Summary
Un modello murino per la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una valutazione clinica e comportamentale. Come prerequisito per un'analisi accompagnamento immunoistologico la preparazione del midollo spinale è raffigurato in dettaglio.
Abstract
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa letale con conseguente progressiva degenerazione dei motoneuroni. Il picco di insorgenza è di circa 60 anni per la malattia sporadica e circa 50 anni per la malattia familiare. Grazie al suo andamento progressivo, il 50% dei pazienti muore entro 30 mesi dall'inizio dei sintomi. Per valutare nuove opzioni di trattamento per questa malattia, modelli murini di SLA genetici sono stati generati sulla base umani mutazioni nel gene familiari SOD, come la (G93A) mutazione SOD1. Aspetti più importanti che devono essere valutati nel modello sono la sopravvivenza globale, decorso clinico e la funzione motoria. Qui, dimostriamo la valutazione clinica, mostrano la conduzione di due test del motore comportamentali e fornire sistemi di punteggio per tutti i parametri quantitativi. Poiché un'analisi approfondita del modello murino ALS di solito richiede un esame immunoistochimica del midollo spinale, abbiamo dimostrato la sua preparazione in dettaglio l'applicazione del farelaminectomia metodo rsal. Esemplari risultati istologici sono dimostrati. La completa applicazione dei metodi di esame descritti negli studi sul modello murino di SLA consentirà al ricercatore di verificare in modo affidabile per future opzioni terapeutiche che possono fornire una base per le sperimentazioni cliniche umane successive.
Protocol
Gli animali sono stati acquistati da Jackson Laboratory (# 002.726) 1. Essi sono clinicamente segnato e sottoposto ad un test di funzionamento del motore (rotarod test) e della forza muscolare (appesa prova del filo). Tutti questi test e il successivo abbattimento degli animali al fine di preparare il midollo spinale sono stati eseguiti in accordo molto vicino alle linee guida locali per corretto svolgimento degli esperimenti sugli animali.
1. Punteggio clinico
Oltre alla verifica del peso corporeo per i topi vengono esaminati i segni di deficit motorio con il seguente sistema di quattro punti di punteggio 2:
4 punti: normale (nessun segno di disfunzione motoria)
3 punti: tremori agli arti posteriori sono evidenti quando sospesa per la coda
2 punti: sono presenti anomalie dell'andatura
1 punto: trascinamento di almeno un arto posteriore
0 punti: simmetricaparalisi, incapacità di destra stessa o perdita del 20% del peso corporeo massimo, in questo caso gli animali vengono sacrificati ed immediatamente l'esperimento viene interrotto
2. Test della funzione motoria e della forza muscolare
Appeso filo
Questo test viene utilizzato per valutare la forza muscolare 3, 4. Tutti gli animali eseguire questo test almeno uno o due giorni dopo la prova rotarod. Ogni mouse è posizionato su una misura coperchio filo con intervalli di 0,8 cm e con cautela capovolto, 60 cm al di sopra un filo di paglia coperto fondo. Dopo l'allenamento per tre volte consecutive di almeno 180 s la latenza a cadere è misurata. Ogni mouse è dato fino a tre tentativi di trattenere il coperchio capovolto per un massimo di 180 s e il più lungo periodo è registrata.
Rotarod test
3, 4. Una buona prestazione richiede un alto grado di coordinazione sensomotoria. La macchina deve essere collocato in un ambiente tranquillo e non disturba al fine di evitare stimoli di distrazione per la testati su animali. È costituita da un computer controllato motorizzata di rotazione del mandrino e cinque corsie per cinque topi. Cadute dei topi vengono rilevati automaticamente dalla pressione su una piastra di plastica sul fondo. Dopo l'addestramento per tre volte consecutive di almeno 180 s ad una velocità costante di 15 rpm del tempo per il quale un animale può rimanere sulla canna rotante viene misurata. Ogni animale sottoposto a tre prove e la più lunga latenza senza cadere viene registrato. Il tempo di 180 s è scelto come cut-off time perché la maggior parte delle differenze significative nella coordinazione motoria vengono rilevati in questo lasso di tempo.
3. Preparazione Spinal Cord
- Gli animali vengono uccisi da CO 2 insufflazione in conformità con le linee guida locali e sono immediatamente perfusi transcardiaca con soluzione PBS seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4%.
- Per preparare il midollo spinale del mouse sacrificato, l'animale viene posto su un tavolo operatorio e le quattro arti sono fissati sul lato in modo da esporre il lato posteriore del mouse.
- A breve lavaggio con una soluzione di etanolo al 70% pulisce il sito della dissezione e appiattisce il mantello.
- Poi della cute con un bisturi affilato nella linea mediana. Al fine di facilitare il taglio della pelle viene tesa su entrambi i lati. Se i muscoli delle gambe deve essere pronto, la loro pelle deve inoltre essere inciso.
- Dopo l'incisione cutanea è completata, viene tirato da parte con una pinzetta per esporre la fascia sottostante superficiale del corpo.
- La muscolatura del collo e il legamento nucale devono essere rimossi e sono carefully preparato. Fare attenzione a non incidere profondamente e di lesione del midollo spinale. I muscoli delle spalle possono anche essere rimosse per esporre meglio la colonna vertebrale.
- Poi i muscoli paravertebrali vengono rimossi dalla intera colonna vertebrale.
- Per aprire i laminectomie colonna vertebrale diversi devono essere eseguiti. Si dovrebbe iniziare dalla parte superiore craniale nel sito del atlanto-occipitale.
- E 'più facile togliere la fissazione dei due arti superiori e tirare troppo il collo per essere meglio in grado di eseguire la laminectomia delle vertebre prima. Questi sono tirato via senza toccare il esposta midollo spinale cervicale.
- Più vertebre vengono rimossi prima sezionare i archi vertebrali su entrambi i lati con forbici angolate e quindi tirando i processi dorsali. Rimanenti parti laterali delle vertebre dovrebbe essere rimosso per facilitare la successiva rimozione completa del midollo spinale.
- Un punto di riferimento anatomico della spina lombarel è il cavo di intumescenza che è presente anche nel midollo spinale cervicale.
- Dopo aver finito la laminectomia del midollo spinale intera, fare in modo che anche voi transetto tutte le radici ventrali e rilasciare il midollo spinale dalla dura madre delle meningi.
- Poi il midollo spinale cervicale è tagliato cranialmente e si inizia a rimuovere il midollo spinale.
- Infine, il midollo spinale è anche tagliato alla distale cauda equina, per essere completamente rilasciato.
- In definitiva, il midollo spinale viene posto in una soluzione postfixating (ad esempio paraformaldeide 4%) per una notte e può essere ulteriormente lavorato. Di solito cryosection il midollo spinale per prepararlo per l'analisi immunoistologico.
4. Risultati rappresentativi
La tecnica di preparazione del midollo spinale rappresenta il focus di questo articolo video. Si tratta di un prerequisito essenziale per il sezionamento dei tessuti in seguito e, infine, per l'analisi immunoistologico di spinal cavo sezioni. Come esempio di un risultato finale, uno workup immunoistochimica della regione corno anteriore del midollo spinale lombare topo di tipo selvatico (wt) e di un transgene SOD G93A (tg) topo è dimostrata. Neuroni motore può essere identificato con un primario anticorpo anti-ChAT e successiva marcatura fluorescente con un anticorpo secondario Cy3. Inoltre, una contro-colorazione nucleare con DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindolo) è stato eseguito (Figura 1).
Figura 1. Microfotografie fluorescenti visualizzando il immunorivelazione dei motoneuroni con anticorpi anti-ChAT (rosso) e nuclei cellulari anti-macchia DAPI (blu) a livello lombare corno midollo spinale anteriore del mouse di un tipo selvatico (WT) (a sinistra) e di uno SOD G93A transgenico (tg) (a destra) del mouse all'età di 130 giorni. Scale bar: 40 micron.
Poiché l'analisi immunoistochimica dii topi SOD G93A non è lo scopo primario di questo articolo si prega di consultare la pubblicazione originale in cui questi topi transgenici sono stati caratterizzati e quelli più recenti che studiano approcci terapeutici per la consultazione 1, 5, 6. Se gli effetti terapeutici è modulata al livello immunoistologico chiaramente definito algoritmi di valutazione quantitativa deve essere applicato supportato da un software stereological (si veda per esempio 7).
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Discussion
Il (G93A) modello murino SOD1 genetico è un modello animale valido per studiare il corso della malattia del motoneurone perdita progressiva paragonabile umana sclerosi amiotrofica laterale 8. Una varietà di paradigmi di trattamenti diversi sono stati valutati in questo modello e rappresentano una base per la successiva prova in studi clinici umani 8-10. Per poter rilevare differenze significative in uno studio sperimentale di trattamento in questi topi, è di importanza eminente includere almeno 24 lettiera accoppiate genere equilibrate topi dello stesso sfondo genetico e seguono un doppio-cieco design 8. Paragonabile a studi clinici sull'uomo, un unico criterio endpoint uniforme dovrebbe essere scelto. Qui, il più comunemente usato è l'incapacità dell'animale a destra stessa in 30 secondi dopo essere state poste su un lato. Se questo criterio è raggiunto l'animale viene sacrificato e la sua durata viene registrato come il tempo di sopravvivenza.
CureGli studi nt può essere avviato in uno stato presintomatico clinico (ad esempio al giorno di vita (DOL) 50 o anche su DOL 30) quando gli animali non mostrano ancora alcun segno di disfunzione motoria e sarebbe segnato con 4 punti nel nostro sistema di valutazione clinica . Un'altra possibilità consiste in un approccio terapeutico sintomatico che deve iniziare quando il primo sintomo clinico appare e tremori degli arti posteriori sono evidenti quando l'animale è sospeso per la coda. Questo è definito come l'insorgenza della malattia e questo stadio della malattia iniziale viene classificato con il punteggio clinico 3. Danni significativi nei test della funzione motoria e della forza muscolare per lo più si verificano solo più di due o quattro settimane dopo. Come in media gli animali raggiunge il primo stadio clinico della malattia intorno DOL 80, alcuni ricercatori iniziare il trattamento sintomatico per tutti gli animali a questo punto volta in un approccio semplificato. In entrambe le impostazioni è obbligatorio per monitorare la progressione della malattia. Questo dovrebbe essere avviato al momento dall'inizio del trattamento per presymptomaticamente animali trattati (DOL DOL 50 o 30, rispettivamente) o presso DOL 70 per gli animali trattati sintomaticamente. Monitoraggio della progressione della malattia comprende una determinazione bisettimanale di peso corporeo, clinica neurologica e scoring prove di funzionalità del motore e della forza muscolare. Se gli animali raggiungono uno score clinico (trascinamento di almeno un arto posteriore) si consiglia di effettuare la determinazione giornaliera del peso corporeo e monitoraggio clinico per non perdere il punteggio clinico punto 0 (paralisi simmetrica, l'incapacità di destra stessa o perdita del 20 % del peso corporeo massimo) quando gli animali devono essere immediatamente eutanasia e l'esperimento viene interrotto. Si raccomanda che la prima volta esaminatore è guidato da un ricercatore esperto animale che aiuta a rilevare anche sottili segni clinici di progressione. La clinica a 4 punti il punteggio del sistema dopo Weydt et al 2 è ben consolidata nel campo ed è un sistema affidabile in base a criteri che possono essere chiaramente differenziati. Adifferenziazione più sottile dei sintomi clinici sarebbe meno chiaro e altamente esaminatore dipendente.
Per rilevare deficit comportamentali una varietà di paradigmi di test è disponibile. La maggior parte degli autori favorire il test rotarod che valuta la capacità dell'animale da eseguire su un cilindro rotante 4, 11. In uno studio che ha valutato il significato di test comportamentali nel modello di topo G93A SOD1 il test rotarod dimostrato di essere molto sensibile nel rilevare differenze significative tra tipo selvatico e topi transgenici già dalla settimana 16 di età al 11. Eventuali modifiche comprendono funzionando ad una velocità costante o una corsa di velocità accelerata. In ogni caso, gli animali devono essere formati prima del primo test valido, perché alcuni possono bisogno di più formazione di altri per ottenere un livello base di coordinazione motoria. Una limitazione è rappresentata dagli animali in modo diverso motivati per eseguire questa operazione. Questo, tuttavia, può essere compensato da prove ripetute di almeno thRee volte al giorno dell'esame. Un altro test comportamentale del motore che è molto sensibile nel rilevare i deficit motori primi è l'analisi footprint 11. Tuttavia, è abbastanza laboriosa in quanto gli animali devono essere motivati a eseguito su una passerella dopo che i piedi immerso in un serbatoio di vernice. La qualità della impronta può variare in larga misura e un software di analisi-aided è difficile. Pertanto, si preferisce il test rotarod per la valutazione della coordinazione motoria.
Il test del filo appeso valutata la forza muscolare degli arti. Si tratta di un test piuttosto grezzo che meglio si rileva deficit muscolari presto un paio di settimane dopo l'inizio della malattia 4. Tuttavia, è molto facile da eseguire e l'intero apparato di test può essere facilmente costruito. Un test più elaborata per la forza muscolare è l'utilizzo di un trasduttore di forza 12. Qui, il mouse viene richiesto di prendere un bar collegato ad un trasduttore di forza sia con il suo posteriore o la sua anteriorezampe. Altri test funzionali che devono essere considerati comprendono la misurazione della distanza ruota portante o anche la valutazione di campo aperto attività 3, 13. Tuttavia, nella nostra esperienza la combinazione del rotarod e la prova del filo appeso dimostrato di essere più sensibile, facilmente praticabile e tempo efficace per la valutazione dei topi SOD1 G93A. Nel complesso, uno studio preclinico negli animali dovrebbero essere progettate con molta attenzione e deve seguire i principi fondamentali di una sperimentazione clinica, come descritto nelle linee guida CONSORT ( www.consort-statement.org ) 14. Solo allora, l'uso di animali per la ricerca preclinica può essere giustificata ed i risultati possono portare ad una traduzione di successo in una applicazione clinica nell'uomo.
Questi risultati clinici e comportamentali deve essere sempre correlato ad un analisi della patologia neuromuscolare del gruppo tra cui midollo spinale motoneurone, assone e neuromuscolari svincolo 14. Qui, di alta qualità l'analisi del midollo spinale, patologia del SNC è un prerequisito per l'interpretazione degli effetti in termini di sopravvivenza o la progressione della malattia. Poiché il fissaggio del tessuto approfondita è critica, la perfusione degli animali con paraformaldeide al 4% contenente PBS-soluzione deve essere ben standardizzata. Per poter rimuovere accuratamente il midollo spinale una tabella dissezione deve essere installato con un microscopio funzionamento fisso e sottili strumenti chirurgici devono essere disponibili (vedere elenco degli strumenti chirurgici sotto). Dopo il midollo spinale intero è stato rimosso, può essere lavorato alla tecnica sezionamento appropriato (ad esempio vibratomo o cryotome) e può infine essere sottoposto ad analisi immunoistologico. Qui, i parametri di valutazione di base sono i numeri dei motoneuroni del midollo spinale e attivano o infiltrante cellule gliali 10, 15. A seconda della domanda di ricerca originale, ulteriore m immunoistochimicaarkers come aggregati SOD o CNS integrità endotelio può essere valutato. Inoltre, malattia del sistema nervoso periferico patologia può essere valutata mediante degli assoni del nervo periferico e di giunzioni neuromuscolari. Solo la combinazione di analisi sia clinici ed immunoistochimici del SNC e SNP fornire una visione approfondita della patologia SLA complessiva che deve essere correlato con i risultati clinici.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
LT ha ricevuto sovvenzioni da parte del Forschungsförderungsprogramm della Medicina dell'Università di Göttingen. PL e MB sono stati sostenuti dal Centro di Ricerca per la DFG Fisiologia molecolare del cervello (CMPB), Göttingen. Gli autori ringraziano il Dott. Lars Tatenhorst per l'assistenza e la videografia con Birgit Liebau aiuto con audio e video editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
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