Summary
In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Het is een betrouwbare techniek op de interactie tussen het magnetische kralen en gemerkte eiwitten (bijv. nanobodies) enerzijds en de affiniteit tussen het gemerkte eiwit en een tweede, gemerkt eiwit (bijv. poliovirus) anderzijds.
Abstract
In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Op voorwaarde dat een eiwit kan worden gelabeld en een ander eiwit gelabeld, kan deze methode worden toegepast voor het onderzoek van eiwit-eiwit interacties. Het is gebaseerd op enerzijds op het inzicht gemerkte eiwit door kobalt beklede magnetische kralen en anderzijds op de interactie tussen het gelabelde eiwit en een tweede specifieke eiwit dat wordt aangeduid. Eerst worden de etiketten en gemerkte eiwitten gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur. De magnetische kralen, dat het label herkennen toegevoegd en de gebonden fractie van gemerkt eiwit wordt gescheiden van de ongebonden fractie met magneten. De hoeveelheid gemerkte eiwitten die opgenomen kan worden bepaald op indirecte wijze door meting van het signaal van de gemerkte eiwitten bleven in de ongebonden fractie. De beschreven vloeibare fase affiniteit test is zeer nuttig wanneer conformationele conversie gevoelige eiwitten zijn kontAyed. De ontwikkeling en toepassing van de test is aangetoond voor de interactie tussen poliovirus en het poliovirus herkennen van nanobodies 1. Aangezien poliovirus gevoelig conformationele conversie 2 wanneer gehecht aan een vaste ondergrond (ongepubliceerde resultaten), is het gebruik van ELISA beperkt en een vloeistoffase systeem derhalve de voorkeur. Een voorbeeld van een vloeibare fase systeem vaak gebruikt in polioresearch 3,4 de micro proteïne-A-immunoprecipitatie test 5. Hoewel deze test heeft bewezen de toepasbaarheid, het vereist een Fc-structuur, die afwezig is in de nanobodies 6,7. Echter, zoals een andere mogelijkheid, kunnen deze interessante en stabiele enkel-domein antilichamen 8 gemakkelijk worden gemanipuleerd met verschillende tags. De gebruikte (His) 6-tag affiniteit voor tweewaardige ionen zoals nikkel of kobalt, die gemakkelijk op hun beurt worden aangebracht op magnetische korrels toont. Hiervoor werden deze eenvoudige kwantitatieveaffiniteit capture assay op basis van kobalt gecoate magnetische kralen. Poliovirus werd gelabeld met 35 S om ongehinderd interactie met de Nanobodies mogelijk te maken en een kwantitatieve detectie mogelijk. De methode is eenvoudig uit te voeren en kunnen worden tegen lage kosten, die verder wordt ondersteund door de mogelijkheid effectief regenereren van de magnetische korrels.
Protocol
Het principe (A) en een overzicht van de werkwijze (B) worden weergegeven in Figuur 1.
1. Voorbereiding van de buffer
- Bereid Binding / wasbuffer door oplossen natriumdiwaterstoffosfaat (50 mM) en natriumchloride (300 mM) in water en de pH tot 8,0. Daarnaast voegen Tween 20 (0,01% (m / v) eindconcentratie), methionine (2% (m / v) eindconcentratie) en albumine (0,1% (m / v) eindconcentratie) en aan te passen aan het gewenste volume.
2. Voorbereiding van de magnetische beads
Bereid de magnetische korrels volgens de gebruiksaanwijzing. In het kort:
- Resuspendeer de magnetische korrels met behulp van een vortex.
- Transfer voor elk monster 10 ul van de geresuspendeerde magnetische kralen (40 mg / ml) in een buis.
- Verzamel de magnetische korrels met behulp van een magneet, tot de bovenste is duidelijk (+ / - 30 sec) en verwijder het supernatant voorzichtig.
- Was hetmagnetische kralen tweemaal: mengen van de korrels in 150 pi Binding / wasbuffer. Migreren de magnetische korrels aan een zijde van de buis met een magneet tot de bovenste duidelijk en verwijder de supernatant.
- Gebruik 40 pl Binding / wasbuffer voor elk monster op de parels (10 mg / ml) mengen.
3. Affiniteit Capture Assay
Opmerking: Om de (kosmische) achtergrond radioactiviteit (0% radioactiviteit) te meten, geen radioactief gemerkte virus wordt toegevoegd aan een controle monster 1. In plaats daarvan wordt hetzelfde volume Binding / wasbuffer toegevoegd.
Opmerking: 100% radioactiviteit bepaald door een controle monster 2 waaraan alle componenten toegevoegd behalve de nanobody. In plaats daarvan wordt hetzelfde volume Binding / wasbuffer toegevoegd.
- Breng 2000 cpm 35 S gelabeld (β-straling) poliovirus type 1 Sabin stam 9 verdund met Binding / wasbuffer 80 pi in een 96-wel microtiter plaat.
- Voeg 10 & mu; l nanobody in de putjes aan.
- Meng gedurende ongeveer 10 seconden met behulp van een shaker.
- Laat de monsters geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg 40 ul van de gewassen magnetische korrels suspensie en incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder continu schudden.
- Scheid de hielen en de supernatant met een magneet en dragen de heldere supernatant in een buis.
4. Meting van de radioactiviteit
- Breng 50 ul van het supernatant van stap 3.6 een kolf toe.
- 3 ml scintillatievloeistof en meng. Meet de radioactiviteit in een β-scintillatieteller.
5. Recycling van Beads
- Verzamel de gebruikte magnetische korrels in een buis en centrifugeer op 500 xg gedurende 2 minuten of totdat een heldere bovenstaande vloeistof wordt verkregen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 6 ml 0,5 M NaOH.
- Doe de suspensie in multiple buizen en incubeer in een ultrasoonbad gedurende 5 minuten.
- Gebruik de magneten om de magnetische korrels te verzamelen en de supernatant te verwijderen.
- Voeg 1 ml 2% SDS-oplossing voor elke buis en resuspendeer met behulp van een vortex. Kook gedurende 5 minuten.
- Verzamel de kralen en verwijder het supernatant. Resuspenderen de korrels in 1 ml 0,2 M EDTA (pH = 7).
- Incubeer de buizen in een ultrasoon bad gedurende 5 minuten en weer, de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 1 ml water aan elke buis en resuspendeer de kralen. Verzamel de kralen en verwijder het supernatant. Tweemaal Herhaal deze wasstap.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de kralen in 1 ml 10 mM CoCl 2-oplossing. Zet op een shaker voor 10 minuten.
- Verwijder de supernatant met een magneet aan de parels te verzamelen en hersuspenderen in 1 ml Binding / wasbuffer.
- Verwijder de supernatant en was de korrels twee keer met 1 ml 20% (v / v) ethanol
- Resuspenderen de korrels in hun oorspronkelijke volume van 20% (v / v) ethanol op geregenereerde korrels verkregen in een concentratie van 40 mg / ml.
6. Interpretatie van de resultaten
- Controle voorbeeld 1, waarin geen gelabeld virus werd toegevoegd, wordt gebruikt om te corrigeren voor de achtergrond radioactiviteit en de radioactiviteit 0% te stellen. Controle voorbeeld 2, die niet het nanobody en waarbij bijgevolg alle radiogelabelde virus blijft in de supernatant wordt ingesteld als 100% radioactiviteit waarde.
- Het percentage van de radioactiviteit in het supernatant (= a%) is een maat voor de totale neerslag (= 100 - in%) van het radioactief gemerkte virus de nanobody.
7. Representatieve resultaten
Representatieve resultaten voor deze affiniteit vangen assay zijn weergegeven in de figuren 2, 3 en 4. In figuur 2 is de affiniteit van PVSS38C een nanobody specifiek voor poliovirus als aangegeven. De affiniteit van PVSS38C werd getest bij drie verschillende antigenen van poliovIrus: Native-antigeen (N-antigeen), Verwarmd-antigeen (H-antigeen) en 14S subeenheden. N-antigeen intacte virus dat infectieuze. Wanneer het virus wordt verwarmd (20 minuten bij 56 ° C) of aan een vast oppervlak (niet gepubliceerde resultaten), de conformatie van de capside, resulterend in een (gedeeltelijk) verlies van het virale RNA en capside-eiwit VP4 en lege capsiden worden gevormd die genoemd H-antigenen. 14S subeenheden zijn de montage tussenproducten. Deze antigenen worden herkend door verschillende sets van antilichamen na immunisatie 10 en bezit dus verschillende epitopen en antigene plaatsen. In de figuur is het percentage radioactiviteit in het supernatant wordt als functie van de concentratie van nanobody. Het blijkt dat de radioactiviteit in het supernatant van de monsters met radioactief gemerkte 14S subeenheden afneemt met toenemende concentraties van het nanobody PVSS38C. Dit kan vertaald worden als een toename van de hoeveelheid van poliovirus 14S subeenheden conaangesloten op de nanobody PVSS38C en indirect aan de magnetische korrels. Het vastleggen van titer (= de concentratie van Nanobody nodig is om 50% van de radioactief gemerkte virus vast te leggen) kan grafisch worden berekend als 0,099 nM. Geen affiniteit van PVSS38C de N-antigene H-antigene vorm van poliovirus waargenomen. Uit deze gegevens wordt geïnterpreteerd dat PVSS38C wordt interactie met een epitoop die uitsluitend aanwezig in de 14S-subeenheid en niet op de twee andere antigene vormen van poliovirus.
Om aan te tonen dat het verlies van radioactiviteit in de supernatant alleen door de specifieke affiniteit van het nanobody naar zijn antigenen dezelfde test uitgevoerd met NB1, een Nanobody die tegen de lrpB transcriptionele regulator van Sulfolobus sulfataricus en bekende geen interactie met een poliovirus antigen. Het resultaat van deze test is in figuur 3. Alle radiogelabelde virus blijft in de supernatanten blijkt dat er geen reactiviteitNB1 tegen de drie antigene vormen van poliovirus.
Reproduceerbaarheid van de resultaten werd getest door het experiment te herhalen voor een totaal van acht keer voor een bepaald nanobody (bijvoorbeeld PVSP29F) op verschillende dagen door verschillende personen. De resultaten worden getoond in Figuur 4. De gemiddelde waarde van percentage radioactiviteit in het supernatans werd berekend voor elk nanobody concentratie en wordt in overeenstemming met de standaardafwijking.
Figuur 1. Een overzicht van het principe (A) en de werkwijze (B) van de test. A. His-gelabelde nanobodies die specifiek herkennen een bepaalde poliovirus antigeen in staat zal zijn om te communiceren met de kobalt-gecoate magnetische korrels en zal neerslaan van de radioactief gelabelde virus. B. His-gelabelde Nanobodies worden toegevoegd aan radioactief gelabelde poliovirus en geïncubeerd. Kobalt-beklede magnetische kralentoegevoegd en magnetische scheiding van gebonden / ongebonden antigeen wordt uitgevoerd. De radioactiviteit van de supernatant wordt gemeten en de hoeveelheid opgevangen antigeen kan worden afgeleid.
Figuur 2. Magnetische kralen affiniteit vangst van verschillende poliovirus antigenen door nanobody PVSS38C. Het percentage radioactiviteit in het supernatant wordt als functie van de concentratie van PVSS38C. Voor een concentratie 14S-respons te vinden, die de interactie van PVSS38C met een epitoop uitsluitend aanwezig 14S. Geen significante interactie met N-, of H-antigeen kan worden gedetecteerd, hoewel een gering aspecifieke vastleggen zeer hoge concentraties opgemerkt.
Figuur 3. Magnetische kralen affiniteit vangst van verschillende poliovirus antigenen door nanobody NB1 figuur 2 is dus alleen door de specifieke affiniteit van het nanobody naar zijn antigenen.
Figuur 4. Reproduceerbaarheid van de test. De gemiddelde waarde van percentage radioactiviteit in het supernatant wordt als functie van de concentratie van nanobody. Het experiment werd herhaald acht keer op verschillende dagen en door verschillende personen. De standaarddeviatie wordt voorgesteld als verticale balken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het protocol wordt de radioactiviteit van het antigeen interactie met de nanobody gedefinieerd als het verlies van radiogelabelde virus uit de supernatant. Daarom is de hoeveelheid neergeslagen radioactiviteit (= 100 - a%) (gebonden aan de magnetische korrels) worden geschat op een indirecte wijze de radioactiviteit in het supernatant (= a%). Anderzijds is het ook mogelijk om de radioactiviteit van het neergeslagen gebonden fractie van antigen te meten op directe wijze door elutie de immunocomplexen van de magnetische kralen 500 mM imidazool. Eerder werd aangetoond 11 dat er een perfect tussen de totale hoeveelheid radioactiviteit en de som van de radioactiviteit in supernatant en pellet fracties. Het is derhalve aanvaardbaar en tijdbesparend de radioactiviteit van het supernatans gemeten. De werkwijze voor elutie van de immunocomplexen van de magnetische kralen wordt beschreven door Thys et al.. 2011 11.
Apart van poliovirus, andere picornavirussen bekend dat gevoelig vaste oppervlak geïnduceerde conformationele conversie, zoals economisch belangrijke mond-en klauwzeervirus (MKZ) 2. De verandering van de vorm en de vermindering van bindingsaffiniteit van eiwitten in het algemeen na binding van kunststof is beschreven in de literatuur 12. De test kan derhalve worden gebruikt om de interactie tussen eiwitten die gevoelig zijn voor vormveranderingen onderzoeken voor epitoop in kaart brengen, de hoeveelheid van correct gevouwen eiwitten definieert, het screenen op structuur onzuiverheden in produktieprocessen, de snelle screening van partijen tijdens productie kan voor de zuivering van monsters die mengsels van nauw verwante eiwitten en vele andere toepassingen worden beschouwd. De beschikbaarheid van verschillende magnetische kralen met affiniteit voor de verschillende labels ondersteunt deze mogelijkheden. Hoewel radioactieve labels werden gebruikt in deze experimenten andere signalen kunnenworden toegepast voor het detecteren en kwantificeren van de interacties, zoals fluorescerende kleurstoffen 13,14. Veel monsters worden geanalyseerd in een experiment is het mogelijk om automatisch de werkwijze. De magnetische kralen die in deze assay kan gemakkelijk hergebruikt door slechts koken strippen en regeneratiestap, die maakt deze een goedkope methode. Tot op heden heeft vijf van deze regeneratiecycli van de korrels geen invloed op de reproduceerbaarheid van de resultaten (data niet getoond).
Bovendien kan worden beschouwd als een specifieke methode, aangezien Nanobodies worden alleen erkennen antigeen als konden anders reageren met poliovirus N-en H-antigenen en het 14S subeenheid.
Geconcludeerd kan worden dat deze affiniteit capture test met behulp van magnetische korrels is een test met een breed scala aan mogelijke toepassingen die betrouwbaar, eenvoudig, kwantitatieve, specifieke, tijdbesparende en goedkoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken de medewerkers van de afdeling Farmaceutische Biotechnologie en Moleculaire Biologie en in het bijzonder Monique De Pelsmacker voor de voorbereiding van de radioactief gemerkte virus. We zijn dankbaar voor Ellen Merckx en Hadewych Halewyck voor hun interessante opmerkingen en discussies en aan Gerrit De Bleeser voor zijn hulp in het lab. Dit werk werd financieel ondersteund door een OZR toekenning van de Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) en de World Health Organization (TSA 200.410.791). Lise Schotte is een predoctorale fellow van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. The Immunoassay Handbook. , Third edition, Elsevier. (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
