सकीय विकल्प है जो बाद में मानव नैदानिक परीक्षण के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं परीक्षण करने के लिए सक्षम हो जाएगा.
Protocol
पशु जैक्सन प्रयोगशाला (002,726) एक से खरीदे गए थे. वे नैदानिक और रन बनाए हैं और मोटर समारोह (rotarod परीक्षण) और मांसपेशियों की शक्ति (तार परीक्षण लटका) के परीक्षण के अधीन है. बहुत करीब पशु प्रयोगों के समुचित संचालन के लिए स्थानीय दिशा निर्देशों के अनुसार इन सभी परीक्षणों और बाद में जानवरों की हत्या करने में रीढ़ की हड्डी तैयार किया गया है.
1. नैदानिक कुल
इसके अलावा शरीर के वजन चूहों के लिए मूल्यांकन से मोटर घाटा निम्नलिखित 4 बिंदु स्कोरिंग 2 प्रणाली के साथ संकेत के लिए जांच कर रहे हैं:
4 अंक: सामान्य (मोटर शिथिलता के कोई संकेत नहीं)
3 अंक: पिछले अंग झटके स्पष्ट कर रहे हैं जब पूंछ से निलंबित
2 अंक: चाल असामान्यताएं मौजूद हैं
1 बिंदु: कम से कम एक पिछले अंग खींच
0 अंक: सममितपक्षाघात, ही सही अक्षमता या अधिकतम शरीर के वजन के 20% का नुकसान, इस मामले में पशुओं को तुरंत और euthanized हैं प्रयोग समाप्त
2. मोटर फंक्शन टेस्ट और मांसपेशियों की शक्ति
तार फांसी
इस परीक्षण के लिए पेशी शक्ति 3, 4 का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सभी जानवरों rotarod परीक्षण के बाद कम से कम एक या दो दिन के इस परीक्षण प्रदर्शन करते हैं. प्रत्येक माउस 0.8 सेमी के अंतराल के साथ एक कस्टम तार ढक्कन पर रखा गया है और सावधानी से उल्टा हो गया, एक भूसे के ऊपर 60 सेमी नीचे कवर. लगातार तीन बार के लिए कम से कम 180 एस के प्रशिक्षण के बाद गिर विलंबता मापा जाता है. प्रत्येक माउस को तीन उल्टे ढक्कन पर 180 का एक अधिकतम है और सबसे लंबी अवधि दर्ज की गई है के लिए पकड़ का प्रयास करने के लिए दिया जाता है.
Rotarod टेस्ट
3, 4 सीखने मोटर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक अच्छे प्रदर्शन के के ज्ञानेन्द्रिय समन्वय की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता है. मशीन एक शांत और गैर परेशान करने के लिए परीक्षण पशु distractive उत्तेजनाओं से बचने के वातावरण में रखा जाना चाहिए. यह एक कंप्यूटर नियंत्रित मोटर चालित घूर्णन और पांच चूहों के लिए धुरी पाँच गलियों के होते हैं. चूहों की Falls के स्वचालित रूप से दबाव से नीचे में एक प्लास्टिक प्लेट पर पता चला रहे हैं. 15 आरपीएम समय के लिए जो एक जानवर घूर्णन छड़ी पर रह सकते हैं की एक निरंतर गति में तीन कम से कम 180 की लगातार समय के लिए प्रशिक्षण के बाद मापा जाता है. प्रत्येक जानवर गिरने के बिना दर्ज की गई है तीन परीक्षणों और लंबे समय तक विलंबता आए. 180 के समय कट ऑफ समय के रूप में चुना है क्योंकि मोटर समन्वय में काफी अंतर के बहुमत इस समय सीमा में पता चला रहे हैं.
3. स्पाइनल कॉर्ड तैयार
- पशु सीओ 2 उच्छवाल द्वारा स्थानीय दिशा - निर्देशों के अनुसार मारे गए हैं और तुरंत एक 4% paraformaldehyde के समाधान के द्वारा पीछा किया पीबीएस समाधान के साथ transcardially perfused.
- बलिदान माउस की रीढ़ की हड्डी तैयार करने के लिए आदेश में, पशु एक ऑपरेशन टेबल पर रखा गया है और चार अंग पक्ष पर तय कर रहे हैं आदेश में करने के लिए माउस के पीछे की ओर का पर्दाफाश.
- एक 70% इथेनॉल समाधान के साथ एक छोटी धोने विच्छेदन की साइट साफ है और बाल कोट दुबला बना देती है.
- तो त्वचा मंझला लाइन में एक तेज स्केलपेल के साथ छिन्न है. आदेश में काटने त्वचा दोनों पक्षों के लिए बढ़ाया है की सुविधा के लिए. अगर पैर की मांसपेशियों को तैयार किया जाएगा, उनकी त्वचा भी हो गया है छिन्न करने के लिए.
- त्वचा चीरा के बाद पूरा हो गया है, यह अलग चिमटी की एक जोड़ी के लिए शरीर की अंतर्निहित सतही प्रावरणी का पर्दाफाश के साथ खींच लिया है.
- गर्दन और डब का बंधन की मांसलता को हटाया जाना है और क्षमताओं हैंrefully तैयार है. गहरा और घाव रीढ़ की हड्डी को काटकर अलग कर देना नहीं सावधान रहो. कंधे की मांसपेशियों को भी क्रम में बेहतर स्पाइनल कॉलम का पर्दाफाश हटाया जा सकता है.
- तो paravertebral मांसपेशियों को पूरे स्पाइनल कॉलम से हटा रहे हैं.
- आदेश में खोलने के लिए रीढ़ की हड्डी स्तंभ कई laminectomies के करने के लिए प्रदर्शन किया जाना है. एक ऊपरी कपाल हिस्से से संयुक्त शीर्षधर - पश्चकपाल के साइट पर शुरू कर देना चाहिए.
- यह आसान है ऊपरी दो अंगों के निर्धारण को हटाने और गर्दन overstretch के लिए बेहतर करने के लिए पहली कशेरुकाओं के laminectomy प्रदर्शन करने में सक्षम हो. इन उजागर ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को छू के बिना दूर खींच रहे हैं.
- अधिक कशेरुकाओं पहली बार हैं angled कैंची के साथ दोनों पक्षों में कशेरुका के मेहराब transecting और फिर पृष्ठीय प्रक्रियाओं पर खींच कर हटा रहे हैं. कशेरुकाओं की शेष पार्श्व भागों के लिए रीढ़ की हड्डी के बाद पूरी तरह हटाने की सुविधा के लिए हटा दिया जाना चाहिए.
- काठ का spina के एक संरचनात्मक मील का पत्थरएल की हड्डी में सूजन भी है कि ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में मौजूद है.
- पूरे रीढ़ की हड्डी की laminectomy समाप्त होने पर, सुनिश्चित करें कि आप भी सभी उदर जड़ों आड़ा काट और meninges की ड्यूरा मेटर से रीढ़ की हड्डी जारी कर सकते हैं.
- तब गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी cranially काटा जाता है और आप रीढ़ की हड्डी को हटाने के लिए शुरू.
- अंत में रीढ़ की हड्डी भी बाहर का पुच्छ equina में कट जाता है पूरी तरह से जारी हो.
- अंत में, रीढ़ की हड्डी postfixating (जैसे 4% paraformaldehyde) समाधान रात भर में रखा गया है और आगे से संसाधित किया जा सकता है. हम आम तौर पर रीढ़ की हड्डी cryosection यह immunohistological विश्लेषण के लिए तैयार है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
रीढ़ की हड्डी की तैयारी की तकनीक इस वीडियो लेख के ध्यान केंद्रित का प्रतिनिधित्व करता है. यह प्रोटोकॉल बाद में ऊतक के लिए और अंततः spina के immunohistological विश्लेषण के लिए एक आवश्यक शर्त है.मैं कॉर्ड वर्गों. एक अंतिम परिणाम का एक उदाहरण के रूप में, wildtype का माउस काठ का रीढ़ की हड्डी (wt) के पूर्वकाल सींग क्षेत्र की और एक वतन G93A transgene (टीजी) एक immunohistochemical workup माउस के प्रदर्शन है. मोटर न्यूरॉन्स एक प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी चैट और एक माध्यमिक एंटीबॉडी Cy3 के साथ बाद में फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ पहचाना जा सकता है. इसके अलावा, परमाणु DAPI (4,6 - diamidino-2-phenylindole) के साथ काउंटर दाग प्रदर्शन किया गया है (चित्रा 1).
चित्रा 1 प्रतिदीप्त विरोधी चैट (लाल) एंटीबॉडी और DAPI माउस काठ का रीढ़ की हड्डी में एक wildtype (wt) पूर्वकाल सींग (बाईं ओर) में और (नीला) द्वारा सेलुलर काउंटर दाग नाभिक के साथ motoneurons की immunodetection visualizing के photomicrographs. वतन G93A ट्रांसजेनिक (टीजी) (सही पर) 130 दिन की उम्र में माउस. पैमाने पर पट्टी: 40 माइक्रोन.
की immunohistochemical विश्लेषण के रूप मेंकृपया मूल प्रकाशन जो इन ट्रांसजेनिक चूहों में लक्षण वर्णन किया गया है और अधिक हाल ही में लोगों को जो आगे संदर्भ 1, 5, 6 के लिए चिकित्सकीय दृष्टिकोण का अध्ययन परामर्श वतन G93A चूहों इस लेख के प्राथमिक गुंजाइश नहीं है. यदि उपचारात्मक प्रभाव स्पष्ट रूप से परिभाषित immunohistological स्तर पर भेदभाव किया जाएगा मात्रात्मक मूल्यांकन एल्गोरिदम एक stereological सॉफ्टवेयर (7 उदाहरण के लिए देखें) द्वारा लागू किया जा समर्थित होना चाहिए.
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Discussion
SOD1 (G93A) आनुवंशिक माउस मॉडल प्रगतिशील motoneuron मानव amyotrophic पार्श्व काठिन्य 8 के लिए बराबर के झड़ने की बीमारी के पाठ्यक्रम का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान जानवर मॉडल है. अलग उपचार मानदंड की एक किस्म इस मॉडल में मूल्यांकन किया गया है और बाद में मानव नैदानिक अध्ययन 8-10 में परीक्षण के लिए एक आधार का प्रतिनिधित्व करते हैं. आदेश में इन चूहों में एक प्रयोगात्मक उपचार के अध्ययन में महत्वपूर्ण मतभेद का पता लगाने में सक्षम हो, यह प्रख्यात महत्व की है कम से कम 24 कूड़े से मिलान लिंग संतुलित ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों में शामिल हैं और एक डबल अंधा 8 डिजाइन का पालन करें. मानव नैदानिक अध्ययन करने के लिए तुलनीय है, तो एक एकल वर्दी endpoint कसौटी का चुना जाना चाहिए. यहाँ, सबसे अधिक इस्तेमाल किया एक ही सही अपने पक्ष पर रखा जा रहा है जानवर की असमर्थता के बाद 30 सेकंड में है. यदि इस कसौटी पशु का बलिदान तक पहुँच जाता है और अपने जीवन समय के अस्तित्व के समय के रूप में दर्ज है.
TreatmeNT के अध्ययन एक presymptomatic नैदानिक राज्य में शुरू किया जा सकता है (जीवन के दिन (राजभाषा विभाग) जैसे 50 या भी 30 डीओएल पर) जब पशुओं मोटर रोग के कोई संकेत अभी तक प्रदर्शन नहीं करते हैं और हमारे नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली में 4 अंकों के साथ रन बनाए जा जाएगा . एक और संभावना एक रोगसूचक उपचार दृष्टिकोण है जो जब पहली बार नैदानिक लक्षण प्रकट होता है और पिछले अंग झटके स्पष्ट कर रहे हैं जब जानवर पूंछ से निलंबित कर दिया है शुरू कर देना चाहिए होते हैं. इस रोग की शुरुआत के रूप में परिभाषित किया गया है और इस प्रारंभिक रोग चरण नैदानिक 3 अंक के साथ वर्गीकृत है. मोटर समारोह की और मांसपेशियों की शक्ति के परीक्षण में महत्वपूर्ण impairments के ज्यादातर केवल दो से चार सप्ताह के बाद होते हैं. औसत पर के रूप में पशुओं 80 डीओएल के आसपास पहली नैदानिक रोग की अवस्था तक पहुँचते हैं, कुछ शोधकर्ताओं ने एक सरलीकृत दृष्टिकोण में इस समय बिंदु पर अपने सभी जानवरों के लिए रोगसूचक उपचार शुरू करते हैं. दोनों स्थितियों में यह रोग प्रगति की निगरानी करने के लिए अनिवार्य है. यह presymp के लिए इलाज दीक्षा के समय पर शुरू किया जाना चाहिएtomatically symptomatically इलाज पशुओं के लिए जानवरों (50 राजभाषा विभाग या 30 राजभाषा विभाग, क्रमशः) या 70 राजभाषा विभाग में इलाज किया. रोग प्रगति की निगरानी शरीर के वजन, नैदानिक तंत्रिका स्कोरिंग और मोटर समारोह का परीक्षण और मांसपेशियों की शक्ति का एक दो बार साप्ताहिक दृढ़ संकल्प भी शामिल है. अगर पशुओं नैदानिक स्कोर 1 (कम से कम एक पिछले अंग खींच) तक पहुँचने हम करने के लिए शरीर के वजन और नैदानिक निगरानी के दैनिक दृढ़ संकल्प प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं क्रम में ही सही है या 20 की हानि करने के लिए नैदानिक स्कोर 0 बिंदु (सममित पक्षाघात, असमर्थता याद नहीं अधिकतम शरीर के वजन का%) जब जानवरों के लिए तुरंत और euthanized किया जा प्रयोग समाप्त होता है. यह सिफारिश की है कि पहली बार परीक्षक एक अनुभवी पशु शोधकर्ता, जो भी प्रगति की सूक्ष्म नैदानिक लक्षणों का पता लगाने में मदद करता है के द्वारा निर्देशित है. नैदानिक Weydt एट अल 2 के बाद 4 बिंदु स्कोरिंग प्रणाली अच्छी तरह से इस क्षेत्र में स्थापित है और एक विश्वसनीय प्रणाली का उपयोग मापदंड है जो स्पष्ट रूप से भेदभाव किया जा सकता है. एकनैदानिक लक्षणों की अधिक सूक्ष्म भेदभाव कम स्पष्ट है और अत्यधिक परीक्षक निर्भर होगा.
आदेश में व्यवहार घाटे का पता लगाने के लिए परीक्षण मानदंड की एक किस्म उपलब्ध है. ज्यादातर लेखकों rotarod परीक्षण है कि पशु एक rotating 4 सिलेंडर, 11 पर चलने की क्षमता का मूल्यांकन एहसान. SOD1 G93A माउस मॉडल में व्यवहार परीक्षण के महत्व का मूल्यांकन अध्ययन में rotarod परीक्षण wildtype और ट्रांसजेनिक चूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर के रूप में उम्र के 16 सप्ताह से 11 पर जल्दी पता लगाने में बहुत संवेदनशील हो साबित. संभव संशोधनों को एक स्थिर गति से या एक त्वरित गति रन पर चल रहा है. किसी भी मामले में, पशुओं के लिए पहली वैध परीक्षण से पहले प्रशिक्षित किया जा सकता है क्योंकि कुछ दूसरों की तुलना में अधिक प्रशिक्षण की जरूरत के लिए मोटर समन्वय का एक बुनियादी स्तर को प्राप्त कर सकते है. इस कार्य को एक सीमा अलग से प्रेरित पशुओं द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. यह, हालांकि, कम से कम वें के दोहराया परीक्षण के द्वारा मुआवजा किया जा सकता हैपरीक्षा प्रति दिन ree बार. एक और मोटर व्यवहार परीक्षण है जो जल्दी मोटर घाटे का पता लगाने में बहुत संवेदनशील है पदचिह्न 11 विश्लेषण है. हालांकि, यह काफी श्रमसाध्य है क्योंकि जानवरों के लिए कर अपने पैरों रंग के एक जलाशय में डूबा हुआ है के बाद एक गैंगवे चलाने के लिए प्रेरित किया जाना है. पदचिह्न की गुणवत्ता काफी हद तक अलग अलग और एक सॉफ्टवेयर सहायता प्राप्त विश्लेषण मुश्किल है. इसलिए, हम मोटर समन्वय का मूल्यांकन करने के लिए rotarod परीक्षण पसंद करते हैं.
फांसी तार परीक्षण अंगों की मांसपेशियों की शक्ति का मूल्यांकन. यह एक बल्कि कच्चे तेल परीक्षण है कि सबसे अच्छा 4 रोग की दीक्षा के बाद एक कुछ हफ्तों जल्दी मांसपेशियों घाटे का पता लगाता है. हालांकि, यह बहुत आसान है के लिए प्रदर्शन और संपूर्ण परीक्षण उपकरण आसानी से निर्माण किया जा सकता है. मांसपेशियों की शक्ति के लिए एक अधिक विस्तृत परीक्षण एक बल 12 transducer का उपयोग है. यहाँ, माउस या तो उसके पिछले या उसके सामने के साथ एक एक बल transducer से जुड़ा बार हड़पने के लिए संकेत किया जाता हैपंजे. अन्य कार्यात्मक परीक्षण है कि विचार किया जाना है चल पहिया दूरी की माप या भी खुले क्षेत्र 3 गतिविधि का मूल्यांकन, 13 शामिल हैं. हालांकि, हमारे अनुभव में rotarod और फांसी तार परीक्षण के संयोजन के लिए सबसे संवेदनशील है, आसानी से साध्य और SOD1 G93A चूहों के मूल्यांकन के लिए समय कुशल साबित हुई. कुल मिलाकर, पशुओं में एक preclinical अध्ययन बहुत ध्यान से बनाया जाना चाहिए और मानव नैदानिक परीक्षणों के बुनियादी सिद्धांतों का पालन के रूप में पत्नी (दिशा निर्देशों में वर्णित करना चाहिए www.consort statement.org ) 14. तभी तो, preclinical अनुसंधान के लिए जानवरों के इस्तेमाल और उचित किया जा सकता है परिणाम अंततः एक मानव नैदानिक आवेदन में सफल अनुवाद करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
इन नैदानिक और व्यवहार निष्कर्ष हमेशा रीढ़ की हड्डी moto सहित के neuromuscular इकाई की विकृति का विश्लेषण करने के लिए सहसंबद्ध किया जाना चाहिएन्यूरॉन, अक्षतंतु, और neuromuscular जंक्शन 14. यहाँ, CNS से रीढ़ की हड्डी की हड्डी विकृति का एक उच्च गुणवत्ता विश्लेषण अस्तित्व या रोग प्रगति में प्रभाव की व्याख्या के लिए एक शर्त है. क्योंकि पूरी तरह से ऊतक निर्धारण महत्वपूर्ण है, 4% paraformaldehyde पीबीएस के समाधान युक्त के साथ पशुओं का छिड़काव मानकीकृत अच्छी तरह से होना चाहिए. आदेश में ध्यान से रीढ़ की हड्डी को दूर करने के लिए सक्षम होने के लिए एक निश्चित आपरेशन खुर्दबीन के साथ एक विच्छेदन तालिका के साथ स्थापित किया जाना चाहिए और ठीक शल्य चिकित्सा उपकरणों के लिए उपलब्ध होना चाहिए (नीचे शल्य चिकित्सा उपकरणों की सूची देखें). पूरे रीढ़ की हड्डी के बाद हटा दिया गया है, यह उचित सेक्शनिंग तकनीक (जैसे vibratome या cryotome) संसाधित किया जा सकता है और अंततः immunohistological विश्लेषण करने के लिए अधीन किया जा सकता है. यहाँ बुनियादी मूल्यांकन मानकों रीढ़ की हड्डी motoneurons और सक्रिय या घुसपैठ glial कोशिकाओं 10, 15 की संख्या रहे हैं. मूल अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है, अतिरिक्त immunohistochemical हूँवतन समुच्चय या सीएनएस अन्तःचूचुक अखंडता की तरह arkers मूल्यांकन किया जा सकता है. इसके अलावा, परिधीय तंत्रिका तंत्र रोग विकृति परिधीय तंत्रिका axons की और neuromuscular जंक्शनों की परीक्षा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. केवल सीएनएस और पीएन के दोनों नैदानिक और immunohistochemical विश्लेषण के संयोजन समग्र ए एल एस विकृति का एक पूरी तरह से मानना है कि नैदानिक निष्कर्षों के साथ सहसंबद्ध किया जा प्रदान करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
LT गौटिंगेन विश्वविद्यालय के चिकित्सा की Forschungsförderungsprogramm से अनुदान का समर्थन प्राप्त हुआ है. पी एल और एमबी (CMPB) मस्तिष्क, गौटिंगेन की आण्विक फिजियोलॉजी के लिए DFG अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित थे. लेखक वीडियोग्राफी और Birgit Liebau के साथ ऑडियो और वीडियो संपादन के साथ मदद के लिए सहायता के लिए डॉ. लार्स Tatenhorst धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
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