Summary
En musmodell för amyotrofisk lateralskleros (ALS) undersöks kliniskt och beteendemässigt. Som en förutsättning för en medföljande immunhistologisk analys beredningen av ryggmärgen visas i detalj.
Abstract
Amyotrofisk lateral skleros (ALS) är en dödlig neurodegenerativ sjukdom resulterar i progressiv degeneration av motoneuroner. Peak of debut är cirka 60 år för sporadisk sjukdomen och cirka 50 år för familjär sjukdomen. Tack vare sin progressiva kurs 50% av patienterna dör inom 30 månader efter symtomdebut. För att utvärdera nya behandlingsalternativ för denna sjukdom har genetiska musmodeller av ALS tagits fram baserat på mänskliga familje mutationer i SOD-genen, såsom SOD1 (G93A) mutation. De viktigaste aspekter som måste utvärderas i modellen är total överlevnad, kliniskt förlopp och motorisk funktion. Här visar vi den kliniska utvärderingen visar ledning av två beteendemässiga motoriska tester och ge kvantitativa poängsystem för alla parametrar. Eftersom en fördjupad analys av ALS musmodell kräver vanligen en immunhistokemisk undersökning av ryggmärgen, visar vi beredningen i detalj tillämpa göraRsal laminektomi metod. Exempel på histologiska fynd demonstreras. Den omfattande tillämpning av de avbildade undersökningsmetoder i studier på mus modell av ALS gör det möjligt för forskare att tillförlitligt testa framtida terapeutiska alternativ som kan ge en grund för senare kliniska försök.
Protocol
Djuren köptes från Jackson Laboratory (# 002.726) 1. De är kliniskt poäng och utsätts för ett test av motorisk funktion (rotarodtestet) och muskelstyrka (hängande kabel test). Alla dessa tester och senare avlivning av djur i syfte att förbereda ryggmärgen har utförts i mycket nära enlighet med de lokala riktlinjer för korrekt genomförande av djurförsök.
1. Klinisk poäng
Förutom bedömning för möss kroppsvikt undersöks för tecken på motorn underskottet med följande 4 poängräkning system 2:
4 poäng: Normal (inga tecken på motorisk dysfunktion)
3 poäng: bakbenen skakningar är uppenbart när upphängd i svansen
2 poäng: gångrubbningar finns
1 poäng: dra av åtminstone en bakbenet
0 poäng: symmetriskförlamning, oförmåga att räta upp sig eller förlust av 20% av maximal kroppsvikt, i detta fall djuren omedelbart avlivades och experimentet avslutas
2. Tester av motorisk funktion och muskelstyrka
Upphängningstråd
Detta test används för att bedöma muskelstyrka 3, 4. Alla djur gör detta test minst en eller två dagar efter rotarodtestet. Varje mus placeras på en skräddarsydd wire lock med intervaller på 0,8 cm och försiktigt vänt upp och ner, täckt 60 cm ovanför ett sugrör botten. Efter träning för tre gånger i följd om minst 180 s latensen att falla mäts. Varje mus ges upp till tre försök att hålla den till den inverterade lock för en maximalt 180 s och den längsta perioden registrerades.
Rotarod Test
3, 4. En bra prestanda kräver en hög grad av sensorimotorisk koordination. Maskinen skall placeras i en lugn och icke-störande miljö för att undvika väsljud stimuli för den provade djuret. Den består av en datorstyrd motor driven roterande spindel och fem banor för fem möss. Falls of mössen upptäcks automatiskt av tryck på en plastplatta i botten. Efter träning för tre på varandra följande perioder av minst 180 s vid en konstant hastighet av 15 varv per minut den tid under vilken ett djur kan finnas kvar på den roterande staven mäts. Varje djur genomgår tre försök och den längsta latens utan att falla registreras. Tiden för 180 s väljs som cut-off-tid eftersom majoriteten av signifikanta skillnader i motorisk samordning upptäcks i denna tidsram.
3. Spinal Cord Preparation
- Djuren dödas av CO 2 insufflation i enlighet med lokala riktlinjer och omedelbart perfusion transkardiellt med PBS-lösning följt av en 4% paraformaldehydlösning.
- För att förbereda ryggmärgen av avlivades musen, är djuret placerades på ett operationsbord och de fyra lemmarna är fixerade på den sida, för att exponera den bakre sidan av musen.
- En kort tvätt med en 70% etanollösning rengör platsen för dissektion och plattar ut pälsen.
- Därefter huden snittas med en skarp skalpell i mittlinjen. För att underlätta skärning av huden sträcks i båda riktningarna. Om benmusklerna skall förberedas, har deras hud också snittas.
- Efter hudinsnitt är fullbordad, dras det åt sidan med en pincett för att exponera det underliggande ytliga fascia hos kroppen.
- Muskulaturen i halsen och NACK ligamentet måste avlägsnas och är carefully framställdes. Var noga med att inte incisionsfilm till djupt och skada ryggmärgen. De axlar muskler kan också tas bort för att bättre exponera ryggraden.
- Därefter de paravertebrala muskulaturen avlägsnas från hela ryggraden.
- För att öppna ryggradsdelarna flera laminektomier måste utföras. Man bör utgå från den övre kraniala delen på platsen för atlantoskandisk skallbenet.
- Det är lättast att ta bort fixeringen av de två övre extremiteterna och överanstränga nacken för att bättre kunna utföra laminektomistället första ryggkotorna. Dessa dras bort utan att röra den exponerade cervikala ryggmärgen.
- Flera kotor avlägsnas genom att först transecting de vertebrala bågarna vid båda sidorna med vinklade sax och sedan dra i de dorsala processer. Återstående laterala delarna av kotorna bör avlägsnas för att underlätta senare fullständigt avlägsnande av ryggmärgen.
- En anatomisk landmärke i ländryggen spinaL sladden är intumescens som också finns i den cervikala ryggmärgen.
- Efter att ha avslutat laminektomistället hela ryggmärgen, se till att du också transekt alla ventrala rötter och släpp ryggmärgen från dura mater av hjärnhinnorna.
- Sedan cervikala ryggmärgen skärs kranialt och du börjar ta bort ryggmärgen.
- Slutligen ryggmärgen också klippa vid den bortre cauda-equina vara helt släppt.
- Ytterst är ryggmärgen placerades i en postfixating lösning (t.ex. 4% paraformaldehyd) över natten och kan processas vidare. Vi kryosnitt brukar ryggmärgen för att förbereda den för immunhistologisk analys.
4. Representativa resultat
Tekniken att ryggmärgen förberedelser representerar fokus för denna video artikel. Det är en viktig förutsättning för senare vävnaden sektionering och ytterst för immunhistologisk analys av spinal sladd sektioner. Som ett exempel på ett slutresultat, mus en immunohistokemisk upparbetning av den främre hornet regionen av mus lumbala ryggmärgen hos en vildtyp (wt) och av en SOD-G93A transgenen (Tg), demonstreras. Motoriska nervceller kan identifieras med ett primärt anti-ChAT antikropp och efterföljande fluorescerande märkning med en sekundär Cy3 antikropp. Dessutom har en nukleär motfärgning med DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol) utförts (figur 1).
Figur 1. Fluorescerande mikrofotografier visualiserar immunodetektion av motoneuroner med anti-ChAT antikropp (röd) och cellulära kärnor motfärgning med DAPI (blå) i mus ländryggen ryggmärgen främre horn en vildtyp (wt) (till vänster) och en SOD G93A transgen (tg) (till höger) musen vid en ålder av 130 dagar. Skala bar: 40 nm.
Som immunohistokemisk analys avSOD G93A möss är inte det primära tillämpningsområdet för denna artikel kontakta den ursprungliga publikationen där dessa transgena möss har karakteriserats och senare sådana som studerar terapeutiska metoder för vidare hänvisning 1, 5, 6. Om terapeutiska effekter skall differentieras på immunhistologisk nivån klart definierade kvantitativa utvärderingsalgoritmerna bör tillämpas stödjas av en stereologisk programvara (till exempel se 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den SOD1 (G93A) genetiska musmodell är en värdefull djurmodell för att studera sjukdomsförloppet progressiva motoneuron förluster kan jämföras med människans amyotrofisk lateral skleros 8. En mängd olika behandlingsmetoder paradigm har utvärderats i denna modell och utgör en grund för senare testning i humana kliniska studier 8-10. För att kunna detektera signifikanta skillnader i en experimentell behandling studie i dessa möss, är det av yttersta vikt att omfatta minst 24 kull-matchade jämn könsfördelning möss av samma genetiska bakgrund och följer en dubbel-blind designen 8. Jämförbart med kliniska studier, bör en enda enhetlig endpoint kriterium väljas. Här, är den vanligast använda en oförmåga hos djuret för att räta upp sig i 30 sekunder efter att ha placerats på dess sida. Om detta kriterium uppnås avlivas djuret och dess livslängd registreras såsom tiden för överlevnad.
Rehabiliterint studier kan startas vid en presymtomatiska kliniska tillstånd (t ex dag i livet (DOL) 50 eller ens om DOL 30) om djuren ännu inte uppvisar något tecken på motorisk dysfunktion och skulle görs med 4 punkter i vår kliniska poängsystem . En annan möjlighet består i en symptomatisk behandling tillvägagångssätt som bör starta när den första kliniska symtomet visas och bakbenen skakningar är uppenbart när djuret är upphängd i svansen. Detta definieras som sjukdom debut och denna första sjukdomen steg är betygsätts med den kliniska poäng 3. Betydande försämringar i test av motorisk funktion och muskelstyrka inträffar vanligen bara mer än 2-4 veckor senare. Eftersom i genomsnitt djuren når första kliniska sjukdomen etappen omkring DOL 80, vissa forskare påbörja sin symptomatisk behandling för alla djur vid denna tidpunkt i en förenklad strategi. I båda inställningarna är det obligatoriskt att följa sjukdomens progression. Detta bör inledas vid tidpunkten för behandlingens början av presymptiskt behandlade djur (DOL 50 eller DOL 30, respektive) eller vid DOL 70 för symptomatiskt behandlade djur. Övervakning av sjukdomsprogression inkluderar en två gånger i veckan bestämning av kroppsvikt, klinisk neurologisk scoring och tester av motorisk funktion och muskelstyrka. Om djuren når klinisk värdering 1 (dra av minst en bakbenen) rekommenderar vi att utföra dagliga bestämning av kroppsvikt och klinisk övervakning för att inte missa den kliniska poäng 0 poäng (symmetrisk förlamning, oförmåga att räta upp sig eller förlust av 20 % av maximal kroppsvikt) när djuren måste omedelbart avlivades och experimentet avslutas. Det rekommenderas att för första gången examinator styrs av en erfaren djur forskare som hjälper till att upptäcka även subtila kliniska tecken på progression. Den kliniska 4 poängnoteringssystem systemet efter Weydt et al 2 är väl etablerad i branschen och är ett tillförlitligt system med hjälp av kriterier som klart kan differentieras. Enmer subtil differentiering av kliniska symptom skulle vara mindre tydliga och mycket examinator beroende.
För att detektera beteendestörningar en mängd av test-paradigmer är tillgänglig. De flesta författare gynnar rotarod test som utvärderar förmågan hos djuret att köra på en roterande cylinder 4, 11. I en studie som utvärderar betydelsen av beteendemässiga tester i SOD1 G93A musen modell rotarodtestet visat sig vara mycket känslig för att upptäcka signifikanta skillnader mellan vildtyp och transgena möss så tidigt som från och med vecka 16 år den 11. Möjliga modifieringar omfattar körs med en konstant hastighet eller en accelererad hastighet körning. I vilket fall som helst djuren måste utbildas innan den första giltiga tester, eftersom vissa kan behöva mer utbildning än andra att få en grundläggande nivå av motor samordning. En begränsning representeras av olika motiverade djur att utföra denna uppgift. Detta kan dock kompenseras genom upprepade tester på minst three gånger per dag undersökning. En annan motor beteendetest som är mycket känslig vid detektering tidiga motoriken är fotavtrycksanalys 11. Det är dock ganska arbetsamt eftersom djuren måste vara motiverad för att köra över en landgång efter att ha fötterna doppas i en reservoar av färg. Kvaliteten hos avtrycket kan variera i stor utsträckning och en mjukvara för datorstödd analys är svårt. Därför föredrar vi att rotarod-test för utvärdering av motorisk koordination.
Den hängande tråden Testet utvärderas muskelkraft i armar och ben. Det är en ganska rå test som bäst upptäcker tidiga muskulösa underskott några veckor efter påbörjad av sjukdom 4. Emellertid är det mycket lätt att utföra och hela testanordningen kan lätt konstrueras. En mer utarbetad test för muskelstyrka är användningen av en kraftomvandlare 12. Här är musen uppmanas att ta en bar ansluten till en kraftgivare med antingen den bakre eller dess förentassar. Andra funktionella tester som måste beaktas omfatta mätning av den löpande hjulet avståndet eller ens utvärdering av öppna fält aktivitet 3, 13. Men i vår erfarenhet kombinationen av Rotarod och hängde tråden testet visade sig vara mest känsliga, lätt praktiskt och tidseffektivt för utvärdering av SOD1 G93A möss. Sammantaget bör en preklinisk studie på djur utformas mycket noggrant och bör följa de grundläggande principerna för en kliniska prövningar som beskrivs i Consort riktlinjerna www.consort-statement.org ) 14. Först då kan användningen av djur för preklinisk forskning motiveras och resultaten kan i slutändan leda till en lyckad översättning till en mänsklig klinisk tillämpning.
Dessa kliniska och beteendemässiga fynd bör alltid korreleras till en analys av patologi neuromuskulära enheten inklusive ryggmärg motoneuronen, axon och neuromuskulära förbindelsen 14. Här är en hög kvalitet analys av CNS ryggmärgen patologi en förutsättning för tolkningen av effekter i överlevnad eller sjukdomsprogression. Eftersom noggrann vävnadsfixering är kritisk, bör perfusion av djuren med en 4% paraformaldehyd innehållande PBS-lösning standardiseras bra. För att kunna ta försiktigt bort ryggmärgen en dissektion tabell ska installeras tillsammans med en fast verksamhet mikroskop och fina kirurgiska instrument måste vara tillgängliga (se listan av kirurgiska instrument nedan). Efter det att hela ryggmärgen har tagits bort, kan den bearbetas till lämplig sektionering tekniken (t.ex. vibratom eller cryotome) och kan slutligen utsättas för immunhistologisk analys. Här, basiska utvärderingsparametrar är antalet ryggmärgsmotoneuroner och aktiverade eller infiltrerande gliaceller 10, 15. Beroende på den ursprungliga frågeställningen, ytterligare immunohistokemiska markers såsom SOD aggregat eller CNS endotel integritet kan utvärderas. Vidare kan perifera nervsystemet sjukdomspatologin utvärderas genom undersökning av perifera axoner och neuromuskulära föreningspunkter. Endast kombinationen av både kliniska och immunohistokemisk analys av CNS-och PNS tillhandahålla en grundlig vy av den totala ALS patologi som skall korreleras med de kliniska resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
LT har fått bidrag stöd från Forschungsförderungsprogramm universitetets Medicin Göttingen. PL och MB stöddes av DFG Research Center för Molekylär fysiologi av hjärnan (CMPB), Göttingen. Författarna tackar Dr Lars Tatenhorst för hjälp med videography och Birgit Liebau för hjälp med ljud och videoredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
