En vätskefas affinitetsinfångning Analys med användning av magnetiska pärlor för att studera protein-proteininteraktion: polioviruset-Nanobody Exempel

Summary

I denna artikel är en enkel, kvantitativ, vätskefas affinitetsinfångning analys presenteras. Det är en tillförlitlig teknik baserad på interaktionen mellan magnetiska pärlor och märkta proteiner (t.ex. nanobodies) å ena sidan och affiniteten mellan den märkta proteinet och en andra, märkt protein (t. ex poliovirus) på den andra.

Abstract

I denna artikel är en enkel, kvantitativ, vätskefas affinitetsinfångning analys presenteras. Förutsatt att ett protein kan märkas och ett annat protein märkt, kan denna metod implementeras för undersökning av protein-proteininteraktioner. Det är baserat på ena sidan om ett erkännande av det märkta proteinet genom kobolt-belagda magnetiska pärlor och å andra sidan på interaktionen mellan det märkta proteinet och en andra specifikt protein som är märkt. Första, de märkta och märkta proteiner blandades och inkuberades vid rumstemperatur. De magnetiska pärlor, som känner igen den tagg, tillsätts och den bundna fraktionen av märkt protein separeras från den obundna fraktionen med användning av magneter. Mängden av märkt protein som är fångade kan bestämmas på ett indirekt sätt genom att mäta signalen från det märkta proteinet förblev i den obundna fraktionen. Den beskrivna vätskefas affinitet analys är mycket användbart när strukturella omvandling känsliga proteiner assayed. Utvecklingen och tillämpningen av analysen visas för interaktionen mellan poliovirus och poliovirus erkänna nanobodies ^1. Eftersom poliovirus är känslig för konformationsförändring omvandlingen ² när den är bunden till en fast yta (opublicerade resultat), är användning av ELISA begränsad och en flytande fas system bör därför vara att föredra. Ett exempel på en flytande fas system används ofta i polioresearch ^3,4 är den mikro protein A-immunoutfällning testet ^5. Även om detta test har visat dess tillämpbarhet, kräver det en Fc-struktur, vilket är frånvarande i de nanobodies ^6,7. Men som en annan möjlighet, kan dessa intressanta och stabil gemensam-domän-antikroppar ⁸ enkelt konstruerad med olika taggar. Den allmänt använda (His) _6-taggen visar affinitet för tvåvärda joner, såsom nickel eller kobolt, som kan på sin tur lätt beläggs på magnetiska pärlor. Vi utvecklade därför denna enkla kvantitativaaffinitetsinfångning analys baserad på kobolt-belagda magnetiska pärlor. Poliovirus märktes med ³⁵ S för att obehindrat samverkan med nanobodies och göra en kvantitativ detektering möjligt. Metoden är enkel att utföra och kan fastställas med en låg kostnad, som stöds ytterligare av det möjligt att effektivt regenerera de magnetiska pärlorna.

Protocol

Principen (A) och en översikt av förfarandet (B) är avbildade i Figur 1.

1. Beredning av buffert

1. Framställ Bindning / tvätt-buffert genom upplösning av natrium-divätefosfat (50 mM) och natriumklorid (300 mM) i vatten och justera pH till 8,0. Dessutom lägger Tween 20 (0,01% (m / v) slutlig koncentration), metionin (2% (m / v) slutlig koncentration) och albumin (0,1% (m / v) slutlig koncentration) och justera till önskad volym.

2. Framställning av de magnetiska pärlorna

Förbered de magnetiska pärlor enligt bruksanvisningen. Kortfattat:

1. Resuspendera de magnetiska pärlorna med användning av en virvel.
2. Överföring för varje prov, 10 | il av de återsuspenderade magnetiska pärlor (40 mg / ml) till ett rör.
3. Samla de magnetiska pärlorna med användning av en magnet, tills supernatanten är klar (+ / - 30 sek) och avlägsna supernatanten försiktigt.
4. Tvättamagnetiska kulor två gånger: resuspendera pärlorna i 150 | il Bindning / tvättbuffert. Migrera de magnetiska pärlorna till en sida av röret med användning av en magnet tills supernatanten är klar och noggrant avlägsna supernatanten.
5. Använda 40 | il av Bindning / tvättbuffert, för varje prov, för att återsuspendera pärlorna (10 mg / ml).

3. Affinitet infångningsanalys

Obs: För att mäta (kosmiska) bakgrund radioaktiviteten (0% radioaktivitet), ingen radiomärkta virus till ett kontrollprov 1. I stället är samma volym Bindning / tvättbuffert tillsattes.

Notera: 100% radioaktivitet definieras av ett kontrollprov 2 till vilken alla komponenter tillsätts förutom nanobody. I stället är samma volym Bindning / tvättbuffert tillsattes.

1. Bringa 2000 cpm av ³⁵ S-märkta (β-strålning) poliovirus Sabin-stam typ 1 ^9, späddes med Bindning / tvättbuffert till 80 pl i en 96-brunnars mikrotiterplatta.
2. Lägg 10 & mu, l av nanobody utspädning till brunnarna.
3. Blanda under cirka 10 sekunder med användning av en skakapparat.
4. Tillåta proverna inkuberas under 1 timme vid rumstemperatur.
5. Tillsätt 40 pl av den tvättade magnetiska pärlor suspension och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur, under kontinuerligt skakning.
6. Separera kulorna och supernatanten med en magnet och överföra den klarnade supernatanten till ett rör.

4. Mätning av radioaktiviteten

1. Överföra 50 | il av supernatanten från steg 3,6 till en räkning av kolven.
2. Tillsätt 3 ml scintillationsvätska och blanda. Mäta radioaktiviteten i en β-scintillationsräknare.

5. Recirkulering av pärlor

1. Samla de använda magnetiska pärlorna i ett rör och centrifugera vid 500 xg under 2 minuter eller tills en klar supernatant erhålles.
2. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pärlorna i 6 ml 0,5 M NaOH.
3. Överför suspensionen till multiple rör och inkubera i ett ultraljudsbad i 5 minuter.
4. Använda magneterna för att samla de magnetiska pärlorna och avlägsna supernatanten.
5. Tillsätt 1 ml 2% SDS-lösning till varje rör och återsuspendera med användning av en vortex. Koka under 5 minuter.
6. Samla pärlorna och avlägsna supernatanten. Återsuspendera pärlorna i 1 ml 0,2 M EDTA (pH = 7).
7. Inkubera rören i ett ultraljudsbad under 5 minuter och en gång till, avlägsna supernatanten.
8. Tillsätt 1 ml vatten till varje rör och återsuspendera pärlorna. Samla pärlorna och avlägsna supernatanten. Upprepa detta tvättsteg två gånger.
9. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pärlorna i 1 ml 10 mM CoCb _2-lösning. Sätt på en shaker i 10 minuter.
10. Avlägsna supernatanten med en magnet för att samla pärlorna och återsuspendera i 1 ml Bindning / tvättbuffert.
11. Avlägsna supernatanten och tvätta pärlorna två gånger med användning av 1 ml av 20% (v / v) etanol
12. Återsuspendera pärlorna i sin ursprungliga volym på 20% (volym / volym) ethanol att erhålla regenererade pärlor i en koncentration av 40 mg / ml.

6. Tolkning av resultat

1. Kontrollprov 1, där ingen radiomärkt virus tillsattes kommer att användas för att korrigera för bakgrunden radioaktivitet och för att ställa in 0% radioaktivitet värde. Kontrollprov 2, som inte innehåller nanobody och där således allt radioaktivt märkt virus kvar i supernatanten, anges som 100% radioaktivitet värde.
2. Den procentuella andelen radioaktivitet i supernatanten (= en%) är ett mått på den totala utfällning (= 100 - A%) av den radiomärkta viruset genom den nanobody.

7. Representativa resultat

Representativa resultat för denna affinitetsinfångning analys visas i figurerna 2, 3 och 4. I figur 2, är affiniteten hos PVSS38C, en nanobody specifik för poliovirus, visas. Affiniteten hos PVSS38C testades med avseende på tre olika antigener från poliovIRU: Nativt-antigen (N-antigen), uppvärmd-antigen (H-antigen) och 14S-subenheter. N-antigen är intakt virus som smittar. När viruset upphettas (20 minuter vid 56 ° C) eller bunden till en fast yta (opublicerade resultat), konformation av kapsiden förändringar, som resulterar i en (partiell) förlust av det virala RNA och kapsidproteinet VP4, och tom kapsider bildas som sedan kallade H-antigener. 14S-subenheter är montering intermediärer. Dessa antigener känns igen av olika uppsättningar av antikroppar efter immunisering ¹⁰ och besitter därför olika epitoper och ställen antigena. I figuren andelen radioaktivitet återfinns i den överstående representeras som en funktion av koncentrationen av nanobody. Det kan ses att radioaktiviteten i supernatanten från de prover som innehåller radioaktivt märkta 14S-subenheter minskar med ökande koncentrationer av nanobody PVSS38C. Detta kan översättas som en ökning av mängden poliovirus 14S-subenheter conansluten till nanobody PVSS38C och indirekt till de magnetiska pärlorna. Den infångande titer (= den koncentration av nanobody krävs för att avskilja 50% av radiomärkt virus) kan grafiskt beräknas som 0,099 nM. Ingen affinitet för PVSS38C för den N-antigena och H-antigena formen av poliovirus observeras. Från dessa data är det tolkas som PVSS38C interagerar med en epitop som enbart finns på 14S subenheten och inte på de två andra antigena former av poliovirus.

För att demonstrera att förlusten av radioaktivitet från supernatanten är endast beroende på den specifika affiniteten hos nanobody mot dess antigener utfördes samma analys utfördes med NB1, att en nanobody genererats mot den lrpB transkriptionsregulator för Sulfolobus sulfataricus och känd saknar interaktion med varje poliovirus-antigen. Resultatet av denna analys visas i Figur 3. Alla radioaktivt märkt virus kvar i supernatanterna som visar att det inte finns någon reaktivitetNB1 mot de tre antigena former av poliovirus.

Reproducerbarhet av resultaten testades genom att upprepa experimentet under totalt åtta gånger för en given nanobody (dvs PVSP29F) vid olika dagar och av olika personer. Resultaten visas i figur 4. Medelvärdet av den procentuella radioaktiviteten i supernatanten beräknades för varje koncentration nanobody och representeras i motsvarighet med dess standardavvikelse.

Figur 1. En översikt av principen (A) och metod (B) för analysen. A. His-märkt nanobodies som specifikt känner igen en viss poliovirus antigen kommer att kunna interagera med de kobolt-belagda magnetiska pärlor och kommer att fälla ut den radioaktivt märkta viruset. B. His-taggade nanobodies sättes till radioaktivt märkt poliovirus och inkuberades. Kobolt-belagda magnetiska pärlor ärtillsattes och magnetisk separation av den bundna / obundet antigen utförs. Radioaktiviteten i supernatanten mäts och mängden infångat antigen kan härledas.

Figur 2. Magnetiska pärlor affinitetsinfångning av olika poliovirus antigener genom nanobody PVSS38C. Den procentuella andelen radioaktivitet återfinns i den överstående representeras som en funktion av koncentrationen av PVSS38C. För 14S en koncentration-respons-förhållande kan hittas, visar interaktionen mellan PVSS38C med en epitop enbart finns på 14S. Ingen signifikant interaktion med N-eller H-antigenet kan detekteras, även om en försumbar icke-specifik infångning vid mycket höga koncentrationer är märkt.

Figur 3. Magnetiska pärlor affinitetsinfångning av olika poliovirus antigener genom nanobody NB1 figur 2 är således endast på grund av den specifika affiniteten hos nanobody mot dess antigen.

Figur 4. Reproducerbarhet av analysen. Medelvärdet av den procentuella radioaktiviteten i supernatanten representeras som en funktion av koncentrationen av nanobody. Experimentet upprepades åtta gånger vid olika dagar och av olika personer. Standardavvikelsen representeras som vertikala staplar.

Discussion

I protokollet, är radioaktiviteten av antigenet interagera med nanobody definieras som förlust av radiomärkt virus från supernatanten. Därför mängden utfälld radioaktivitet (= 100 - en%) (bundet till de magnetiska pärlorna) kan beräknas på ett indirekt sätt av radioaktiviteten i supernatanten (= en%). Å andra sidan är det också möjligt att mäta radioaktiviteten av den utfällda bundna fraktionen av antigen i ett direkt sätt genom eluering av immunkomplexen från de magnetiska pärlorna med 500 mM imidazol. Det har tidigare visats ¹¹ att det är en perfekt matchning mellan den totala mängden radioaktivitet och summan av radioaktiviteten som finns i supernatanten och pellets fraktioner. Det är därför acceptabelt och tidsbesparande för att mäta radioaktiviteten i supernatanten. Metoden för eluering av immunkomplexen från de magnetiska pärlorna beskrivs av Thys et al., 2011 ^11.

Apart från poliovirus, är andra picornavirus kända för att vara känsliga för fast yta inducerad konformationell omvandling, som den ekonomiskt viktiga mul-och klövsjukevirus (FMDV) ^2. Förändringen av formen och minskningen i bindningsaffinitet för proteiner i allmänhet efter bindning till plast är beskrivet i litteraturen ^12. Analysen kan därför användas för att undersöka interaktionen mellan andra proteiner som är känsliga för konformationsförändringar, för epitopkartläggning, för att definiera mängden av korrekt veckade proteiner, för att screena för struktur besläktade föroreningar under tillverkningsprocessen, för snabb screening av satserna under produktion, kan för rening av prover som är blandningar av nära besläktade proteiner och många andra tillämpningar betraktas. Tillgången till olika magnetiska pärlor med affinitet för olika taggar stöder dessa möjligheter. Även radioaktiva markörer användes i dessa experiment, andra signaler kanskall genomföras för att detektera och kvantifiera de interaktioner som fluorescerande färgämnen ^13,14. Många prov kan analyseras under ett experiment och det är möjligt att automatisera metoden. De magnetiska pärlor som användes i denna analys kan enkelt återanvändas genom att bara en kokande, strippning och regenerering steg, vilket gör denna en billig metod. Aktuell, gav fem av dessa regenereringscykler av pärlorna inte påverka reproducerbarheten hos resultaten (data ej visade).

Dessutom kan det betraktas som en särskild metod, eftersom specifika nanobodies används som bara erkänna deras antigen, eftersom de kunde interagera på olika sätt med poliovirus N-och H-antigener och 14S subenheten.

Man kan dra slutsatsen att denna affinitetsinfångning analys med användning av magnetiska pärlor är en analys med ett brett spektrum av möjliga tillämpningar som är tillförlitlig, enkel, kvantitativ, specifik, tidsbesparande och billig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown	Invitrogen	101.03D	Magnetic beads
Optiphase ’HiSafe’ 2	PerkinElmer, Inc.	1200 - 436	Scintillation fluid