Summary
루게릭병 (ALS)에 대한 마우스 모델은 임상 및 behaviorally 면밀히 검토합니다. 동반 immunohistological 분석을위한 전제 조건으로서 척수의 준비가 상세하게 그려져 있습니다.
Abstract
루게릭병 (ALS)은 motoneurons의 진보적인 퇴보로 인한 치명적인 neurodegenerative 무질서이다. 발병의 피크는 산발적 질환과 가족성 질환 50 년 주위 육십년 주변입니다. 그 진보 과정으로 인해 환자의 50 %가 증상 발병 후 30 개월 이내에 죽어. 이 질병에 대한 새로운 치료 옵션을 평가하기 위해, ALS의 유전적 마우스 모델 같은 SOD1 (G93A) 돌연변이와 같은 잔디 유전자의 돌연변이 인간 가족을 바탕으로 생성되었습니다. 모델 평가해야 할 가장 중요한 측면은 전반적인 생존, 임상 과정과 운동 기능입니다. 여기서 우리가 임상 평가를 보여주는 두 개의 행동 모터 테스트 전도가 표시되고 모든 매개 변수에 대한 양적 채점 시스템을 제공합니다. ALS 마우스 모델의 심층적인 분석은 일반적으로 척수의 immunohistochemical 시험을 필요로하기 때문에, 우리는 어떻게 적용 자세하게 그 준비를 입증rsal laminectomy 방법. 모범 histological 연구 결과는 증명하고 있습니다. ALS의 마우스 모델에 관한 연구에 묘사된 시험 방법의 포괄적인 응용 프로그램은 연구자들이 안정적으로 나중에 인간 임상 실험을위한 기초를 제공할 수있는 미래의 치료 옵션을 테스트할 수 있도록합니다.
Protocol
동물 잭슨 연구실 (# 002726) 1에서 구입했다. 그들은 임상 점수와 모터 기능 (rotarod 시험)과 근력 (선 검사를 교수형)의 테스트를 받게됩니다. 이 모든 테스트 및 동물 나중에 살해 척수를 준비하기 위하여는 동물 실험의 적절한 행위에 대해 현지 가이드와 매우 가까이에 따라서 수행되었습니다.
1. 임상 점수
이외에도 체중 마우스에 대한 평가에서는 다음 4 포인트 채점 방식 2 모터 적자의 흔적을 검사하고 있습니다 :
4 점 : 정상 (모터 기능 장애의 흔적)
3 점 : 꼬리로 정지했을 때 뒷다리 사지 떨림이 분명 있습니다
2 점 : 걸음걸이의 이상이 흐릅니다
1 포인트 : 최소 하나의 뒷다리로 드래그
0 점 : 대칭마비 자체가 오른쪽으로 무능력 또는 최대 체중의 20 %의 손실,이 경우 동물이 즉시 euthanized하고 실험이 종료된
2. 운동 기능의 테스트 및 근력
철사를 교수형에 처하는
이번 테스트는 근력 3, 4를 평가하는 데 사용됩니다. 모든 동물은 적어도 하루나 이틀 rotarod 테스트 후이 테스트를 수행합니다. 각 마우스가 0.8 cm의 간격으로 맞춤 와이어 뚜껑에 위치하고 조심스럽게 뒤집어졌다되며, 지푸라기 위에 60cm가 바닥을 커버. 적어도 180의 세 가지 연속 번 훈련하면 빠질 수있는 대기 시간이 측정됩니다. 각 마우스는 180 s의 최대 및 긴 기간이 녹화되는 동안 거꾸로 뚜껑을 보관하는 방법은 세 시도까지 주어집니다.
Rotarod 테스트
3, 4 학습을 측정하는 데 사용되었다. 좋은 성능 sensorimotor 조정의 높은 수준을 필요로합니다. 기계는 시험 동물에 대한 distractive 자극을 피하기 위해 조용하고 비 교란 환경에 배치해야합니다. 그것은 다섯 쥐를위한 컴퓨터 제어 모터 구동 회전 스핀들 다섯 골목길로 구성되어 있습니다. 생쥐의 폭포는 하단에있는 플라스틱 접시에 압력에 의해 자동으로 감지됩니다. 15 RPM 짐승이 회전 막대에 남아있을 수있는 시간을 일정한 속도로 적어도 180의 세 가지 연속 시간에 대한 교육이 측정되면. 각 동물은 전도가 기록됩니다없이 3 시련과 긴 대기 시간을 거쳐. 모터 조정에 큰 차이의 대부분이 기간에 감지되기 때문에 180 s의 시간은 컷 - 오프 시간으로 선택됩니다.
3. 척수 준비
- 동물 지방 지침에 따라 CO 2 insufflation에 의해 살해되는 즉시 4 % paraformaldehyde 용액 다음 PBS 용액으로 transcardially perfused있다.
- 희생 마우스의 척수를 준비하기 위해서는 마우스의 뒷면을 폭로하기 위해 동물들은 작업 테이블에 배치되고 사지가 측면에 고정되어 있습니다.
- 70 % 에탄올 용액과 짧은 세차는 절개의 사이트를 청소하고 헤어 코트를 flattens.
- 그러면 피부가 중간 라인에 날카로운 메스로 베인있다. 피부가 양쪽으로 뻗어있다 절단 촉진하기 위해서. 다리 근육이 준비되어야한다면, 그들의 피부도 베인되어야한다.
- 피부 절개가 완료되면, 그것은 신체의 기본 천박한 근막을 노출하기위한 족집게 한 켤레로 떨어지게된다.
- 목과 nuchal 인대의 근육은 CA를 제거해야하고 있습니다refully 준비했습니다. 깊이 및 장애 척수 절개하지 않도록주의하십시오. 어깨 근육은 또한 더 나은 척추 칼럼을 폭로하기 위해 제거할 수 있습니다.
- 그런 다음 paravertebral 근육은 전체 척추 칼럼에서 제거됩니다.
- 척추 열의 여러 laminectomies가 수행되어야 할 여는 위해서. 하나는 atlanto - 후두 관절의 사이트에서 상부 두개 부분부터 시작합니다.
- 그것은 상단이 사지의 고정을 제거하고 첫 번째 척추의 laminectomy를 수행할 수 있도록 더 목을 overstretch하는 것이 가장 쉽습니다. 이러한 노출된 자궁 경부 척수를 건드리지 않고 끌려나됩니다.
- 더 많은 척추 먼저 직각 가위로 양쪽에서 척추 아치를 끊어 버렸네 후 지느러미 프로세스에 당기에 의해 제거됩니다. 척추의 나머지 측면 부분 척수 이후 완전한 제거를 촉진하기 위하여 제거되어야한다.
- 요추 spina의 해부 랜드마크내 코드는 또한 자궁 경부 척수에 존재 부풀어 오름이다.
- 전체 척수의 laminectomy을 완료하는 것이, 당신은 또한 복부 뿌리를 가로로 쪼개다과 meninges의 경질의 mater에서 척수를 풀어 있는지 확인합니다.
- 그러면 경추 척수는 cranially 끝내 척수를 제거하기 시작합니다.
- 마지막으로 척수도 완전히 공개하기 말초 cauda equina-에서 절단한다.
- 궁극적으로, 척수는 하룻밤 만에 postfixating 솔루션 (예 : 4 % paraformaldehyde)에 위치하고 있으며 추가로 처리할 수 있습니다. 우리는 보통 immunohistological 분석을 위해 준비하는 척수를 cryosection.
4. 대표 결과
척수 준비의 기술이 비디오 기사의 초점을 나타냅니다. 그것은 나중에 조직 sectioning 및 궁극적으로 spina의 immunohistological 분석을 위해 필수적인 전제 조건이다내가 코드 섹션. 최종 결과의 예를 들어, wildtype의 마우스 요추 척수 (wt)의 앞부분은 호른 지역과 잔디 G93A transgene (TG)의 immunohistochemical 검사 결과는 마우스가 시연된다. 모터 뉴런은 기본 백신 채팅 항체와 이차 항체 Cy3와 후속 형광 라벨로 확인할 수 있습니다. 또한, DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)과 핵 반대 얼룩은 (그림 1) 수행되었습니다.
그림 1. 안티 채팅 항체 (적색)과 wildtype (wt)의 마우스 요추 척수 앞부분 호른 (왼쪽)과의 DAPI (파란색)에 의한 세포의 핵 반대 얼룩과 motoneurons의 면역을 시각화 형광등 photomicrographs 잔디 G93A 형질 전환 (TG) (오른쪽) 1백30일의 나이에 마우스. 스케일 바 : 40 μm의.
의 immunohistochemical 분석으로잔디 G93A 마우스는 본 문서의 주 범위 아닌 이러한 유전자 변형 생쥐가 특성화되어있는 원래의 게시 및 추가 참고 1, 5, 6에서 치료 접근법을 공부 더 최근의 것들을 참조하시기 바랍니다. 치료 효과는 명확하게 정의된 immunohistological 수준에 차별한다면 양적 평가 알고리즘 stereological 소프트웨어 (예를 들어 7 참조)에서 지원 적용되어야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SOD1 (G93A) 유전자 마우스 모델은 인간 루게릭병 8 비교 진보 motoneuron 손실의 질병 과정을 연구하는 귀중한 동물 모델입니다. 다른 치료 패러다임의 다양한는이 모델로 평가하고 나중에 인간 임상 연구 8-10에서 테스트하기위한 기초를 대표하고있다. 이러한 생쥐의 실험적 치료 연구에 큰 차이를 감지할 수있게하기 위해서는 최소 24 쓰레기 - 검색된 성별 균형 동일한 유전적 배경 생쥐를 포함하고 두 눈을 멀게 디자인 8을 따르도록 저명한 중요하다. 인간의 임상 연구에 비하면, 하나의 균일한 종점 기준이 선택되어야합니다. 여기에서 가장 일반적으로 사용되는 하나의 측면에 배치되고 이후에 30 초 내에 자체 오른쪽에있는 동물의 무능력이다. 이 기준에 도달하면 동물이 희생되고 있으며 수명 시간은 생존의 시간으로 기록됩니다.
TreatmeNT 연구는 presymptomatic 임상 상태에서 시작할 수 있습니다 (생명의 날 (DOL)에 예 DOL 30 일에 50도) 동물들이 아직 모터 기능 장애의 흔적을 전시하지 않으며 우리의 임상 채점 방식 4 점 득점 것입니다 . 또 다른 가능성을 가장 먼저 임상 증상이 나타나고 동물 꼬리에 의해 중단되었을 때 뒷다리 사지 떨림이 확연히 때 시작됩니다 증상 치료 접근에있다. 이것은 질병 발병으로 정의되며, 초기 질병 단계는 임상 점수가 3 등급이있다. 운동 기능과 근육 강도의 테스트에서 큰 장애는 주로 더 많은 1시 56분보다 주 후에 발생합니다. 동물 DOL 80 근처에서 처음으로 임상 질병 단계에 도달 평균적으로, 몇몇 연구자들은 단순화된 접근이 시점에서 모든 동물들에게 자신의 증상 치료를 시작합니다. 두 설정에서 이것은 질병의 진행을 모니터링하는 의무이다. 이것은 presymp에 대한 치료 개시 시에 시작되어야합니다tomatically symptomatically 치료 동물 동물 (DOL 50 또는 각각 DOL 30) 또는 DOL 70 줬어. 질병의 진행의 모니터링은 체중, 임상 neurologic 채점 및 운동 기능의 검사와 근력의 주 2 회 결정이 포함됩니다. 동물 임상 점수 1 (적어도 하나의 뒷다리로 드래그)에 도달한다면 우리는 20 일 자체가 권리 또는 손실에 임상 점수를 0 점 (대칭 마비, 무능력을 놓치고 없습니다 위해 체중 및 임상 모니터링의 일상적인 결정을 수행하는 것이 좋습니다 최대 몸무게의 %) 동물 즉시 euthanized해야하고 실험이 종료된 있습니다. 그것은 처음 검진도 진행 미묘한 임상 징후를 감지하는 데 도움이 경험있는 동물의 연구원으로 보이는 것을 권장합니다. Weydt 외 2 이후 임상 4 포인트 채점 시스템은 잘 필드에 설립하고 명확하게 구분되기 수있는 기준을 사용하여 안정적인 시스템입니다.임상 증상이 더 미묘한 차별이 덜 분명하고 높은 심사관들이 종속 것입니다.
행동 적자를 감지하기 위해서는 테스트 패러다임의 다양한 이용하실 수 있습니다. 대부분의 저자들은 회전 실린더 4 일, 11 일 실행하는 동물의 능력을 평가 rotarod 테스트를 선호. SOD1 G93A 마우스 모델에서 동작 테스트의 중요성을 평가하는 연구에서는 rotarod 테스트는 초기 시대의 주 16 일부터 같은 11 wildtype와 형질 전환 생쥐 간의 큰 차이를 감지 매우 민감한 것으로 입증되었습니다. 가능한 수정 일정한 속도 또는 가속 속도로 뛰는걸 실행이 포함됩니다. 어떠한 경우에도, 동물은 일부 모터 조정의 기본 수준을 얻기 위해 다른 사람 들보다 더 많은 훈련이 필요할 수도 있기 때문에 첫 번째 유효한 시험 전에 훈련을해야합니다. 제한 사항이 작업을 수행하기 위해 다른 동기 동물로 표현됩니다. 이것은 그러나, 적어도 일의 반복 테스트에 의해 보상받을 수 있습니다시험 하루 ree 시간. 초기 모터 적자를 감지 매우 민감 다른 모터 행동 테스트 풋프린트 분석 11. 동물들의 발이 페인트 저수지로 담근 발생 후 트랩을 통해 실행하는 동기를해야하기 때문에 그러나 그것은 매우 힘드는 것입니다. 풋프린트의 품질은 큰 정도에 따라 다를 수 있으며 소프트웨어 주었 분석은 어렵습니다. 따라서 모터 조정의 평가 rotarod 테스트를 선호합니다.
교수형 와이어 테스트는 사지의 근력을 평가했다. 그것은 최고 몇 주 질병 4 개시 후 초기 근육질의 적자를 감지 오히려 원유 시험입니다. 그러나 수행하는 것은 매우 쉬운 일이다 및 전체 테스트 장치에 쉽게 구축 할 수 있습니다. 근육의 강도에 대한보다 정교한 테스트 포스 트랜스 듀서 12 사용이다. 여기서 마우스가 뒷다리 또는 이물 중과 함께 강제 변환기에 연결된 막대를 잡고 것인지 묻는 메시지가 나타납니다발냄새. 고려되어야하는 다른 기능 테스트 실행 바퀴 거리의 측정 또는 오픈 현장 활동 3 평가, 13 등이 있습니다. 그러나 우리의 경험에 rotarod 및 매달려 와이어 테스트의 조합은 가장 민감한 쉽게 실행할 수있는 시간과 SOD1 G93A 마우스의 평가를위한 효과적인 것으로 입증되었습니다. 전반적으로, 동물의 잠복기 연구는 매우 신중하게 설계되어야하며 배우 지침 (에 설명된대로 인간 임상 실험의 기본 원칙을 따라야 www.consort-statement.org ) 14. 그런 다음에야, 잠복기 연구를위한 동물의 사용은 정당 수 있으며 결과는 궁극적으로 인간의 임상 응용 프로그램에 성공적으로 번역 발생할 수 있습니다.
이러한 임상 및 행동 연구 결과는 항상 척수 모토 포함한 신경근육학 단위의 병리 현상의 분석에 서로 관련되어야신경 세포, 축삭과 신경근육학 접합 14. 여기 CNS 척수 병리의 수준 높은 분석은 생존 또는 질병의 진행에 미치는 영향의 해석을위한 필수 조건입니다. 철저한 조직 고정이 중요하기 때문에, PBS-솔루션을 포함하고 4 % paraformaldehyde와 동물의 재관류가 잘 표준화해야합니다. 신중하게 척수를 제거할 수있게하기 위해서 해부 테이블은 고정 수술 현미경과 함께 설치 및 미세 수술 도구를 사용할 수 있어야합니다 (아래 수술 도구의 목록 참조)해야합니다. 전체 척수가 제거되고 나면, 그것은 적절한 sectioning 기법 (예 : vibratome 또는 cryotome)로 처리할 수 있습니다 마침내 immunohistological 분석를 받게됩니다. 자, 기본적인 평가 매개 변수는 척수의 motoneurons 및 활성화 또는 침투 glial 세포를 10, 15의 숫자입니다. 추가 immunohistochemical있어, 원래의 연구 질문에 따라잔디 합산 또는 CNS의 내피 무결성 같은 arkers을 평가할 수 있습니다. 또한, 말초 신경 계통 질병 병리학은 말초 신경 axons과 신경근육학 분기점의 시험으로 평가를 할 수 있습니다. CNS와 PNS의 임상 및 immunohistochemical 모두 분석만이 조합은 임상 연구 결과와 서로 관련되어야한다 전체 ALS 병리의 철저한보기를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
아주 대학교 의과 Göttingen의 Forschungsförderungsprogramm로부터 보조금 지원을 받았습니다. PL과 MB가 브레인 (CMPB), Göttingen의 분자 생리학을위한 DFG 연구 센터에 의해 지원되었다. 저자는 오디오 및 비디오 편집에 대한 도움말 videography 및 Birgit Liebau와 도움 닥터 라스 Tatenhorst 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
