Summary
Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bu bir yandan, diğer tarafta etiketli protein ve ikinci, etiketli protein (örn. poliovirus) arasındaki yakınlığı manyetik boncuk ve etiketli proteinlerin (örneğin nanobodies) arasındaki etkileşime dayanan güvenilir bir tekniktir.
Abstract
Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bir proteinin etiketlenmiş edilebilir olması şartıyla ve başka protein etiketli, bu yöntem, protein-protein etkileşimlerinin araştırılması için de uygulanabilir. Bu, kobalt kaplı manyetik boncuklar ile etiketlenmiş protein tanınması ile etiketlenmiş protein ve etiketlenmiştir ikinci bir özel protein arasındaki etkileşimi, diğer yandan, bir taraftan dayanır. İlk olarak, etiketlenmiş ve etiketlenmiş proteinleri karıştırılır ve oda sıcaklığında inkübe edilir. Etiketi kabul manyetik boncuk, eklenir ve etiketli protein bağlı fraksiyonu mıknatıslar kullanılarak ilişkisiz fraksiyon ayrılır. Yakalanır etiketli protein miktarı, ilişkisiz fraksiyonu içinde kaldı etiketli protein sinyali ölçülmesi ile dolaylı bir şekilde belirlenebilir. Yapısal dönüşüm duyarlı proteinler eşek olduğunuzda açıklanan sıvı faz afinitesi tayini son derece yararlıayed. Assay of gelişimi ve uygulama poliovirus ve nanobodies 1 tanıyan poliovirus arasındaki etkileşim için gösterilmiştir. Poliovirus katı bir yüzey (yayınlanmamış sonuçlar) eklenmiş konformasyonel dönüşüm 2 karşı hassas olduğu için, ELISA kullanımı sınırlıdır ve bir sıvı faz bazlı sistemi nedenle tercih edilmelidir. Genellikle polioresearch 3,4 kullanılan bir sıvı fazda tabanlı bir sistemin bir örneğini mikro protein A-immünopresipitasyon testi 5 'dir. Bu test uygulanabilirliğini kanıtlamış olsa da, 6,7 nanobodies bulunmaz bir Fc-yapısı gerektirir. Ancak, başka bir fırsat olarak, bu ilginç ve istikrarlı tek alan antikorlar 8 kolayca farklı etiketler ile tasarlanmış olabilir. Yaygın (O'nun) 6-etiketi gibi onların dönüşünü kolaylıkla manyetik boncuk kaplı edilebilir nikel ve kobalt gibi iki değerlikli iyon afinite gösterir kullanılır. Bu nedenle, bu basit kantitatif geliştirdiafinite yakalama testi kobalt kaplı manyetik bilye dayalı. Poliovirüs nanobodies ile engellenmeden etkileşimi etkinleştirebilirsiniz ve nicel bir saptama yapılabilir kılmak için 35 S etiketli edildi. Metodu gerçekleştirmek için kolaydır ve daha etkili bir şekilde yenileyici manyetik boncuklar olasılığını tarafından desteklenen bir düşük maliyet ile tespit edilebilir.
Protocol
Prensibi (A) ve yöntemi genel bir (B) Şekil 1 içinde tasvir edilmiştir.
1. Tampon hazırlanması
- Erime sodyum dihidrojen fosfat (50 mM) ve su içinde sodyum klorür (300 mM) ile Yıkama / bağlanma tampon hazırlamak ve 8.0 pH ayarlanır. Buna ek olarak metiyonin (% 2 (m / v) son konsantrasyon) ve albumin Tween 20 (% 0.01 (m / v) son konsantrasyon), (0.1% (m / v) son konsantrasyon) ekleyin ve gerekli hacmi e ayarlanır.
2. Manyetik Boncuk hazırlanması
Kılavuzuna göre manyetik boncuk hazırlayın. Kısaca:
- Bir girdap kullanarak manyetik boncuk süspansiyon hale getirin.
- Transferi, her bir örnek için, bir tüp içine yeniden süspanse manyetik boncuklar (40 mg / ml) 10 ul.
- Süpernatant netleşene kadar, bir mıknatıs kullanarak manyetik boncuk toplayın (+ / - 30 sn) ve supernatant dikkatlice çıkarın.
- Yıkayınmanyetik boncuk iki kez: Yıkama / Bağlama tampon 150 ul içinde boncuklar tekrar süspansiyon. Manyetik boncuk süpernatant netleşene kadar bir mıknatıs kullanarak tüpün bir tarafına göç ve dikkatlice supernatant çıkarın.
- Boncuklar (10 mg / ml) tekrar süspansiyon için, her bir örnek için, Yıkama / bağlanma tampon maddesi 40 ul kullanabilir.
3. Affinity Yakalama Testi
Not: (kozmik) arka radyoaktivite (0% radyoaktivite) ölçmek için, herhangi bir radyoetiketli virüsü bir kontrol örneği 1 eklenir. Bunun yerine, aynı hacimde Binding / Yıkama tamponu ilave edilir.
Not: 100% radyoaktivite, tüm bileşenler nanobody hariç eklenir için bir kontrol örneği 2 ile tanımlanır. Bunun yerine, aynı hacimde Binding / Yıkama tamponu ilave edilir.
- Bir 96-kuyucuklu mikrotitre plakası içine 80 ul kadar Yıkama / bağlanma tampon maddesi ile seyreltildi (β-radyasyon) poliovirus Sabin suşu tipi 1 9, 35 etiketli S 2000 cpm getirir.
- Ekle 10 & mu; kuyulara nanobody seyreltme l.
- Bir çalkalayıcı kullanarak yaklaşık 10 saniye karıştırın.
- Numuneler oda sıcaklığında 1 saat inkübe izin verin.
- Yıkanmış manyetik boncuklar süspansiyonu, 40 ul ekleyin ve sürekli çalkalama altında, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir.
- Boncuk ve bir mıknatıs kullanarak süpernatant ayırın ve bir tüp içine temizlenmiş süpernatant aktarın.
4. Radyoaktivite ölçümü
- Bir sayma balona adım 3.6 den süpernatan 50 ul aktarın.
- Sintilasyon sıvısı ve karışım 3 ml ilave edilir. Bir β-sintilasyon sayacında radyoaktivite ölçün.
5.. Boncuk Geri Dönüşüm
- 2 dakika boyunca 500 xg'de veya açık bir süpernatant elde edilinceye kadar bir tüp ve santrifüj kullanılan manyetik boncuk toplayın.
- Süpernatantı ve 6 ml 0.5 M NaOH içinde boncuklar tekrar süspansiyon.
- Multipl için süspansiyon aktarıne tüpler ve 5 dakika boyunca bir ultrason banyosunda inkübe.
- Manyetik boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için mıknatıslar kullanın.
- Her tüpe 1 ml% 2 SDS-çözüm ekleyin ve bir girdap kullanarak tekrar süspansiyon. 5 dakika boyunca kaynatın.
- Boncuklar toplayın ve supernatant çıkarın. 1 ml 0.2 M EDTA (pH = 7) içerisinde yeniden süspanse boncuklar.
- 5 dakika boyunca bir ultrason banyosunda tüpler ve bir kez daha inkübe, süpernatan kaldırın.
- Her tüpe 1 mL su ekleyin ve boncuklar tekrar süspansiyon. Boncuklar toplayın ve supernatant çıkarın. Iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın.
- Süpernatan kaldırmak ve 1 ml 10 mM CoCl 2 çözelti içinde yeniden süspanse boncuklar. 10 dakika bir çalkalayıcı koyun.
- Boncuk toplamak ve Yıkama / Ciltleme tampon 1 ml tekrar süspansiyon için bir mıknatıs kullanarak süpernatantı.
- Süpernatant kaldırmak ve boncuklar 20% 1 ml kullanılarak iki kere (v / v) etanol yıkayıp
- % 20 kendi orijinal hacim (v / v) ve in boncuklar tekrar süspansiyon40 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda yeniden elde etmek için boncuklar hanol.
6. Sonuçların Yorumlanması
- Hiçbir radyoaktif virüs eklenmiş olan Kontrol numunesi 1, arka radyoaktivite düzeltmek için ve% 0 radyoaktivite değeri ayarlamak için kullanılır. Nanobody nerede ve dolayısıyla tüm radyoaktif virüs süpernatant kalır içermez Kontrol örnek 2,% 100 radyoaktivite değeri olarak ayarlanır.
- Nanobody tarafından radyoaktif virüsün - süpernatan radyoaktivite yüzdesi (= a%) toplam yağış (a% = 100) bir ölçüsüdür.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Bu afinite yakalama testinin sonuçları temsili Şekiller 2, 3 ve 4 'de gösterilmiştir. Şekil 2'de, PVSS38C, poliovirus için bir nanobody spesifik afinite ile gösterilir. PVSS38C bir afinite poliov üç farklı antijenleri için test edildiirus: Yerli-antijen (N-antijen), Isıtmalı-antijen (H-antijen) ve 14S alt birimleri. N-antijen bulaşıcı intakt bir virüstür. Virüs ısıtılır (56 azından 20 dakika ° C) ya da viral RNA'nın bir (kısmi) kaybı ve kapsid proteini VP4 ile sonuçlanan bir katı yüzey (yayınlanmamış sonuçlar), kapsid değişikliklerin konformasyon, ekli ve boş olduğunda capsids sonra H-antijen olarak adlandırılan edildiği oluşturulmaktadır. 14S alt birimleri montaj ara vardır. Bu antijenler, aşı sonrası 10 antikorların farklı setleri tarafından tanınan ve bu nedenle farklı epitopları ve antijenik sitelere sahip edilir. Şekildeki süpernatan bulunan radyoaktivite yüzdesi nanobody konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak temsil edilir. Bu radyoetiketli 14S ait birimlerini içeren örneklerin üstte yüzen madde içindeki radyoaktivite nanobody PVSS38C artan konsantrasyonları ile azalmaktadır olduğu görülebilir. Bu poliovirus 14S alt birimleri con miktarında bir artış olarak tercüme edilebilirnanobody PVSS38C ve dolaylı manyetik boncuk bağlanırsınız. Yakalama titresi (radyoaktif virüs% 50 yakalama nanobody gerekli of = konsantrasyon) grafiksel 0.099 nM olarak hesaplanabilir. N-antijenik ve poliovirus H-antijenik formu için PVSS38C No afinite görülmektedir. Bu verilere bakıldığında PVSS38C poliovirus diğer iki antijenik formları sadece 14S alt birim mevcut değildir ve bir epitopu ile etkileşim olduğunu yorumlanır.
Süpernatan gelen radyoaktivite kaybı sadece antijenleri doğru nanobody spesifik afinite bağlı olduğunu göstermek için, aynı deney Ab1 ile gerçekleştirildi, Sulfolobus sulfataricus arasında lrpB transkripsiyon faktörü karşı oluşturulan ve bilinen bir nanobody bir etkileşim ile sahip Herhangi bir poliovirus antijen. Bu değerlendirmenin sonucu, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bütün radyoetiketli virüsünün herhangi reaktivitesi olduğunu gösteren süpernatanlar kalırPoliovirus üç antijenik türlerine karşı Ab1.
Sonuçların tekrarlanabilirliği farklı günde bir verilen nanobody (yani, PVSP29F) sekiz defa olmak üzere toplam deneyi tekrarlayarak ve farklı kişiler tarafından test edildi. Sonuçlar Şekil 4 'de gösterilmiştir. Süpernatant yüzde radyoaktivitenin ortalama değeri her nanobody konsantrasyonu için hesaplandı ve standart sapma ile yazışmalarda temsil edilmektedir.
Şekil 1.. Assay of prensibi (A) bir özetini ve (b) yöntemi. A. özellikle belli bir poliovirus antijen kobalt kaplı manyetik bilye ile etkileşim ve radyoaktif işaretli virüs çöktürmek olacaktır mümkün olacak tanımak nanobodies Onun etiketli. B. His-etiketli nanobodies radyoaktif olarak etiketlenmiş poliovirus eklenir ve inkübe edilir. Kobalt-kaplı manyetik bilye vardıreklenmiş ve ilişkili / ilişkisiz antijen manyetik ayırma gerçekleştirilir. Üstte kalan radyoaktivite ölçülür ve ele antijen miktarda elde edilebilir.
Şekil 2. Nanobody PVSS38C farklı poliovirus antijenlerin Manyetik boncuk afinitesi yakalama. Süpernatan bulunan radyoaktivite yüzdesi PVSS38C konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak temsil edilir. 14S için bir konsantrasyon-yanıt ilişkisi 14S münhasıran mevcut bir epitopu ile PVSS38C etkileşimi gösteren bulunabilir. Ile belirgin bir etkileşim N-, ne de bir non-spesifik çok yüksek konsantrasyonlarda yakalama ihmal edilebilir bir fark edilmiş olmasına rağmen H-antijen, tespit edilebilir.
Şekil 3. Nanobody Ab1 farklı poliovirus antijenlerin Manyetik boncuk afinitesi yakalama Şekil 2'de radyoaktivite kaybı dolayısıyla antijenleri doğru nanobody spesifik afinite sadece kaynaklanmaktadır.
Şekil 4. Testin tekrarlanabilirliği. Üstte yüzen madde içindeki yüzdesi radyoaktivite ortalama değeri nanobody konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak temsil edilir. Deney, farklı gün ve farklı kişiler tarafından sekiz kez tekrar edildi. Standart sapma dikey çubuklar olarak temsil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolde, nanobody ile etkileşen antijen radyoaktivite süpernatan gelen radyoetiketli virüsünün kaybı olarak tanımlanmaktadır. Bu nedenle çöken radyoaktivite (= 100 -%) miktarı (manyetik boncuk bağlı) supernatant (= bir%) olarak radyoaktivite tarafından dolaylı bir şekilde tahmin edilebilir. Diğer taraftan, 500 mM imidazol ile manyetik boncuklar immün elüt tarafından doğrudan bir şekilde antijen çöktürülmüş bağlı fraksiyonun radyoaktivite ölçmek için de mümkündür. Bu, daha önce radyoaktivite miktarı ve süpernatan ve pellet fraksiyonlar bulunan radyoaktivite toplamı arasında mükemmel bir eşleşme olduğunu 11 gösterilmiştir. Bu nedenle, kabul edilebilir ve süpernatanın radyoaktivite ölçmek için zaman tasarrufu olup. Manyetik boncuklar immün ve elüsyon için yöntem Thys ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir., 2011 11.
Apapoliovirus gelen rt, diğer picornavirusler ekonomik bakımdan önemli ayak ve ağız hastalığı virüsü (FMDV) 2 gibi, yapısal dönüşüm neden olduğu katı yüzeye duyarlı olduğu bilinmektedir. Plastiğe bağlama sonra şekil ve genel olarak proteinlerin bağlanma afiniteleri de indirgeme değiştirilmesi literatürde 12 içinde tarif edilmektedir. Bu nedenle tahlil sırasında partilerin hızlı bir tarama için, üretim sürecinde yapısı ile ilgili kirlilikler için ekranı, düzgün katlanmış proteinlerin miktarı tanımlamak için, epitop haritalama için, yapısal değişikliklere duyarlı olan diğer proteinleri arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir Üretim, yakından ilgili protein ve diğer birçok uygulama karışımlarıdır örnekleri saflaştırılması için düşünülebilir. Farklı etiketler için afinite ile farklı manyetik bilye durumu bu olanakları destekler. Radyoaktif etiketler bu deneylerde kullanıldı rağmen, diğer sinyaller olabilirfloresan boyalar 13,14 gibi etkileşimler, algılamak ve ölçmek için uygulanacak. Birçok örnekte bir deney sırasında analiz edildi ve bu yöntemi otomatikleştirmek mümkündür edilebilir. Bu testte kullanılan manyetik boncuklar kolayca bu pahalı olmayan bir yöntemi vermektedir sadece bir kaynama, sıyırma ve rejenerasyon adımı, tarafından yeniden kullanılabilir. Günümüze kadar, boncuklar bu yenilenme devreleriyle beş sonuçları (veriler gösterilmemiştir) tekrarlanabilirliğini etkilemedi.
Buna ek olarak, belirli bir nanobodies bunlar poliovirus N-ve H-antijenleri ve 14S alt ünitesine sahip farklı etkileşim mümkün olduğu gibi sadece kendi antijenine kabul kullanılır, çünkü, belirli bir yöntem olarak kabul edilebilir.
Bu manyetik boncuklar kullanarak bu yakınlık yakalama deneyi, güvenilir, basit, nicel, özgü, zaman tasarrufu ve ucuzdur olası geniş bir uygulama yelpazesi ile bir test olduğu söylenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar radyoaktif etiketli virüs hazırlanması için Farmasötik Biyoteknoloji ve Moleküler Biyoloji Bölümü ve özellikle Monique De Pelsmacker personeline teşekkür ederim. Biz Ellen Merckx ve onların ilginç açıklamalar ve tartışmalar için Hadewych Halewyck ve laboratuvarda yaptığı yardım Gerrit De Bleeser minnettarız. Bu çalışma, maddi Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) ve Dünya Sağlık Örgütü (TSA 200.410.791) bir OZR hibe ile desteklenmiştir. Lise Schotte Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) bir predoctoral üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. The Immunoassay Handbook. , Third edition, Elsevier. (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
